1
Bi8120 A lik á b ěč á bi l iBi8120 A lik á b ěč á bi l iBi8120 Aplikovaná buněčná biologieBi8120 Aplikovaná buněčná biologie
DIFERENCIACE BUNĚKDIFERENCIACE BUNĚKDIFERENCIACE BUNĚKDIFERENCIACE BUNĚK
Mgr. Jakub Neradil, Ph.D.
Ústav experimentální biologie PřF MU
Mgr. Jakub Neradil, Ph.D.
Ústav experimentální biologie PřF MUÚstav experimentální biologie PřF MUÚstav experimentální biologie PřF MU
2
Program přednášky:Program přednášky:
• diferenciační potenciál buněk
dif i č í d áh
• diferenciační potenciál buněk
dif i č í d áh• diferenciační dráhy
• růstové faktory
• diferenciační dráhy
• růstové faktory
• indukovaná diferenciace• indukovaná diferenciace
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 08 / 13.4.Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 08 / 13.4.
3
Vývoj mnohobuněčného organismuVývoj mnohobuněčného organismu
• identický genom ve všech buňkách
• kontrola na úrovni genové exprese
• identický genom ve všech buňkách
• kontrola na úrovni genové exprese• kontrola na úrovni genové exprese
1. buněčná proliferace
• kontrola na úrovni genové exprese
1. buněčná proliferace1. buněčná proliferace
2. diferenciace buněk
3. buněčné interakce
1. buněčná proliferace
2. diferenciace buněk
3. buněčné interakce
4. pohyb buněk
5. buněčná smrt
4. pohyb buněk
5. buněčná smrt
Lidský organismus:
1 t 1011 b ěk (250 ů ý h t ů)
Lidský organismus:
1 t 1011 b ěk (250 ů ý h t ů)
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 08 / 13.4.Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 08 / 13.4.
1 zygota → 1011 buněk (250 různých typů)1 zygota → 1011 buněk (250 různých typů)
4
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 08 / 13.4.Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 08 / 13.4.
5
DIFERENCIAČNÍ POTENCIÁL BUNĚKDIFERENCIAČNÍ POTENCIÁL BUNĚKDIFERENCIAČNÍ POTENCIÁL BUNĚKDIFERENCIAČNÍ POTENCIÁL BUNĚK
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 08 / 13.4.Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 08 / 13.4.
6
Časná embryogeneze u savců:Časná embryogeneze u savců:y g
• zygota
• morula (8, resp. 16 buněk = blastomery)
y g
• zygota
• morula (8, resp. 16 buněk = blastomery)
• blastocysta (~ 64 buněk)• blastocysta (~ 64 buněk)
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 08 / 13.4.Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 08 / 13.4.
7
Blastocysta:
• trofoektoderm →
Blastocysta:
• trofoektoderm →
extraembryonální tkáně (placenta)
• inner cell mass (ICM) →
b
extraembryonální tkáně (placenta)
• inner cell mass (ICM) →
bembryo
Gastrulace 3 zárodečné listy:
embryo
Gastrulace 3 zárodečné listy:Gastrulace → 3 zárodečné listy:
• ektoderm (neurální a epidermální buňky)
• mesoderm (svalová a pojivová tkáň)
Gastrulace → 3 zárodečné listy:
• ektoderm (neurální a epidermální buňky)
• mesoderm (svalová a pojivová tkáň)mesoderm (svalová a pojivová tkáň)
• endoderm (epitel vnitřních orgánů)
mesoderm (svalová a pojivová tkáň)
• endoderm (epitel vnitřních orgánů)
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 08 / 13.4.Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 08 / 13.4.
