KomparKomparttmentalizacementalizace interfazníchinterfazních jaderjader Morfologické a jaderněMorfologické a jaderně--topografické aspektytopografické aspekty buněčné diferenciace.buněčné diferenciace. ApoptózaApoptóza a struktura chromatinu.a struktura chromatinu. CytoskeletCytoskelet a jadernáa jaderná matrixmatrix -- studiumstudium cytoskeletucytoskeletu pomocí mikroskopie spomocí mikroskopie s vysokýmvysokým rozlišením.rozlišením. BAC/PAC knihovny a jejich využití pro FISHBAC/PAC knihovny a jejich využití pro FISH technikutechniku Epigenetické procesy probíhající vEpigenetické procesy probíhající v buněčnýchbuněčných jádrech.jádrech. Cytogenetické a jaderněCytogenetické a jaderně--topografické změny utopografické změny u vybraných typů nádorů.vybraných typů nádorů. Patofyziologie,Patofyziologie, cytogenetikacytogenetika a jadernáa jaderná topografie mnohočetnéhotopografie mnohočetného myelomumyelomu.. Struktura chromatinu vyššího řáduStruktura chromatinu vyššího řádu Eva Bártová a StanislavEva Bártová a Stanislav KozubekKozubek www.www.tqnyctqnyc..orgorg Buněčné jádroBuněčné jádro Nuclear compartmentsNuclear compartments:: 1.1. NucleolusNucleolus 2.2. SplicingSplicing specspeckklesles 3.3. CajalCajal bodiesbodies 4.4. PMLPML bodiesbodies 5.5. snRNPsnRNP 6.6. ClusteryClustery interchromatinovýinterchromatinový granulí (granulí (IGCsIGCs)) specspeckklesles 5 CTCT--IC MODELIC MODEL (T.(T. CremerCremer)) HP1HP1 proteinsproteins AndersenAndersen etet alal.,., NatureNature, 2005, 2005 146bp146bp 6060 bpbp CHROMATIN:CHROMATIN: materiálmateriál jaderjader eukaryotnícheukaryotních buněk;buněk; nukleoproteinovýnukleoproteinový komplexkomplex tvořenýtvořený DNADNA vázanou navázanou na histonyhistony a další bílkoviny. Va další bílkoviny. V nedělícím se jádru lzenedělícím se jádru lze rozlišitrozlišit euchromatineuchromatin, kde, kde probíháprobíhá transkripcetranskripce, a, a heterochromatinheterochromatin,, který jekterý je transkripčnětranskripčně inaktivníinaktivní.. . HISTONY:HISTONY: skupina basických bílkovinskupina basických bílkovin vv jádřejádře eukaryoteukaryotníchních buněk, kde vytvářejíbuněk, kde vytvářejí reversibilní komplexy sreversibilní komplexy s DNADNA. Rozlišuje. Rozlišuje se pět typů histonů: H1, H2A, H2B, H3 ase pět typů histonů: H1, H2A, H2B, H3 a H4. Histony H2A, H2B, H3 a H4 tvoříH4. Histony H2A, H2B, H3 a H4 tvoří vždy ve dvou kopiíchvždy ve dvou kopiích oktameryoktamery, kolem, kolem nichž se obtáčínichž se obtáčí dvojšroubovicovádvojšroubovicová DNA;DNA; tento útvar se nazývátento útvar se nazývá nukleosomnukleosom. Histon. Histon H1 je přítomen v menším množství nežH1 je přítomen v menším množství než ostatní histony, a ačkoli je též vázán naostatní histony, a ačkoli je též vázán na DNA, není součástíDNA, není součástí nukleosomůnukleosomů. Histony. Histony se tak podílejí na uspořádání DNA vse tak podílejí na uspořádání DNA v eukaryontnímeukaryontním chromosomu do vláknachromosomu do vlákna vyššího řádu.vyššího řádu. NUKLEOSOMNUKLEOSOM 146bp146bp 6060 bpbp CHROMATIN:CHROMATIN: materiálmateriál jaderjader eukaryotnícheukaryotních buněk;buněk; nukleoproteinovýnukleoproteinový komplexkomplex tvořenýtvořený