Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - 26.4.2011 Adultní a nádorové kmenové buňky doc. RNDr. Renata Veselská, Ph.D., M.Sc. Ústav experimentální biologie Přírodovědecká fakulta MU T.'ES- ZE DC ROZVOJE VZDĚLÁVÁN Táno prezř-":: s- s spoUtnanosrí^na E»Topsfcjni soctaÉlifn fcndem ; =:š:-"— rcsročJsn ůesy 1 BÍ8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 10 /26.4. 2 Program přednášky: • Adultní kmenové buňky (ASCs) biologické vlastnosti a diferenciační potenciál mikroprostředí (niche) ASCs využití ASCs pro buněčné terapie -> 4.5.2011 • Nádorové kmenové buňky (CSCs) biologické vlastnosti a hypotézy vzniku CSCs markery CSCs možnosti cílené protinádorové terapie Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 10 /26.4. 3 ADULTNÍ KMENOVÉ BUŇKY (ADULT STEM CELLS, ASCs) Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 10 /26.4. 4 Typy ASCs: mozek krev rohovka sítnice srdce tuková tkáň kůže dřeň zubu kostní dřeň cévy kosterní svalstvo střeva pupečníková krev Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 10 /26.4. 5 Lidské SCs kostní dřeně BÍ8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 10 /26.4. 6 Diferenciační potenciál hematopoetických a stromálních SCs Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 10 /26.4. 7 Plasticita hematopoetických SCs Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 10 /26.4. 8 Izolace hematopoetických SCs pomocí FACS Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 10 /26.4. 9 Příklad transdiferenciace neurálních SCs BÍ8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 10 /26.4. 10 Transdiferenciace = schopnost buněk diferencovat do fenotypu charakteristického pro jiný typ tkáně nebo orgánu, než byla tkáň původní • hematopoetické SCs — kardiomyocyty, hepatocyty Ratajczak et al. 2006 • populace velmi malých buněk v kostní dřeni, které se podobají ESCs, mají morfologii a markery shodné s nediferencovanými SCs • in vitrodiferenciace do fenotypu kardiomyocytů, neurálních a pankreatických buněk Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 10 /26.4. 11 "Niche" (hnízdo) SCs • mikroprostředí (microenvironment): podpůrné buňky, extracelulární matrix, adhezní molekuly a signální molekuly • ASCs - po celou dobu života organismu niche cells SCs (mitóza) Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 10 /26.4. 12 NÁDOROVÉ KMENOVÉ BUŇKY (CANCER STEM CELLS, CSCs) Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 10 /26.4. 13 Nádorové kmenové buňky (Cancer SCs, CSCs) • prokázány u hematologických malignit i různých typů solidních nádorů Vlastnosti • proliferační a diferenciační potenciál • schopnost self-renewal • metastatický potenciál • sekrece růstových faktorů, cytokinů • vysoká telomerázová aktivita • specifické markery (CD133...) • specifické signální dráhy (Wnt, Notch, Hedgehog) • rezistence vůči apoptóze Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 10 /26.4. 14 15 Důsledek: zásadní změna pohledu na biologii nádorů Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 10 /26.4. 16 Současné hypotézy vzniku nádorů Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 10 /26.4. 17 Heteroaenní prostředí solidního nádoru C = kapilára N = nekróza TAM = tumor-associated marcophaaes McAF TAM • Lymphocyte QTICa f^JAC* -1 ^ TD M w o 6 TICs = tumor iniciating cells (= CSCs) TACs = transit amplifying cells TD = terminally differentiated cells Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 10 /26.4. 18 Mikroprostředí (niche) CSCs v solidních nádorech BÍ8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 10 /26.4. 19 Komponenty mikroprostředí v solidních nádorech • hypoxie, ECM, mezibuněcné interakce, extracelulárcní (secernované) faktory a signály, „tissue makeup" Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 10 /26.4. 20 BÍ8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 10 / 26.4. 