8
Ektoderm
• CNS
ít i č čk
Ektoderm
• CNS
ít i č čk• sítnice a čočky
• lebeční a senzorická ganglia a nervy
pigmento é b ňk
• sítnice a čočky
• lebeční a senzorická ganglia a nervy
pigmento é b ňk• pigmentové buňky
• pojivová tkáň hlavy
• epidermis
• pigmentové buňky
• pojivová tkáň hlavy
• epidermis• epidermis
• vlasy, ochlupení
• prsní žlázy
• epidermis
• vlasy, ochlupení
• prsní žlázy• prsní žlázy• prsní žlázy
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 08 / 13.4.Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 08 / 13.4.
9
Mesoderm
• lebka a kostra
l á tkáň (l bk i k t í l t )
Mesoderm
• lebka a kostra
l á tkáň (l bk i k t í l t )• svalová tkáň (lebka i kosterní svalstvo)
• dermis
poji o á tkáň
• svalová tkáň (lebka i kosterní svalstvo)
• dermis
poji o á tkáň• pojivová tkáň
• urogenitální systém
• střevní svalovina
• pojivová tkáň
• urogenitální systém
• střevní svalovina• střevní svalovina
• srdce
• krevní a lymfatické buňky
• střevní svalovina
• srdce
• krevní a lymfatické buňky• krevní a lymfatické buňky
• slezina
• krevní a lymfatické buňky
• slezina
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 08 / 13.4.Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 08 / 13.4.
10
Endoderm
• žaludek
Endoderm
• žaludek• žaludek
• tračník
játra
• žaludek
• tračník
játra• játra
• slinivka
č ý ě hýř
• játra
• slinivka
č ý ě hýř• močový měchýř
• epiteliální výstelka průdušnice, plic, hltanu,
štítné žlázy střev
• močový měchýř
• epiteliální výstelka průdušnice, plic, hltanu,
štítné žlázy střevštítné žlázy, střevštítné žlázy, střev
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 08 / 13.4.Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 08 / 13.4.
11
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 08 / 13.4.Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 08 / 13.4.
12
Totipotence
• nelimitovaný diferenciační potenciál
Totipotence
• nelimitovaný diferenciační potenciál• nelimitovaný diferenciační potenciál
• schopnost tvořit embryonální i extraembryonální
tkáně
• nelimitovaný diferenciační potenciál
• schopnost tvořit embryonální i extraembryonální
tkáně
• časná stádia rýhování zygoty (1-4 dny)
Pluripotence
• časná stádia rýhování zygoty (1-4 dny)
PluripotencePluripotence
• schopnost tvořit buňky všech 3 zárodečných listů
• buňky ICM (embryonální kmenové buňky, 5-
Pluripotence
• schopnost tvořit buňky všech 3 zárodečných listů
• buňky ICM (embryonální kmenové buňky, 5-
14dní)
Multipotence
14dní)
Multipotence
• schopnost tvořit buňky příslušného typu tkáně
• např. hematopoetické kmenové buňky,
neuronální kmenové buňky
• schopnost tvořit buňky příslušného typu tkáně
• např. hematopoetické kmenové buňky,
neuronální kmenové buňky
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 08 / 13.4.Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 08 / 13.4.
neuronální kmenové buňky…neuronální kmenové buňky…
13
totipotentní buňkatotipotentní buňka
pluripotentní buňky
(embryonální kmenové)
pluripotentní buňky
(embryonální kmenové)
multipotentní buňky
(hematopetické kmenové)
multipotentní buňky
(hematopetické kmenové)(hematopetické kmenové)(hematopetické kmenové)
progenitorové buňkyprogenitorové buňky
terminálně diferencovanéterminálně diferencovanéterminálně diferencované
buňky
terminálně diferencované
buňky
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 08 / 13.4.Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 08 / 13.4.
14
Rozdíl v diferenciačním
potenciálu kmenových
Rozdíl v diferenciačním
potenciálu kmenovýchpo e c á u e o ýc
a progenitorových
buněk
po e c á u e o ýc
a progenitorových
buněk
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 08 / 13.4.Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 08 / 13.4.
