1 Bi8120 A lik á b ěč á bi l iBi8120 A lik á b ěč á bi l iBi8120 Aplikovaná buněčná biologieBi8120 Aplikovaná buněčná biologie EMBRYONÁLNÍ KMENOVÉ BUŇKYEMBRYONÁLNÍ KMENOVÉ BUŇKYEMBRYONÁLNÍ KMENOVÉ BUŇKYEMBRYONÁLNÍ KMENOVÉ BUŇKY Mgr. Jakub Neradil, Ph.D. Ústav experimentální biologie PřF MU Mgr. Jakub Neradil, Ph.D. Ústav experimentální biologie PřF MUÚstav experimentální biologie PřF MUÚstav experimentální biologie PřF MU 2 Program přednášky:Program přednášky:Program přednášky:Program přednášky: • vlastnosti kmenových buněk• vlastnosti kmenových buněk • embryonální kmenové buňky linie kmeno ých b něk podmínkách in itro • embryonální kmenové buňky linie kmeno ých b něk podmínkách in itro• linie kmenových buněk v podmínkách in vitro • indukované pluripotentní buňky • linie kmenových buněk v podmínkách in vitro • indukované pluripotentní buňky Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 09 / 20.4.Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 09 / 20.4. 3 Totipotence • nelimitovaný diferenciační potenciál Totipotence • nelimitovaný diferenciační potenciál• nelimitovaný diferenciační potenciál • schopnost tvořit embryonální i extraembryonální tkáně • nelimitovaný diferenciační potenciál • schopnost tvořit embryonální i extraembryonální tkáně • časná stádia rýhování zygoty Pluripotence • časná stádia rýhování zygoty PluripotencePluripotence • schopnost tvořit buňky všech 3 zárodečných listů Pluripotence • schopnost tvořit buňky všech 3 zárodečných listů • buňky ICM (embryonální kmenové buňky) Multipotence • buňky ICM (embryonální kmenové buňky) Multipotence • schopnost tvořit buňky příslušného typu tkáně • např. hematopoetické kmenové buňky, neuronální kmenové buňky • schopnost tvořit buňky příslušného typu tkáně • např. hematopoetické kmenové buňky, neuronální kmenové buňky Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 09 / 20.4.Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 09 / 20.4. neuronální kmenové buňky…neuronální kmenové buňky… 4 Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 09 / 20.4.Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 09 / 20.4. 5 VLASTNOSTI KMENOVÝCH BUNĚKVLASTNOSTI KMENOVÝCH BUNĚKVLASTNOSTI KMENOVÝCH BUNĚKVLASTNOSTI KMENOVÝCH BUNĚK Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 09 / 20.4.Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 09 / 20.4. 6 Kmenové buňky (Stem Cells, SCs)Kmenové buňky (Stem Cells, SCs) = buňky z embrya, fetu nebo dospělého organismu,které se za určitých podmínek mohou neomezeně množit a rovněž dávat = buňky z embrya, fetu nebo dospělého organismu,které se za určitých podmínek mohou neomezeně množit a rovněž dávatmohou neomezeně množit a rovněž dávat vzniknout specializovaným buňkám různých typů tkání mohou neomezeně množit a rovněž dávat vzniknout specializovaným buňkám různých typů tkání • zdroje kmenových buněk: embryo fetus dospělý organismus • zdroje kmenových buněk: embryo fetus dospělý organismusembryo, fetus, dospělý organismus [+ placenta, pupečníková krev] embryo, fetus, dospělý organismus [+ placenta, pupečníková krev] Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 09 / 20.4.Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 09 / 20.4. 7 TERMINOLOGIE:TERMINOLOGIE:O OG • embryonální SCs (ESCs): b ál í k é (ES) O OG • embryonální SCs (ESCs): b ál í k é (ES)• embryonální kmenové (ES) • embryonální zárodečné (EG) • embryonální karcinomové (EC) • embryonální kmenové (ES) • embryonální zárodečné (EG) • embryonální karcinomové (EC)• embryonální karcinomové (EC) • linie embryonálních kmenových buněk • embryonální karcinomové (EC) • linie embryonálních kmenových buněk • dospělé (adultní) SCs (ASCs)• dospělé (adultní) SCs (ASCs) • kmenové buňky nádorů (Cancer SCs, CSCs)• kmenové buňky nádorů (Cancer SCs, CSCs) Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 09 / 20.4.Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 09 / 20.4. 8 StemnessStemness Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 09 / 20.4.Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 09 / 20.4. 9 Self-renewal SC h dělit ě“ dl hSCs se mohou dělit po „neomezeně“ dlouhou dobu, narozdíl od ostatních buněk organismu Differenciace SCs jsou nespecializované buňky, postupnou diferenciací vznikají specializované typy buněk Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 09 / 20.4.Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 09 / 20.4. 10 Plasticita h tt d lt í h SC čitéh á b Plasticita h tt d lt í h SC čitéh á bschopnostt adultních SCs určitého orgánu nebo tkáně diferencovat do jiného druhu tkáně schopnostt adultních SCs určitého orgánu nebo tkáně diferencovat do jiného druhu tkáně Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 09 / 20.4.Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 09 / 20.4. 11 Replikační potenciál SCs: I i Replikační potenciál SCs: I iIn vivo • ESCs - tvorba ICM ve stádiu blastocysty • ASCs - po celou dobu života organismu In vivo • ESCs - tvorba ICM ve stádiu blastocysty • ASCs - po celou dobu života organismu In vitro • ESCs, neuronální ASCs - neomezeně In vitro • ESCs, neuronální ASCs - neomezeně • většina ASCs - několik dělení • telomerázová aktivita • většina ASCs - několik dělení • telomerázová aktivitatelomerázová aktivita ESCs - symetrická mitóza á ó telomerázová aktivita ESCs - symetrická mitóza á óASCs - asymetrická mitóza ESCs: „Division without decision“ ASCs - asymetrická mitóza ESCs: „Division without decision“ Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 09 / 20.4.Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 09 / 20.4. ESCs: „Division without decision (Austin Smith, 2007) ESCs: „Division without decision (Austin Smith, 2007) 12 Replikační potenciál SCs: A – kmenová buňka B – progenitorová buňka C – differencovaná buňka 1 – symetrické dělení 2 – asymetrické dělení 3 dělení progenitorů3 – dělení progenitorů 4 – terminální diferenciace Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 09 / 20.4.Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 09 / 20.4. 13 Diferenciační potenciál lidských SCsDiferenciační potenciál lidských SCs Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 09 / 20.4.Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 09 / 20.4. 14 “Niche” (hnízdo) SCs“Niche” (hnízdo) SCs • mikroprostředí (microenvironment): podpůrné buňky, extracelulární matrix, adhezní molekuly a signální molekuly • mikroprostředí (microenvironment): podpůrné buňky, extracelulární matrix, adhezní molekuly a signální molekulymolekuly a signální molekuly • udržuje self-renewal SCs molekuly a signální molekuly • udržuje self-renewal SCsudržuje self renewal SCs • chrání před deplecí živin • reguluje proliferaci SCs udržuje self renewal SCs • chrání před deplecí živin • reguluje proliferaci SCsg j p • ASCs - po celou dobu g j p • ASCs - po celou dobu života organismuživota organismu niche cells SC ( itó ) niche cells SC ( itó ) Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 09 / 20.4.Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 09 / 20.4. SCs (mitóza)SCs (mitóza) 15 EMBRYONÁLNÍ KMENOVÉ BUŇKYEMBRYONÁLNÍ KMENOVÉ BUŇKYEMBRYONÁLNÍ KMENOVÉ BUŇKYEMBRYONÁLNÍ KMENOVÉ BUŇKY Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 09 / 20.4.Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 09 / 20.4. 16 Typy ESCsTypy ESCs Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 09 / 20.4.Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 09 / 20.4. 17 Izolace a indukovaná diferenciace ESCsIzolace a indukovaná diferenciace ESCs Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 09 / 20.4.Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 09 / 20.4. 18 Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 09 / 20.4.Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 09 / 20.4. 19 Á ÍÁ ÍLINIE EMBRYONÁLNÍCH KMENOVÝCH BUNĚK LINIE EMBRYONÁLNÍCH KMENOVÝCH BUNĚKKMENOVÝCH BUNĚK V PODMÍNKÁCH IN VITRO KMENOVÝCH BUNĚK V PODMÍNKÁCH IN VITRO Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 09 / 20.4.Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 09 / 20.4. 20 1981 - myší ES buněčná linie:1981 - myší ES buněčná linie: M.J. Evans and M.H. Kaufman University of Cambridge, UK M.J. Evans and M.H. Kaufman University of Cambridge, UK Gail L. Martin University of California, Gail L. Martin University of California, Nobel Prize 2007Nobel Prize 2007 San Francisco, CA, USA 1998 lidská ES buněčná linie San Francisco, CA, USA 1998 lidská ES buněčná linie Nobel Prize 2007Nobel Prize 2007 1998 - lidská ES buněčná linie: J.A. Thomson et al. University of Wisconsin 1998 - lidská ES buněčná linie: J.A. Thomson et al. University of WisconsinUniversity of Wisconsin, Madison, WI, USA University of Wisconsin, Madison, WI, USA Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 09 / 20.4.Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 09 / 20.4. 21 exprese a aktivita telomerázy (A) Gutlike structures (B) Rosettes of neural epithelium (C) Bone (D) Cartilage (E) Striated muscle (F) Tubules interspersed with structures resembling fetal glomeruli. Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 09 / 20.4.Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 09 / 20.4. exprese: AP, SSEA-3, SSEA-4, TRA-1-60, TRA-1-81 22 5denní blastocysta5denní blastocysta Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 09 / 20.4.Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 09 / 20.4. 23 Postup při vytvoření linie ESCs: Postup při vytvoření linie ESCs: Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 09 / 20.4.Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 09 / 20.4. 24 • odstanění zony pelucidy pronázou (proteáza) • imunochirurgické uvolnění ICM (anti-lidský IgG, komplement) ř í ICM f d l (MEF )• přenesení ICM na feeder-layer (MEFs) • pasážování mechanicky nebo enzymaticky Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 09 / 20.4.Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 09 / 20.4. 25 Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 09 / 20.4.Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 09 / 20.4. 26 Zákon č. 40/2009 Sb., trestní zákoník Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 09 / 20.4.Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 09 / 20.4. 27 Markery lidských ESCs:Markery lidských ESCs:y ý • Oct-4 (TF, octamer-4 binding protein) • Nanog (homeobox TF) y ý • Oct-4 (TF, octamer-4 binding protein) • Nanog (homeobox TF)Nanog (homeobox TF) • SSEA3 SSEA4 Nanog (homeobox TF) • SSEA3 SSEA4 (povrchové markery: Stage Specific Embryonic Antigen) T 1 60 (povrchové markery: Stage Specific Embryonic Antigen) T 1 60• Tra-1-60 Tra-1-81 (Tumor Rejection Antigen) • Tra-1-60 Tra-1-81 (Tumor Rejection Antigen)(Tumor-Rejection Antigen) • alkalická fosfatáza (Tra-2-54) (Tumor-Rejection Antigen) • alkalická fosfatáza (Tra-2-54) Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 09 / 20.4.Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 09 / 20.4. 28 Kultivační médium pro izolaci lidských ESCs: • DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium) Kultivační médium pro izolaci lidských ESCs: • DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium)DMEM (Dulbecco s Modified Eagle s Medium) • 20% FBS nebo KO-SR (serum replacement) • aditiva (b-merkaptoethanol, Gln, AAs, Atb) ů t é f kt bFGF (FGF2) DMEM (Dulbecco s Modified Eagle s Medium) • 20% FBS nebo KO-SR (serum replacement) • aditiva (b-merkaptoethanol, Gln, AAs, Atb) ů t é f kt bFGF (FGF2)• růstové faktory: bFGF (FGF2) • feeder-layer (myší embryonální fibroblasty, lidské