DNADNA vázanou navázanou na histonyhistony a další bílkoviny. Va další bílkoviny. V nedělícím se jádru lzenedělícím se jádru lze rozlišitrozlišit euchromatineuchromatin, kde, kde probíháprobíhá transkripcetranskripce, a, a heterochromatinheterochromatin,, který jekterý je transkripčnětranskripčně inaktivníinaktivní.. Kondenzace chromatinuKondenzace chromatinu Figure 23-38, p. 1094, Molecular Cell Biology, 3rd ed., Lodish, et al., copyright 1995, TheThe centromerecentromere isis togethertogether withwith telomerestelomeres andand originorigin ofof replicationsreplications oneone ofof thethe essentialessential partsparts ofof anyany eukaryoticeukaryotic chromosomeschromosomes.. TheThe centromerecentromere isis usuallyusually defineddefined byby specificspecific DNADNA (AT(AT--richrich)) sequencessequences whichwhich are inare in higherhigher eukaryoteseukaryotes typicaltypical tandemtandem repetitiverepetitive sequencessequences,, oftenoften calledcalled ""satellitesatellite DNA". SAT1,2,3,DNA". SAT1,2,3, alphaalpha satellitessatellites, beta, beta satellitessatellites.. CENP A, B, C, G,CENP A, B, C, G, H.H. TheThe kinetochoreskinetochores areare thethe sitessites wherewhere thethe spindlespindle fibersfibers attachattach.. KinetochoresKinetochores andand thethe spindlespindle apparatusapparatus areare responsibleresponsible forfor thethe movementmovement ofof thethe twotwo sistersister chromatidschromatids toto oppositeopposite polespoles ofof dividingdividing cellcell nucleusnucleus duringduring anaphaseanaphase.. AA centromerecentromere functionsfunctions inin sistersister chromatidchromatid adhesionadhesion,, kinetochorekinetochore formationformation,, andand pairingpairing ofof homologoushomologous chromosomeschromosomes.. WhenWhen thethe centromerecentromere doesndoesn't't functionfunction properlyproperly,, thethe chromosomeschromosomes don'tdon't alignalign andand separateseparate properlyproperly,, resultingresulting inin thethe wrongwrong numbernumber ofof chromosomeschromosomes inin thethe daughterdaughter cellscells ((aneuploidyaneuploidy),), andand conditionsconditions such assuch as DownDown syndromesyndrome,, ifif thethe cellscells survivesurvive atat allall.. Typy chromozomů:Typy chromozomů: metmetaa-- ssubmetaubmeta--,, akrocentrickakrocentrickéé pp qq 15 TranscriptomeTranscriptome map (map (CaronCaron etet alal., 2001)., 2001) TelomeresTelomeres ((TTAGGGTTAGGG sequencesequence andand differentdifferent proteinsproteins)) TelomeraseTelomerase isis composedcomposed ofof twotwo subunitssubunits,, TelomeraseTelomerase ReverseReverse TranscriptaseTranscriptase ((hTERThTERT,, thethe 'h''h' isis forfor humanhuman)) andand hTRhTR ((TelomeraseTelomerase RNA).RNA). TheseThese twotwo subunitssubunits areare codedcoded for byfor by twotwo differentdifferent genesgenes inin thethe genomegenome.. UsingUsing hTRhTR templatetemplate,, hTERThTERT cancan addadd aa sixsix nucleotidenucleotide repeatingrepeating sequencesequence, 5', 5'-- TTAGGG toTTAGGG to thethe 3'3' strandstrand ofof chromosomeschromosomes.. ThisThis repeatingrepeating TTAGGGTTAGGG sequencesequence isis calledcalled thethe telomeretelomere.. TheThe templatetemplate regionregion ofof hTRhTR isis 3'3'--CCCAAUCCCCCCAAUCCC --55’.’