15
Eukaryontní buňka:
• 5000 různých bílkovin (109 - 1010 molekul)
Eukaryontní buňka:
• 5000 různých bílkovin (109 - 1010 molekul)5000 různých bílkovin (10 10 molekul)
• každý buněčný typ vytváří asi 100 specifických
proteinů
5000 různých bílkovin (10 10 molekul)
• každý buněčný typ vytváří asi 100 specifických
proteinů
• housekeeping genes:
exprimovány konstitutivně na relativně nízké
• housekeeping genes:
exprimovány konstitutivně na relativně nízké
úrovni ve všech buňkách organismu
• housekeeping proteins:
úrovni ve všech buňkách organismu
• housekeeping proteins:housekeeping proteins:
esenciální metabolické enzymy, buněčné
komponenty
housekeeping proteins:
esenciální metabolické enzymy, buněčné
komponenty
• exprese různých genů závisí na typu buňky, fázi
buněčného cyklu atd.
• exprese různých genů závisí na typu buňky, fázi
buněčného cyklu atd.
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 08 / 13.4.Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 08 / 13.4.
16
Příčiny diferenciace:Příčiny diferenciace:
• postupné změny v aktivitě genů
(programovány v genomu)
• postupné změny v aktivitě genů
(programovány v genomu)(programovány v genomu)
• odpověď na molekulární signály vysílané
ostatními buňkami
(programovány v genomu)
• odpověď na molekulární signály vysílané
ostatními buňkamiostatními buňkami
• odpověď na fyzikální kontakt s ostatními buňkami
ostatními buňkami
• odpověď na fyzikální kontakt s ostatními buňkami
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 08 / 13.4.Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 08 / 13.4.
17
Signály regulující diferenciaci
Solubilní regulátory
• Hormony (glukagon, hydrokortison, tyroxin,…)
Růsto é fakto (TGF t ansfo m jící ůsto ý fakto• Růstové faktory (TGF-transformující růstový faktor,
FGF-fibroblastový růstový faktor, interleukiny, …)
• Vitaminy (D, A …)
• Ionty (Ca2+ )• Ionty (Ca , …)
Fyzické kontakty mezi buňkami (gap junctions)
Kontakt buněk s mezibuněčnou matrix (kolagen, laminin, …)
Polarita a tvar buněkPolarita a tvar buněk
Fyzikální parametry prostředí (teplota, parciální tlak O2, …)
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 08 / 13.4.Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 08 / 13.4.
18
Molekulární mechanismy diferenciace
• nejdůležitějším místem regulace je iniciace
Molekulární mechanismy diferenciace
• nejdůležitějším místem regulace je iniciacenejdůležitějším místem regulace je iniciace
transkripce
• vazba regulačních proteinů na specifické
k DNA ( l č í bl ti)
nejdůležitějším místem regulace je iniciace
transkripce
• vazba regulačních proteinů na specifické
k DNA ( l č í bl ti)sekvence DNA (regulační oblasti)
• relativně malý počet strukturních motivů
• 2 základní mechanismy účinku regulačních
sekvence DNA (regulační oblasti)
• relativně malý počet strukturních motivů
• 2 základní mechanismy účinku regulačních• 2 základní mechanismy účinku regulačních
proteinů:
a) ovlivnění vazby RNA polymerázy a
• 2 základní mechanismy účinku regulačních
proteinů:
a) ovlivnění vazby RNA polymerázy aa) o ě a by po y e á y a
transkripčních faktorů na promotor
b) lokální modifikace struktury chromatinu v
oblasti promotoru
a) o ě a by po y e á y a
transkripčních faktorů na promotor
b) lokální modifikace struktury chromatinu v
oblasti promotoruoblasti promotoru
• kombinace regulačních proteinů
• tkáňová specifita
oblasti promotoru
• kombinace regulačních proteinů
• tkáňová specifita
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 08 / 13.4.Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 08 / 13.4.