fibroblasty): • růstové faktory: bFGF (FGF2) • feeder-layer (myší embryonální fibroblasty, lidské fibroblasty): inaktivace mitomycinem-C • matrigel inaktivace mitomycinem-C • matrigel Metody diferenciace lidských ESCs: • kultivace při vyšší densitě • kultivace v přítomnosti dalších buněčných linií Metody diferenciace lidských ESCs: • kultivace při vyšší densitě • kultivace v přítomnosti dalších buněčných linií• kultivace v přítomnosti dalších buněčných linií • přídavek růstových faktorů / cytokinů do média • aktivace endogenních transkripčních faktorů • kultivace v přítomnosti dalších buněčných linií • přídavek růstových faktorů / cytokinů do média • aktivace endogenních transkripčních faktorů Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 09 / 20.4.Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 09 / 20.4. • suspenzní kultura (tvorba embryoid bodies)• suspenzní kultura (tvorba embryoid bodies) 29 Zachování self-renewal mESCs vs. hESCs • nepotřebují feeder • LIF (leukemia inhibitory factor) • vazba na LIF R a gp130 receptor • aktivace transcripčního faktoru STAT3 • protiháč: ERK1/2 ->diferenciace • specifický marker SSEA-1 Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 09 / 20.4.Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 09 / 20.4. 30 Zachování self-renewal mESCs vs hESCsmESCs vs. hESCs • potřebují feeder layer nebop j y • adhezivní matrix (laminin, kolagen IV, heparan sulfát proteoglykany(HSPGs), entaktin – Matrigel)proteoglykany(HSPGs), entaktin Matrigel) • kondiciované médium z MEF • KO-SR (insulin transferin BSA)KO SR (insulin, transferin, BSA) • FGF-2 (4ng/ml) • aktivace signálních drah: FGF, activin, nodal • protiháč: BMP >diferenciace Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 09 / 20.4.Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 09 / 20.4. • protiháč: BMP ->diferenciace 31 Základní signální dráhy udržující self-renewal a pluripotenci Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 09 / 20.4.Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 09 / 20.4. 32 hESCs niche • regulace pSmad1 signální dráhyegu ace pS ad s g á d á y • agonista-BMP2 (bone morphogenic factor) • produkován extra-embryonálním endodermem z hESCs t i t GDF3 ( th d diff ti ti f t (GDF)• antagonista – GDF3 (growth and differentiation factor (GDF) • produkován hESCs Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 09 / 20.4.Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 09 / 20.4. 33 feeder-layerfeeder-layer myší vs. lidský • druhová odlišnost • odlišnosti v produkci růstových faktorů Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 09 / 20.4.Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 09 / 20.4. 34 „Adaptované“ lidské ESCs: • ESCs v podmínkách in vitro „Adaptované“ lidské ESCs: • ESCs v podmínkách in vitro• ESCs v podmínkách in vitro • změny v karyotypu • nejčastěji zisky (gains) na chromosomech 12, 17 a X bd b é ě k i ál í h ád ů • ESCs v podmínkách in vitro • změny v karyotypu • nejčastěji zisky (gains) na chromosomech 12, 17 a X bd b é ě k i ál í h ád ů• obdobné změny - markery germinálních nádorů • prokázáno již od nízkých pasáží • obdobné změny - markery germinálních nádorů • prokázáno již od nízkých pasáží Peter Andrews University of Sheffield Peter Andrews University of Sheffieldyy Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 09 / 20.4.Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 09 / 20.4. 35 Baker et al Nature Biotechnology 2007Baker et al Nature Biotechnology 2007 Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 09 / 20.4.Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 09 / 20.4. Baker et al., Nature Biotechnology 2007Baker et al., Nature Biotechnology 2007 36 Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 09 / 20.4.Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 09 / 20.4. 