. Telomerase is an enzyme that lengthens telomeres by adding on repeating sequences of DNA. Telomerase binds to the ends of the telomere via an RNA template that is used for the attachment of a new strand of DNA. Telomerase adds several repeated DNA sequences then releases and a second enzyme, DNA Polymerase, attaches the opposite or complementary strand of DNA completing the double stranded extension of the chromosome ends. High levels of telomerase activity are detected in embryonic stem cells and cancer cells, whereas little or no telomerase activity is present in most mature, differentiated cell types. CTCT--IC MODELIC MODEL (T.(T. CremerCremer)) ChromatinChromatin loopsloops T.T. CremerCremer groupgroup,, MunichMunich Chromatinové meziprostoryChromatinové meziprostory T.T. CremerCremer groupgroup,, MunichMunich Pozdně a časně se replikující chromatinPozdně a časně se replikující chromatin T.T. CremerCremer groupgroup,, MunichMunich ReplikaReplikačníční ohniskaohniska TRANSKRIPCE:TRANSKRIPCE: přepis, biosynthesa řetězcepřepis, biosynthesa řetězce RNARNA podlepodle templáttemplátovéhoového řetězceřetězce DNADNA,, přičemž jednotlivépřičemž jednotlivé nukleotidynukleotidy jsou připojovány na základějsou připojovány na základě komplementaritykomplementarity (viz(viz basebase nukleových kyselinnukleových kyselin). Klíčovým enzymem této synthesy je). Klíčovým enzymem této synthesy je RNARNA--polymerasapolymerasa. Transkripce. Transkripce probíhá ve třech stupních:probíhá ve třech stupních: a)a) iniciaceiniciace (zahájení), kdy se RNA(zahájení), kdy se RNA--polymarasapolymarasa váže naváže na specifickou sekvenci DNA (vizspecifickou sekvenci DNA (viz promotorpromotor) a přesunuje se k místu, kde začíná vlastní) a přesunuje se k místu, kde začíná vlastní synthesa;synthesa; b)b) elongaceelongace, kdy se RNA, kdy se RNA--polymerasapolymerasa posunuje podél řetězce DNA, uvolňujeposunuje podél řetězce DNA, uvolňuje kódující řetězec a podlekódující řetězec a podle templátovéhotemplátového řetězce postupněřetězce postupně synthetisujesynthetisuje novou RNA tím, ženovou RNA tím, že na volnou 3´na volnou 3´--OH skupinuOH skupinu ribosyribosy připojuje komplementární nukleotidy, jejichž donorempřipojuje komplementární nukleotidy, jejichž donorem jsoujsou nukleosidtrifosfátynukleosidtrifosfáty; vznikající RNA se postupně uvolňuje od komplexu s DNA a; vznikající RNA se postupně uvolňuje od komplexu s DNA a dvojitýdvojitý helixhelix DNA se samovolně obnovuje;DNA se samovolně obnovuje; c)c) terminaceterminace (ukončení synthesy a úplné(ukončení synthesy a úplné uvolnění RNA) jeuvolnění RNA) je signalisovánosignalisováno zvláštními sekvencemi ve struktuře DNA, které jsouzvláštními sekvencemi ve struktuře DNA, které jsou rozpoznávány bílkovinami, tzv. terminačními neboli ρ (rozpoznávány bílkovinami, tzv. terminačními neboli ρ (roro) faktory. Řízení transkripce) faktory. Řízení transkripce jednotlivých genů patří kjednotlivých genů patří k nejdůležitějším mechanismům regulace enzymové aktivity anejdůležitějším mechanismům regulace enzymové aktivity a diferenciace buněk.diferenciace