• tkáňová specifita• tkáňová specifita
19
Kyselina retinová (RA) jako modelový
induktor diferenciace (a morfogeneze)
Kyselina retinová (RA) jako modelový
induktor diferenciace (a morfogeneze)induktor diferenciace (a morfogeneze)induktor diferenciace (a morfogeneze)
1. vazba na jaderné receptory (RAR, RXR)
2. vazba komplexu na regulační oblast (RARE)
3 aktivace transkripce
1. vazba na jaderné receptory (RAR, RXR)
2. vazba komplexu na regulační oblast (RARE)
3 aktivace transkripce
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 08 / 13.4.Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 08 / 13.4.
3. aktivace transkripce3. aktivace transkripce
20
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 08 / 13.4.Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 08 / 13.4.
21
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 08 / 13.4.Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 08 / 13.4.
22
DIFERENCIAČNÍ DRÁHYDIFERENCIAČNÍ DRÁHYDIFERENCIAČNÍ DRÁHYDIFERENCIAČNÍ DRÁHY
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 08 / 13.4.Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 08 / 13.4.
23
Diferenciace - buňky směřovány do určitého vývojovéhoy y ý j
směru (linie) – tento stav nelze měnit
(například buňky erytroidní linie „nepřeskočí“ do linie
myeloidnímyeloidní
Dediferenciace - ztráta diferencovaného fenotypu
á ( č í í )• je obvyklá in vitro (adaptace na kultivační podmínky)
• existence dediferenciace in vivo je předmětem výzkumu
(stejně jako transdiferenciace)( j j )
Transdiferenciace - schopnost určitých buněk určité tkáně
(včetně SCs nebo progenitorů) diferencovat do buněk(včetně SCs nebo progenitorů) diferencovat do buněk
typických pro jiné orgány nebo tkáně (např.
hematopoetické)
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 08 / 13.4.Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 08 / 13.4.
24
Diferenciační
potenciál
Diferenciační
potenciál
hematopoetických
kmenových buněk
hematopoetických
kmenových buněk
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 08 / 13.4.Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 08 / 13.4.
25
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 08 / 13.4.Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 08 / 13.4.
26
Diferenciace
krevních
b ěk
Diferenciace
krevních
b ěkbuněkbuněk
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 08 / 13.4.Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 08 / 13.4.
27
Porucha diferenciace krevních buněk
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 08 / 13.4.Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 08 / 13.4.
28
Průběh neuronální diferenciacePrůběh neuronální diferenciace
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 08 / 13.4.Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 08 / 13.4.
29
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 08 / 13.4.Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 08 / 13.4.
30
Neuronální diferenciace
Kmenová buňka:
Neuronální diferenciace
Kmenová buňka:Kmenová buňka:
• nestin
• GFAP
Kmenová buňka:
• nestin
• GFAP
• DNA• DNA
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 08 / 13.4.Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 08 / 13.4.
31
Neuronální
diferenciace
Neuronální
diferenciaced e e c ace
Progenitorová
buňka:
 t b li III
d e e c ace
Progenitorová
buňka:
 t b li III• -tubulin III
• GFAP
• DNA
• -tubulin III
• GFAP
• DNADNADNA
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 08 / 13.4.Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 08 / 13.4.
32
Neuronální diferenciace
Neurony:
Neuronální diferenciace
Neurony:Neurony:
• -tubulin III
• DNA
Neurony:
• -tubulin III
• DNADNA
Gliové buňky:
• GFAP
DNA
Gliové buňky:
• GFAP
• DNA• DNA
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 08 / 13.4.Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 08 / 13.4.
33
RŮSTOVÉ FAKTORYRŮSTOVÉ FAKTORYRŮSTOVÉ FAKTORYRŮSTOVÉ FAKTORY
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 08 / 13.4.Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 08 / 13.4.
