Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie
Mgr. Jakub Neradil, Ph.D.
Ústav experimentální biologie PřF MU
DIFERENCIACE BUNĚK
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 08 / 13.4.
• diferenciační potenciál buněk
• diferenciační dráhy
• růstové faktory
• indukovaná diferenciace
Program přednášky:
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 08 / 13.4.
Vývoj mnohobuněčného organismu
• identický genom ve všech buňkách
• kontrola na úrovni genové exprese
1. buněčná proliferace
2. diferenciace buněk
3. buněčné interakce
4. pohyb buněk
5. buněčná smrt
Lidský organismus:
1 zygota → 1011 buněk (250 různých typů)
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 08 / 13.4.
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 08 / 13.4.
DIFERENCIAČNÍ POTENCIÁL BUNĚK
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 08 / 13.4.
Časná embryogeneze u savců:
• zygota
• morula (8, resp. 16 buněk = blastomery)
• blastocysta (~ 64 buněk)
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 08 / 13.4.
Blastocysta:
• trofoektoderm →
extraembryonální tkáně (placenta)
• inner cell mass (ICM) →
embryo
Gastrulace → 3 zárodečné listy:
• ektoderm (neurální a epidermální buňky)
• mesoderm (svalová a pojivová tkáň)
• endoderm (epitel vnitřních orgánů)
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 08 / 13.4.
Ektoderm
• CNS
• sítnice a čočky
• lebeční a senzorická ganglia a nervy
• pigmentové buňky
• pojivová tkáň hlavy
• epidermis
• vlasy, ochlupení
• prsní žlázy
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 08 / 13.4.
Mesoderm
• lebka a kostra
• svalová tkáň (lebka i kosterní svalstvo)
• dermis
• pojivová tkáň
• urogenitální systém
• střevní svalovina
• srdce
• krevní a lymfatické buňky
• slezina
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 08 / 13.4.
Endoderm
• žaludek
• tračník
• játra
• slinivka
• močový měchýř
• epiteliální výstelka průdušnice, plic, hltanu,
štítné žlázy, střev
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 08 / 13.4.
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 08 / 13.4.
Totipotence
• nelimitovaný diferenciační potenciál
• schopnost tvořit embryonální i extraembryonální
tkáně
• časná stádia rýhování zygoty (1-4 dny)
Pluripotence
• schopnost tvořit buňky všech 3 zárodečných listů
• buňky ICM (embryonální kmenové buňky, 5-
14dní)
Multipotence
• schopnost tvořit buňky příslušného typu tkáně
• např. hematopoetické kmenové buňky,
neuronální kmenové buňky…
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 08 / 13.4.
totipotentní buňka
pluripotentní buňky
(embryonální kmenové)
multipotentní buňky
(hematopetické kmenové)
progenitorové buňky
terminálně diferencované
buňky
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 08 / 13.4.
Rozdíl v diferenciačním
potenciálu kmenových
a progenitorových
buněk
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 08 / 13.4.
Eukaryontní buňka:
• 5000 různých bílkovin (109 - 1010 molekul)
• každý buněčný typ vytváří asi 100 specifických
proteinů
• housekeeping genes:
exprimovány konstitutivně na relativně nízké
úrovni ve všech buňkách organismu
• housekeeping proteins:
esenciální metabolické enzymy, buněčné
komponenty
• exprese různých genů závisí na typu buňky, fázi
buněčného cyklu atd.
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 08 / 13.4.
Příčiny diferenciace:
• postupné změny v aktivitě genů
(programovány v genomu)
• odpověď na molekulární signály vysílané
ostatními buňkami
• odpověď na fyzikální kontakt s ostatními buňkami
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 08 / 13.4.
Signály regulující diferenciaci
Solubilní regulátory
• Hormony (glukagon, hydrokortison, tyroxin,…)
• Růstové faktory (TGF-transformující růstový faktor,
FGF-fibroblastový růstový faktor, interleukiny, …)
• Vitaminy (D, A …)
• Ionty (Ca2+, …)
Fyzické kontakty mezi buňkami (gap junctions)
Kontakt buněk s mezibuněčnou matrix (kolagen, laminin, …)
Polarita a tvar buněk
Fyzikální parametry prostředí (teplota, parciální tlak O2, …)
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 08 / 13.4.
Molekulární mechanismy diferenciace
• nejdůležitějším místem regulace je iniciace
transkripce
• vazba regulačních proteinů na specifické
sekvence DNA (regulační oblasti)
• relativně malý počet strukturních motivů
• 2 základní mechanismy účinku regulačních
proteinů:
a) ovlivnění vazby RNA polymerázy a
transkripčních faktorů na promotor
b) lokální modifikace struktury chromatinu v
oblasti promotoru
• kombinace regulačních proteinů
• tkáňová specifita
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 08 / 13.4.