buněk. AlternativeAlternative splicingsplicing isis aa formform ofof epigeneticepigenetic mechanismmechanism thatthat enablesenables a singlea single genegene toto givegive riserise toto multiplemultiple,, differentiallydifferentially splicedspliced versionsversions ofof aa proteinprotein,, increasingincreasing complexitycomplexity withoutwithout aa changechange inin thethe genomegenome.. Transcription factoriesTranscription factories CisCis acting elementsacting elements:: Enhancers, LCREnhancers, LCR TransTrans acting elements: proteins,acting elements: proteins, IkorosIkoros,, HHelioselios, HP1, HP1 proteinsproteins Faktory sestřihu jsou v SCFaktory sestřihu jsou v SC--3535 doménách, dáledoménách, dále snRNPsnRNP U1U1--U6 jsouU6 jsou součástí faktoru sestřihu SF2/ASFsoučástí faktoru sestřihu SF2/ASF Note: Interleukin-1beta pre-mRNA splicing proceeds in cytoplasm of enucleated platelets (Denis M. et al., 2005). NucleolusNucleolus NORNOR 400 (400 (540540)) rDNArDNA genůgenů FIBRILÁRNÍ CENTRUM (FC):FIBRILÁRNÍ CENTRUM (FC): zodpovídá za změny v buněčné aktivitězodpovídá za změny v buněčné aktivitě DENSE FIBRILAR COMPONENT (DFC):DENSE FIBRILAR COMPONENT (DFC): místo syntézymísto syntézy ribozomálníchribozomálních podjednotekpodjednotek GRANULAR COMPONENTS:GRANULAR COMPONENTS: ukotvuje DFC a FCukotvuje DFC a FC TvorbaTvorba ribozomůribozomů je komplexní proces zahrnujícíje komplexní proces zahrnující transkripci 45Stranskripci 45S prekurzoricképrekurzorické rRNArRNA, její, její vyzrávání, modifikaci a asociaci svyzrávání, modifikaci a asociaci s ribozomálnímiribozomálními proteiny a 5Sproteiny a 5S rRNArRNA, která se syntetizuje mimo, která se syntetizuje mimo jadérko. Vyzráváníjadérko. Vyzrávání rRNArRNA probíhá vprobíhá v procesomuprocesomu,, který obsahuje mnoho komplexů akterý obsahuje mnoho komplexů a snRNAsnRNA 32 VolpiVolpi etet alal., 2000., 2000 MHC on HSA 6MHC on HSA 6 ActiveActive // inactiveinactive chromatinchromatin T.T. CremerCremer groupgroup,, MunichMunich IMTERMINGLINGIMTERMINGLING ScheuermannScheuermann etet alal., Exp. Cell., Exp. Cell ResRes. (2004). (2004) G1G1 G2G2 Rb1 geneRb1 gene BártováBártová etet alal., 2002., 2002 GenesGenes inin humanhuman embryonicembryonic stemstem cellscells TranscriptomeTranscriptome map (map (CaronCaron etet alal., 2001)., 2001) Enterocytic cell differentiation and RIDGE/ANTI-RIDGE TranscriptomeTranscriptome map (map (CaronCaron etet alal., 2001)., 2001) HSA 18HSA 18 andand 19 (19 (positioningpositioning x genex gene densitydensity)) T.T. CremerCremer groupgroup,, MunichMunich Center of nucleusto-gene distances Gene-to-gene distances Gene-center of nucleus-gene angles 100* i i CH CR CS ==== 100* 2/)( 21 21 CHCH RR SS ++++ ==== 21 21 * * )cos( CRCR CRCR ====αααα R1 R2 H2 H1 GajduškováGajdušková P.P. T.T. CremerCremer groupgroup HarničarováHarničarová etet alal., 2005., 2005 HSA 8HSA 8 andand relatedrelated structuresstructures ZÁVĚRZÁVĚR Struktura chromatinu hrajeStruktura chromatinu hraje důležitou úlohu v regulacidůležitou úlohu v regulaci jaderných procesů jako je replikace,jaderných procesů jako je replikace, transkripce, sestřihtranskripce, sestřih a DNA reparace.a DNA reparace.