37 Diferenciační protokoly pro ESCs in vitro: t t li d d t Diferenciační protokoly pro ESCs in vitro: t t li d d t• neurony, astrocyty, oligodendrocyty • kardiomyocyty • endoteliální buňky • neurony, astrocyty, oligodendrocyty • kardiomyocyty • endoteliální buňky• endoteliální buňky • pankreatické β-buňky • CD34+ hematopoetické progenitorové buňky • endoteliální buňky • pankreatické β-buňky • CD34+ hematopoetické progenitorové buňkyCD34+ hematopoetické progenitorové buňky • antigen-prezentující buňky a NK-buňky • buňky plicního epitelu CD34+ hematopoetické progenitorové buňky • antigen-prezentující buňky a NK-buňky • buňky plicního epiteluy p p • osteoblasty • hepatocyty y p p • osteoblasty • hepatocyty • melanocyty • buňky prostaty • melanocyty • buňky prostaty Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 09 / 20.4.Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 09 / 20.4. 38 Přínos studia kmenových buněk • Studium vývoje organismů na buněčné a molekulární úrovni • Nádorová biologie – nádorové KB • Tvorba modelů různých onemocněníTvorba modelů různých onemocnění • Studium „genových cílů“ pro nová léčiva • Testování léčiv teratogenních a toxických sloučenin• Testování léčiv, teratogenních a toxických sloučenin • Studium mechanismů regenerace tkání • Buněčná terapie - náhrada chybějící nebo nefunkčníBuněčná terapie náhrada chybějící nebo nefunkční buněčné populace Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 09 / 20.4.Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 09 / 20.4. 39 Indukované pluripotentní kmenové buňky iPSCs • diferencovaná somatická buňka • reprogramace vývoje • vnesením a spuštěním vhodných genů ě d b ál íh “• změna do „embryonálního“ stádia Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 09 / 20.4.Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 09 / 20.4. 40 • vytvoření iPSCs bez využití embrya • metoda:“jaderné programování somatických buněk” 4 geny Oct4 Sox2 c Myc Klf4• 4 geny : Oct4, Sox2, c-Myc, Klf4 • retrovirové vektory (náhodná integrace, nádorová transformace buněk)) • přeprogramování kožní buňky na pluripotentní • ověřeno diferenciací a podílem iPSCs na tvorbě Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 09 / 20.4.Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 09 / 20.4. embrya (chimerické embryo) 41 schéma tvorby myších iPSCs Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 09 / 20.4.Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 09 / 20.4. 42 Podíl iPSCs na chimerickém myším embryu Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 09 / 20.4.Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 09 / 20.4. 43 • 4 geny : Oct4 Sox2 Nanog Lin28• 4 geny : Oct4, Sox2, Nanog, Lin28 • lentivirové vektory (náhodná integrace, nádorová transformace buněk, nekontrolovaná exprese)) • přeprogramování kožní buňky na pluripotentní • ověřeno: celogenomová exprese podobná hESCs, h ý h ti ů t b t t ůexprese povrchových antigenů, tvorba teratomů po injekci do imunodeficientní myši Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 09 / 20.4.Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 09 / 20.4. 44 využití iPSCs • studium vývoje a funkce tkání transplantační medicína• transplantační medicína (vlastní buňky) • vývoj a testování léčiv • modelování chorob • léčba genetických poruch (genové inženýrství)(genové inženýrství) rizika spojená s přenosem a indukcí exprese nových genů Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 09 / 20.4.Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 09 / 20.4. a indukcí exprese nových genů 45 Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 09 / 20.4.Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 09 / 20.4. 46 Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 09 / 20.4.Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 09 / 20.4.