21 Hypotézy vzniku CSCs • nádorová transformace ASCs, resp. progenitorových buněk • chybná inkorporace buněk kostní dřeně • aberantní depozity ESCs (transformovaných) • mutace podmiňující dediferenciaci a imortalizaci diferencovaných buněk ve tkáni Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 10 /26.4. 22 lidské CSCs lidské ESCs Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 10 /26.4. 23 SCs normální tkáně: • hematopoetické SCs • neurální SCs • neuroektodermální SCs • epiteliální SCs prsní žlázy •epiteliální SCs renálních tubulů • SCsjaterní tkáně • ovariální epiteliální SCs • cervikální epiteliální SCs • epiteliální SCs sítnice Odpovídající typ nádoru: •leukemie •nádory mozku •neuroblastom •nádor prsu •Wilmsův tumor ■ • hepatoblastom • karcinom vaječníků • karcinom děložního krčku • retinoblastom Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 10 /26.4. 24 Hypotézy vzniku CSCs: Self-renewal Differentiated cells Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 10 /26.4. 25 Hypotézy vzniku CSCs: 1, Stem cell 2. Progenitor cell 3. Differentiated cell Cancer stem cell Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 10 /26.4. 26 BÍ8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 10 /26.4. 27 Vznik nádoru v důsledku transformace ASCs: karcinom prsu Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 10 /26.4. 28 BÍ8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 10 / 26.4. 29 Markery různých typů CSCs: Orgán Markery ^^^^^^H CD133+ CD133+ Burketetal. 2006, Guo et al. 2006, Li et al. 2007, Neuzllet al. 2007, Olempska et al. 2007, Vassh et al. 2007 Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 10 /26.4. 30 Markery CSCs u nádorů mozku: •nestin (IF protein, nediferencované buňky CNS) • Musashi-l (neural RNA-binding protein) • CD44 (CAM, CNS nádory) • CD133 (transmembránový protein, neurální SCs) •Sox2(transkripční faktor, neurální SCs) • Bmi-1 (self-renewal, proliferace SCs) Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 10 /26.4. 31 Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 10 /26.4. 32 Markery CSCs u nádorů dětského věku: Malignancy Cell Surface Proteins Nu clea r/Cyt o p la sinic Proteins Transcription Factors Functional/ Enz vines Ref. AT/RT CD133 [31] Ependymoma CD133 CD15 Nestin, BLBP, RC2 [2930,31] Ewing's SarcomaTNET CD133 SP [58,74] Glioma CD133 CD15 Musashi-1. bmi-1 Sox-2 [24,25,32] Hepatoblastoma SP [76] Malignant rhabdoid CD133 [45] rumor of the kidney Medulloblastoma CD133 CD15 Nestin SP [24-28,32-34] Melanoma, childhood CD133 [44] Neuroblastoma CD133 Nestin SP [42,43,74,77] Osteosarcoma CD133 Nestin Oct3/4, Nanog SP [48-51,75] Retinoblastoma CD133 CD44 Nestin. musashi-L Oct3/4. Nanog, ALDH1, SP [3Ů-39] bmi-1 pax-6. chxlO Rhab domy osarcoma CD133 SP [57,74] Wilms Tumor CD133 NCAM [46] (Friedman and Gillespie, Cancers, 2011) Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 10 /26.4. 33 CD133 (Prominin-1) • membránový glykoprotein • 4p15.32, 865 AA, 97 kDa • 5 transmembránových segmentů: 5-TM family • organizace membránových protruzí • SCs i CSCs Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 10 /26.4. 34 Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 10 /26.4. 35 36 37 Buněčná linie Saos-2 (ATCC) - osteosarkom CD133 / DAPI Nestin / DAPI Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 10 /26.4. 38 Identifikace markerů CSCs v sarkomových buněčných liniích CD133 Nestin Rhabdomyosarkom Osteosarkom Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 10 /26.4. 39 Funkční testy (functional assays) na fenotyp CSCs • tvorba sfér (sphere formation assay) • tvorba kolonií (colony forming assay) • testy klonogenity (clonogenicity assay) Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 10 /26.4. 40 Tvorba sfér (sphere formation assay) • vytváření suspenzních buněčných agregátů Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 10 /26.4. 41 Tvorba kolonií (colony-forming assay) • vysetí naředěné buněčné suspenze do měkkého agaru vytváření kolonií_ Tlfmcr Spwmort Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 10 /26.4. 