34
Růstové faktory (Growth Factors)Růstové faktory (Growth Factors)
• vazba na příslušný membránový receptor
• aktivace specifické intracelulární signální dráhy
ží á í ů
• vazba na příslušný membránový receptor
• aktivace specifické intracelulární signální dráhy
ží á í ů• stimulace přežívání a růstu buněk
(metabolismus, zvyšování objemu)
• některé fungují i jako mitogeny (např PDGF)
• stimulace přežívání a růstu buněk
(metabolismus, zvyšování objemu)
• některé fungují i jako mitogeny (např PDGF)• některé fungují i jako mitogeny (např. PDGF),
resp. induktory diferenciace
• např. cytokiny, hormony (insulin)
• některé fungují i jako mitogeny (např. PDGF),
resp. induktory diferenciace
• např. cytokiny, hormony (insulin)
CytokinyCytokiny
• molekuly ovlivňující buněčnou proliferaci
(G-CSF, GM-CSF vs. Fas-liganda)
• molekuly ovlivňující buněčnou proliferaci
(G-CSF, GM-CSF vs. Fas-liganda)
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 08 / 13.4.Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 08 / 13.4.
35
EGF (Epidermal Growth Factor)EGF (Epidermal Growth Factor)EGF (Epidermal Growth Factor)
• specifická vazba na EGFR (Epidermal Growth
Factor Receptor) → aktivace RTK kaskády
EGF (Epidermal Growth Factor)
• specifická vazba na EGFR (Epidermal Growth
Factor Receptor) → aktivace RTK kaskádyFactor Receptor) → aktivace RTK kaskády
FGF Family (Fibroblast Growth Factor)
22 l k l
Factor Receptor) → aktivace RTK kaskády
FGF Family (Fibroblast Growth Factor)
22 l k l• 22 molekul
• FGF2 = bFGF (basic fibroblast growth factor)
• receptory FGFR1 4
• 22 molekul
• FGF2 = bFGF (basic fibroblast growth factor)
• receptory FGFR1 4• receptory FGFR1-4
VEGF (Vascular Endothelial Growth Factor)
• receptory FGFR1-4
VEGF (Vascular Endothelial Growth Factor)
• stimulace vaskulárních endotelií → angiogeneze
• v případě hypoxie - exprese HIF ->VEGF
• stimulace vaskulárních endotelií → angiogeneze
• v případě hypoxie - exprese HIF ->VEGF
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 08 / 13.4.Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 08 / 13.4.
36
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 08 / 13.4.Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 08 / 13.4.
37
TGF (Transforming Growth Factor)TGF (Transforming Growth Factor)TGF (Transforming Growth Factor)
• up-regulace u některých typů nádorů
TGF (Transforming Growth Factor)
• up-regulace u některých typů nádorů
• schopnost indukovat nádorovou transformaci v
podmínkách in vitro (krysí fibroblasty ledvin)
TGF ( k fá k é b ňk k ti t )
• schopnost indukovat nádorovou transformaci v
podmínkách in vitro (krysí fibroblasty ledvin)
TGF ( k fá k é b ňk k ti t )• TGF- (makrofágy, mozkové buňky, keratinocyty):
vývoj epitelu - příbuznost s EGF, vazba na EGFR
TGF  i f 1 2 3 dif i b ěk
• TGF- (makrofágy, mozkové buňky, keratinocyty):
vývoj epitelu - příbuznost s EGF, vazba na EGFR
TGF  i f 1 2 3 dif i b ěk• TGF- - isoformy 1, 2, 3: diferenciace buněk,
vývoj embrya, regenerace tkání, regulace
imunitního systému
• TGF- - isoformy 1, 2, 3: diferenciace buněk,
vývoj embrya, regenerace tkání, regulace
imunitního systémuyy
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 08 / 13.4.Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 08 / 13.4.