1. vazba na jaderné receptory (RAR, RXR)
2. vazba komplexu na regulační oblast (RARE)
3. aktivace transkripce
Kyselina retinová (RA) jako modelový
induktor diferenciace (a morfogeneze)
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 08 / 13.4.
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 08 / 13.4.
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 08 / 13.4.
DIFERENCIAČNÍ DRÁHY
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 08 / 13.4.
Diferenciace - buňky směřovány do určitého vývojového
směru (linie) – tento stav nelze měnit
(například buňky erytroidní linie „nepřeskočí“ do linie
myeloidní
Dediferenciace - ztráta diferencovaného fenotypu
• je obvyklá in vitro (adaptace na kultivační podmínky)
• existence dediferenciace in vivo je předmětem výzkumu
(stejně jako transdiferenciace)
Transdiferenciace - schopnost určitých buněk určité tkáně
(včetně SCs nebo progenitorů) diferencovat do buněk
typických pro jiné orgány nebo tkáně (např.
hematopoetické)
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 08 / 13.4.
Diferenciační
potenciál
hematopoetických
kmenových buněk
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 08 / 13.4.
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 08 / 13.4.
Diferenciace
krevních
buněk
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 08 / 13.4.
Porucha diferenciace krevních buněk
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 08 / 13.4.
Průběh neuronální diferenciace
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 08 / 13.4.
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 08 / 13.4.
Neuronální diferenciace
Kmenová buňka:
• nestin
• GFAP
• DNA
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 08 / 13.4.
Neuronální
diferenciace
Progenitorová
buňka:
• β-tubulin III
• GFAP
• DNA
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 08 / 13.4.
Neuronální diferenciace
Neurony:
• β-tubulin III
• DNA
Gliové buňky:
• GFAP
• DNA
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 08 / 13.4.
RŮSTOVÉ FAKTORY
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 08 / 13.4.
Růstové faktory (Growth Factors)
• vazba na příslušný membránový receptor
• aktivace specifické intracelulární signální dráhy
• stimulace přežívání a růstu buněk
(metabolismus, zvyšování objemu)
• některé fungují i jako mitogeny (např. PDGF),
resp. induktory diferenciace
• např. cytokiny, hormony (insulin)
Cytokiny
• molekuly ovlivňující buněčnou proliferaci
(G-CSF, GM-CSF vs. Fas-liganda)
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 08 / 13.4.
EGF (Epidermal Growth Factor)
• specifická vazba na EGFR (Epidermal Growth
Factor Receptor) → aktivace RTK kaskády
FGF Family (Fibroblast Growth Factor)
• 22 molekul
• FGF2 = bFGF (basic fibroblast growth factor)
• receptory FGFR1-4
VEGF (Vascular Endothelial Growth Factor)
• stimulace vaskulárních endotelií → angiogeneze
• v případě hypoxie - exprese HIF ->VEGF
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 08 / 13.4.
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 08 / 13.4.
TGF (Transforming Growth Factor)
• up-regulace u některých typů nádorů
• schopnost indukovat nádorovou transformaci v
podmínkách in vitro (krysí fibroblasty ledvin)
• TGF-α (makrofágy, mozkové buňky, keratinocyty):
vývoj epitelu - příbuznost s EGF, vazba na EGFR
• TGF-β - isoformy β1, β2, β3: diferenciace buněk,
vývoj embrya, regenerace tkání, regulace
imunitního systému
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 08 / 13.4.
Neurotrofiny (Neurotrophins)
• produkovány cílovou tkání → přežívání neuronů,
neuronální diferenciace
• receptory:
p75, Trk receptory (A,B,C)
• NGF (nerve growth factor)
• BDNF (brain-derived
neutrophic factor)
• NT-3 (neutrophin-3)
• NT-4 (neutrophin-4)
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 08 / 13.4.
Pleiotropní efekt BDNF
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 08 / 13.4.
BDNF-indukovaná neovaskularizace
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 08 / 13.4.
EPO (Erythropoietin)
• produkce v ledvinách
• stimulace tvorby erytrocytů
• rekombinantní EPO
TPO (Thrombopoietin)
• produkce ve slezině a v ledvinách
• stimulace tvorby megakaryocytů, krevních destiček
G-CSF (Granulocyte Colony Stimulating Factor)
• stimulace tvorby granulocytů/neutrofilů
GM-CSF (Granulocyte Macrophage Colony
Stimulating Factor)
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 08 / 13.4.