42 Testy klonogenity (clonogenicity assay) • inokulace izolovaných buněk do 96-jamkových destiček (ředěním nebo pomocí mikropipety) • proliferace a tvorba kolonií (>50 buněk) Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 10 /26.4. 43 Testy tumorigenicity (tumorigenicity assay) • subkutánní injekce buněčné suspenze NOD/SCID myším (koncentrace cca 107/ml) • monitorování růstu nádorů, histologická analýza Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 10 /26.4. 44 Příklad komplexní analýzy CSCs in vitro (osteosarkom) (Tirino et al., FASEB J, 2011) Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 10 /26.4. 45 Příklad komplexní analýzy CSCs in vitro(osteosarkom) Tum ob r growth from ÖS 15 Tu mour fl ro wth from BS1 $ Tumour growth from HT1030 Tim» (w*tk) Tin» [wHk] Tims (wukj (Tirino et al., FASEB J, 2011) Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 10 /26.4. 46 Hypotéza CSCs: Důsledky pro protinádorovu léčbu Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 10 /26.4. 47 Konvenční vs. cílená protinádorová léčba: Initially no clinical Eventually cancer response is detected stops producing by traditional criteria new cells Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 10 /26.4. 48 Rizika neselektivní léčby cílené proti CSCs: poškození ASCs v nenádorové tkáni normal cell | | tumori£enic tell | normal cell turnorigc-nic cell „ fenewatof renewal of self-renewal seiwenewal malignant malignant non-seleetive^^^^ . |y §j selective targeting £ \ JWr ^ ^ ^Wjfr targeting shared renewal different renewal mechanisms mechanisms therapeutic index BÍ8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 10 / 26.4. 49 Problém cílené terapie: chemorezistence a radiorezistence CSCs C kemoresí stance Mecha nisin Tumor Type Ref. Efficient DXA repair ability Ependymoma, Ewing's sarcoma. [99.102] GBM. MB. osteosarcoma Differential expression and phosphorylation of kinase s Neuroblastoma [100] Low Proliferative Ki-67 index Childhood melanoma [44] ABC multidrug resistance MB. neuroblastoma [42 J 02] Quiescence Ependymoma, GBM. MB, PNET [102] RadUoresistance Mechanism Preferential activation of DNA damage response Glioblastoma [103] Upregulation of anti-apoptoric genes MB. AT RT [31.104] Předpokládané mechanismy chemorezistence a radiorezistence u nádorů dětského věku (Friedman and Gillespie, Cancers, 2011) Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 10 /26.4. 50 Terapie cílená proti CSCs: možné strategie Altering interaction Manipulating self renewal pathways Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 10 /26.4. 51 Terapie cílená proti CSCs: Příklady konkrétních strategií u vybraných typů nádorů Ta Ide 2 Potential therapeutic avenue* again y ^Tcjn-likc cancer cells Therapeutic modality Tissue-specific example Reference Oncolytic vim! tberapy Capsid-modified adenoviral vectors against CD44+/Cui4— breast cancer cells Different iuiiou ilierapy All-mim rccinoic acid treatment for neuroblastoma: Oneostaiin M (IL-ft-relaicd) Tor hepatocellular carcinoma J......iiiiľl -vil lk'i:i|'\ Pharmacological disruption of intracellular signaling Monoclonal antibodies against tumors fi>r neutrali/ation. inhibition, or cytotoxicity purposes: l-pCAM aHtib**iy for stem-like populaiioti in pancreatic cancer Per if wine for Akt inhibition in leukemic stem eel Is and radioKsisteni breast cancer eel Is [67, 6S] Mjerocn v in> t! nic m al um u i pu lai inu Piirupiioji of bone marrow-mediated oneoptoteet ion by inhibiting CXCR4/SUP-1 signaling in rhabdomy osarcoma ami leukemia [69, 70] Highly sensitive auction of disseminated breast wmw cells of OJ44+ phenotype- using pliuiuaeuusti*; flow- cytometry l-l. (Patel et al., Oncol Rev, 2010) Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 10 /26.4. 52 BÍ8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2011 - 10 /26.4. 53