38
Neurotrofiny (Neurotrophins)Neurotrofiny (Neurotrophins)
• produkovány cílovou tkání → přežívání neuronů,
neuronální diferenciace
• produkovány cílovou tkání → přežívání neuronů,
neuronální diferenciace
• receptory:
p75, Trk receptory (A,B,C)
• receptory:
p75, Trk receptory (A,B,C)
• NGF (nerve growth factor)
• BDNF (brain-derived
• NGF (nerve growth factor)
• BDNF (brain-derivedBDNF (brain derived
neutrophic factor)
NT 3 ( t hi 3)
BDNF (brain derived
neutrophic factor)
NT 3 ( t hi 3)• NT-3 (neutrophin-3)
• NT-4 (neutrophin-4)
• NT-3 (neutrophin-3)
• NT-4 (neutrophin-4)
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 08 / 13.4.Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 08 / 13.4.
39
Pleiotropní efekt BDNFPleiotropní efekt BDNF
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 08 / 13.4.Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 08 / 13.4.
40
BDNF-indukovaná neovaskularizaceBDNF-indukovaná neovaskularizace
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 08 / 13.4.Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 08 / 13.4.
41
EPO (Erythropoietin)
á
EPO (Erythropoietin)
á• produkce v ledvinách
• stimulace tvorby erytrocytů
rekombinantní EPO
• produkce v ledvinách
• stimulace tvorby erytrocytů
rekombinantní EPO• rekombinantní EPO
TPO (Thrombopoietin)
d k l i ě l d i á h
• rekombinantní EPO
TPO (Thrombopoietin)
d k l i ě l d i á h• produkce ve slezině a v ledvinách
• stimulace tvorby megakaryocytů, krevních destiček
• produkce ve slezině a v ledvinách
• stimulace tvorby megakaryocytů, krevních destiček
G-CSF (Granulocyte Colony Stimulating Factor)
• stimulace tvorby granulocytů/neutrofilů
G-CSF (Granulocyte Colony Stimulating Factor)
• stimulace tvorby granulocytů/neutrofilů
GM-CSF (Granulocyte Macrophage Colony
Stimulating Factor)
GM-CSF (Granulocyte Macrophage Colony
Stimulating Factor)
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 08 / 13.4.Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 08 / 13.4.
42
RECEPTOROVÉ TYROZIN-KINÁZY
funkce: regulace proliferace, diferenciace, metabolismu, aj.
genom: 59 genů → 20 receptorových rodin (+alternativní sestřih)
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 08 / 13.4.Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 08 / 13.4.
43
DOMÉNY :
• extracelulární (receptorová)
• transmembránovátransmembránová
• cytoplasmatická (tyrozin kinázová)
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 08 / 13.4.Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 08 / 13.4.
44
AKTIVACE:
dimerizace vlivem růstových faktorů → cross-fosforylace
a) → konformační změna – stimulace katalytické aktivity
b) → tvorba vazebných míst pro domény adaptorových
proteinů (Grb-2)proteinů (Grb 2)
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 08 / 13.4.Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 08 / 13.4.
45
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 08 / 13.4.Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 08 / 13.4.
46
INDUKOVANÁ DIFERENCIACEINDUKOVANÁ DIFERENCIACEINDUKOVANÁ DIFERENCIACEINDUKOVANÁ DIFERENCIACE
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 08 / 13.4.Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 08 / 13.4.