RECEPTOROVÉ TYROZIN-KINÁZY
funkce: regulace proliferace, diferenciace, metabolismu, aj.
genom: 59 genů → 20 receptorových rodin (+alternativní sestřih)
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 08 / 13.4.
DOMÉNY :
• extracelulární (receptorová)
• transmembránová
• cytoplasmatická (tyrozin kinázová)
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 08 / 13.4.
AKTIVACE:
dimerizace vlivem růstových faktorů → cross-fosforylace
a) → konformační změna – stimulace katalytické aktivity
b) → tvorba vazebných míst pro domény adaptorových
proteinů (Grb-2)
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 08 / 13.4.
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 08 / 13.4.
INDUKOVANÁ DIFERENCIACE
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 08 / 13.4.
Indukovaná diferenciace
• induktory diferenciace (růstové faktory, vitamíny,
inhibitory kináz, změny v kultivaci, syntetické látky…)
• indukce příslušné diferenciační dráhy
• inhibice signálních drah pro „self-renewal“
Příklady induktorů diferenciace in vitro:
• kyselina all-trans retinová (ATRA)
• 1α,25-dihydroxycholekalciferol (1,25(OH)2-D3)
• phorbol myristylacetát (PMA)
• trichostatin
• dimethylsulfoxid (DMSO)
• SU5402 (inhibitor FGFR1)
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 08 / 13.4.
Linie HL-60:
• induktory granulocytární diferenciace:
kyselina all-trans retinová (atRA)
dimethylsulfoxid (DMSO)
• induktory monocyto/makrofágové diferenciace:
phorbolmyristyl acetát (PMA)
1,25-dihydroxyvitamin D3
• lidská myeloidní leukémie
• spontánní diferenciace:
asi 10 % buněk populace
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 08 / 13.4.
Diferenciace linie HL-60 do stádia granulocytů:
Induktor: 1µM kyselina all-trans retinová
Marker: CD-66b (CD-67)
Detekce: anti-CD66b, SwAM-FITC
18,26%
33,25% 33,28%
Granulocytární diferenciace HL-60: flow cytometrie / CD66b
1µM ATRA 1µM ATRA + 13µM CA 1µM ATRA + 52µM CA
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 08 / 13.4.
Diferenciace linie HL-60 do stádia makrofágů:
Induktor: 1,6 nM phorbolmyristyl acetát (PMA)
Marker: CD-14
Detekce: anti-CD14, SwAM-FITC
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 08 / 13.4.
Linie P19:
• myší embryonální karcinom
• 7denní embryo do testes
• „embryoid bodies“ (EB)
• induktory mesodermální diferenciace:
kyselina all-trans retinová (atRA)
dimethylsulfoxid (DMSO)
• induktor neuronální diferenciace:
kyselina all-trans retinová (atRA)
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 08 / 13.4.
Schéma diferenciace buněk P19
metoda kultivace na
bakteriologických miskách
metoda „visících kapek“
Mesodermální diferenciace buněk P19:
Induktor: 0,8% DMSO
Marker: myosin
Detekce: anti-skeletal myosin, SwAM-FITC
50 µm 100 µm
160 µm 50 µm
ATRA – 1.den DMSO – 2.den
ATRA – 4.den DMSO – 4.den
Neuronální diferenciace buněk P19:
Induktor: 1µM kyselina all-trans retinová (ATRA)
Marker: neurofilamin
Detekce: anti-neurofilament 160, SwAM-FITC
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 08 / 13.4.
Praktické využití indukované diferenciace:
• základní výzkum
• diferenciační terapie v onkologii
→ hematologické malignity (APL, AML)
→ vybrané typy solidních nádorů (neuroblastom)
• diferenciační terapie v dermatologii
→ akné
• příprava buněčných derivátů in vitro
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 08 / 13.4.
Retinoidy jako induktory diferenciace v klinické praxi:
Roaccutane
(isotretinoin, 13-cis-RA)
• akné, neuroblastom
Vesanoid
(tretinoin, all-trans-RA)
• akutní leukemie
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 08 / 13.4.
COMBAT
léčba solidních nádorů (meduloblastom , neuroblastom, sarkomy...)
celecoxib inhibitor cyclooxygenázy antiangiogenní účinek
etoposid inhibitor topomerázy II zástava b. cyklu
temozolomid alkylační činidlo apoptóza
kys. retinová diferenciační činidlo diferenciace/apoptóza