47
Indukovaná diferenciace
• induktory diferenciace (růstové faktory, vitamíny,
Indukovaná diferenciace
• induktory diferenciace (růstové faktory, vitamíny,induktory diferenciace (růstové faktory, vitamíny,
inhibitory kináz, změny v kultivaci, syntetické látky…)
• indukce příslušné diferenciační dráhy
induktory diferenciace (růstové faktory, vitamíny,
inhibitory kináz, změny v kultivaci, syntetické látky…)
• indukce příslušné diferenciační dráhy
• inhibice signálních drah pro „self-renewal“
Příkl d i d kt ů dif i i it
• inhibice signálních drah pro „self-renewal“
Příkl d i d kt ů dif i i itPříklady induktorů diferenciace in vitro:
• kyselina all-trans retinová (ATRA)
• 1 25 dihydroxycholekalciferol (1 25(OH) D )
Příklady induktorů diferenciace in vitro:
• kyselina all-trans retinová (ATRA)
• 1 25 dihydroxycholekalciferol (1 25(OH) D )• 1,25-dihydroxycholekalciferol (1,25(OH)2-D3)
• phorbol myristylacetát (PMA)
• trichostatin
• 1,25-dihydroxycholekalciferol (1,25(OH)2-D3)
• phorbol myristylacetát (PMA)
• trichostatintrichostatin
• dimethylsulfoxid (DMSO)
• SU5402 (inhibitor FGFR1)
trichostatin
• dimethylsulfoxid (DMSO)
• SU5402 (inhibitor FGFR1)
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 08 / 13.4.Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 08 / 13.4.
( )( )
48
Linie HL-60:Linie HL-60:
• lidská myeloidní leukémie
• spontánní diferenciace:
• lidská myeloidní leukémie
• spontánní diferenciace:• spontánní diferenciace:
asi 10 % buněk populace
• spontánní diferenciace:
asi 10 % buněk populace
• induktory granulocytární diferenciace:
kyselina all trans retinová (atRA)
• induktory granulocytární diferenciace:
kyselina all trans retinová (atRA)kyselina all-trans retinová (atRA)
dimethylsulfoxid (DMSO)
• induktory monocyto/makrofágové diferenciace:
kyselina all-trans retinová (atRA)
dimethylsulfoxid (DMSO)
• induktory monocyto/makrofágové diferenciace:• induktory monocyto/makrofágové diferenciace:
phorbolmyristyl acetát (PMA)
1 25-dihydroxyvitamin D
• induktory monocyto/makrofágové diferenciace:
phorbolmyristyl acetát (PMA)
1 25-dihydroxyvitamin D
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 08 / 13.4.Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 08 / 13.4.
1,25-dihydroxyvitamin D31,25-dihydroxyvitamin D3
49
Diferenciace linie HL-60 do stádia granulocytů:Diferenciace linie HL-60 do stádia granulocytů:
Induktor: 1M kyselina all-trans retinová
Marker: CD-66b (CD-67)
Induktor: 1M kyselina all-trans retinová
Marker: CD-66b (CD-67)Marker: CD 66b (CD 67)
Detekce: anti-CD66b, SwAM-FITC
Marker: CD 66b (CD 67)
Detekce: anti-CD66b, SwAM-FITC
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 08 / 13.4.Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 08 / 13.4.
50
Granulocytární diferenciace HL-60: flow cytometrie / CD66bGranulocytární diferenciace HL-60: flow cytometrie / CD66b
18,26%
33,25% 33,28%
1M ATRA1M ATRA 1M ATRA + 13M CA1M ATRA + 13M CA 1M ATRA + 52M CA1M ATRA + 52M CA
51
Diferenciace linie HL-60 do stádia makrofágů:Diferenciace linie HL-60 do stádia makrofágů:
Induktor: 1,6 nM phorbolmyristyl acetát (PMA)
Marker: CD 14
Induktor: 1,6 nM phorbolmyristyl acetát (PMA)
Marker: CD 14Marker: CD-14
Detekce:Detekce: antianti--CD14, SwAMCD14, SwAM--FITCFITC
Marker: CD-14
Detekce:Detekce: antianti--CD14, SwAMCD14, SwAM--FITCFITC
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 08 / 13.4.Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 08 / 13.4.
52
Linie P19:Linie P19:Linie P19:Linie P19:
• myší embryonální karcinom• myší embryonální karcinom
• 7denní embryo do testes
• „embryoid bodies“ (EB)
• 7denní embryo do testes
• „embryoid bodies“ (EB)
• induktory mesodermální diferenciace:• induktory mesodermální diferenciace:• induktory mesodermální diferenciace:
kyselina all-trans retinová (atRA)
dimethylsulfoxid (DMSO)
• induktory mesodermální diferenciace:
kyselina all-trans retinová (atRA)
dimethylsulfoxid (DMSO)dimethylsulfoxid (DMSO)
• induktor neuronální diferenciace:
kyselina all-trans retinová (atRA)
dimethylsulfoxid (DMSO)
• induktor neuronální diferenciace:
kyselina all-trans retinová (atRA)
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 08 / 13.4.Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 08 / 13.4.
kyselina all-trans retinová (atRA)kyselina all-trans retinová (atRA)
53
Schéma diferenciace buněk P19Schéma diferenciace buněk P19
metoda kultivace na
bakteriologických miskách
metoda kultivace na
bakteriologických miskách
metoda „visících kapek“metoda „visících kapek“
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 08 / 13.4.Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 08 / 13.4.
54
Mesodermální diferenciace buněk P19:Mesodermální diferenciace buněk P19:
Induktor: 0,8% DMSO
Marker: myosin
Induktor: 0,8% DMSO
Marker: myosinMarker: myosin
Detekce:Detekce: antianti--skeletal myosin, SwAMskeletal myosin, SwAM--FITCFITC
Marker: myosin
Detekce:Detekce: antianti--skeletal myosin, SwAMskeletal myosin, SwAM--FITCFITC
55
ATRA – 1.denATRA – 1.den DMSO – 2.denDMSO – 2.den
50 m 100 m 
ATRA – 4.denATRA – 4.den DMSO – 4.denDMSO – 4.den
160 m 50 m
56
Neuronální diferenciace buněk P19:Neuronální diferenciace buněk P19:
Induktor: 1M kyselina all-trans retinová (ATRA)
Marker: neurofilamin
Induktor: 1M kyselina all-trans retinová (ATRA)
Marker: neurofilamin
Detekce:Detekce: antianti--neurofilament 160, SwAMneurofilament 160, SwAM--FITCFITCDetekce:Detekce: antianti--neurofilament 160, SwAMneurofilament 160, SwAM--FITCFITC
57
Praktické využití indukované diferenciace:
• základní výzkum
Praktické využití indukované diferenciace:
• základní výzkum
• diferenciační terapie v onkologii
→ hematologické malignity (APL AML)
• diferenciační terapie v onkologii
→ hematologické malignity (APL AML)→ hematologické malignity (APL, AML)
→ vybrané typy solidních nádorů (neuroblastom)
• diferenciační terapie v dermatologii
→ hematologické malignity (APL, AML)
→ vybrané typy solidních nádorů (neuroblastom)
• diferenciační terapie v dermatologii• diferenciační terapie v dermatologii
→ akné
příprava buněčných derivátů in vitro
• diferenciační terapie v dermatologii
→ akné
příprava buněčných derivátů in vitro• příprava buněčných derivátů in vitro• příprava buněčných derivátů in vitro
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 08 / 13.4.Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 08 / 13.4.
58
Retinoidy jako induktory diferenciace v klinické praxi:Retinoidy jako induktory diferenciace v klinické praxi:
Roaccutane
(isotretinoin, 13-cis-RA)
Roaccutane
(isotretinoin, 13-cis-RA)
Vesanoid
(tretinoin, all-trans-RA)( )
• akné, neuroblastom
( )
• akné, neuroblastom
( )
• akutní leukemie
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 08 / 13.4.Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 08 / 13.4.
59
COMBAT
léčba solidních nádorů (meduloblastom neuroblastom sarkomy )léčba solidních nádorů (meduloblastom , neuroblastom, sarkomy...)
celecoxib inhibitor cyclooxygenázy antiangiogenní účinek
etoposid inhibitor topomerázy II zástava b. cyklu
temozolomid alkylační činidlo apoptóza
kys. retinová diferenciační činidlo diferenciace/apoptóza
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 08 / 13.4.Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 08 / 13.4.