Regulace exprese lidského genomu Úvod (tok genetické informace, skladba lidského genomu, velikost - porovnání s jinými organismy, úrovně regulace) Porovnání regulace transkripce u pro- a eukaryot Regulace transkripce na úrovni genetického kódu Regulace na úrovni chromatinu a jádra Úroveň sestřihu, translace, degradace RNA a proteinu Genetický kód a tok genetické informace Skladba lidského genomu Mitochondriální (MCH) genom (Anderson 1981) 14.5 kb, 0.5% celého genomu, dědí se výhradně od matky, při dělení buňky MCH DNA segreguje náhodně, 37 genů – syntéza na MCH ribosomech (vlastní rRNA a tRNA); MCH genom je kompaktní - kódující Jaderný genom 24 různých molekul, 22 autosomů, 2 pohlavní chr., velikost 50-250 Mb, 25 000 genů 70% tvoří sekvence mající určitý vztah ke kódující DNA (včetně intronů a regulačních oblastí) 10% tvoří repetice (např. Alu sekvence) 10% tvoří transpozony Počty genů u různých organismů Mycoplasma (600) člověk + vyšší organismy (25 000) Escherichia coli (4000) Skladba genů u pro- a eukaryot Genom eukaryot obsahuje mezi kodujícími sekvencemi řadu nekódujících oblastí - intronů Geny : prům. velikost 10-15 kb ale variabilní od stovek bp- Mb (tRNA – Dys); exony činí od 100% až po 0.6% (Dys) Introny jsou velmi variabilní: 0-118 na gen (u colagenu); délka 0.5 kb pro ββββ-globin až po 30 kb pro dystrofin • Exprese u prokaryot je typicky regulována v rámci operonu – souboru kontrolních sekvencí v bezprostřední blízkosti proteinkódující sekvence • Eukaryotické geny jsou rovněž regulovány souborem kontrolních sekvencí, které se nacházejí poblíž protein-kódující sekvence, ale operony zde neexistují. • V eukaryotických buňkách je jádro – regulace je komplexnější (transkripce a translace jsou odděleny). • Introny se u bakterií téměř nevyskytují a regulace sestřihem se uplatňuje pouze u eukaryot • Existuje krátkodobá a dlouhodobá regulace transkripce. Rozdíly v regulaci u pro- a eukaryot Možnosti regulace exprese u eukaryot DNA RNA transkript mRNA mRNA inaktivní mRNA protein inactive protein regulace transkripce regulace sestřihu regulace transportu a lokalizace regulace translace regulace degradace mRNA regulace degradace a aktivity proteinu Jádro Cytoplasma Regulace transkripce u eukaryot Regulace krátkodobá exprese se mění rychle jako reakce na potřeby buňky nebo na vnější faktory Regulace dlouhodobá geny důležité z hlediska vývoje nebo diferenciace Základem regulace je vazba proteinů na DNA Vazba se uskutečńuje prostřednictvím interakce proteinu s DNA. Jsou známy různé strukturní motivy proteinů, které specificky vážou na DNA -Homeodoména -Motiv zinkového palce -Leucinový zip Promotor a transkripční kompex TFIID (TBP)TFIIB TFIIF - Promotor se nachází před počátkem transkripce - Některé promotory určují kde začne transkripce (např. TATA), jiné toto místo neurčují - Specifické TF se vážou na specifické promotory - Gen může mít jeden nebo více promotorů Regulace na úrovni prvotního kódu DNA - promotoru Transkripční kompex Regulace na úrovni prvotního kódu DNA D – TFIID je multi-komponentní faktor, který rozpozná a váže se k promotoru DNA. Obsahuje TBP (TATA binding protein), který se váže k TATA sekvenci. Vazba TFIID k DNA je prvním krokem při iniciaci transkripce TBP protein navázaný k DNA Transkripční kompex Regulace na úrovni prvotního kódu DNA B – TFIIB – váže se k TBP a k RNA polymeráze II stabilizuje vazbu TBP k TATA elementu, nutný pro asociaci RNA polymerázy II k iniciačnímu komplexu Struktura TFIIB proteinu navázaného k TBP-TATA komplexu Transkripční kompex Regulace na úrovni prvotního kódu DNA TFIIF má dvě podjednotky a váže se k RNA polymerase II – je potřebný pro stabilní vazbu polymerázy k promotorovému komplexu TFIIH má 6 nebo více podjednotek, váže se k DNA prostřednictvím TFIIE a umožňuje polymeráze opustit promotor (přejít do elongačního režimu) Enhancery a aktivátory transkripce Některé proteiny mohou mít dvě nebo více úrovní exprese, přičemž vyšší úroveň zajišťují aktivační proteiny, které mají dvě domény – vazebnou k DNA a aktivační. Vazebná sekvence se může nacházet daleko od regulovaného genu Enhancery Enhancery jsou krátké sekvence regulující transkripci na větší vzdálenost - mohou se nacházet před i za místem transkripce - aktivační proteiny mají doménu pomocí níž se vážou specificky na enhancer a doménu aktivační - DNA může vytvářet smyčky, které umožní interakci aktivačního proteinu s transkripčním komplexem - interakce regulačních proteinů určuje zda bude transkripce aktivována (může být také utlumena) Enhancery - příklad Příkladem jednoduché regulace u eukaryot je regulace steroidními hormony kdy jeden typ buněk organismu indukuje transkripci u jiných buněk - geny regulované steroidními hormony mají enhancery HRE – hormone response elements - HRE se nacházejí v mnoha kopiích - při absenci hormonu je jaderný receptor vázán na chaperon - přítomností hormonu se odstraní chaperon, změněný receptor se váže na enhancer Enhancery - příklad Epigenetická regulace exprese Epigenetika zahrnuje jevy související s dědičnou modifikací struktury a transkripce chromatinu jež navazuje zejména na: - modifikace histonů - metylaci DNA Patří zde PEV, umlčování genů heterochromatinem, regulace vývoje a diferenciace Polycom and trithorax proteiny, imprinting a další jevy. Nepatří zde vliv vnějších faktorů na expresi buněk. „Position effect“ u kvasinek a Drosophily Po ozáření se u Drosophily objevila mutace při niž se červené facety očí změnily zčásti na bílé. Cytogenetická analýza ukázala, že došlo k inverzi chromosomu, kdy se gen označeny jako „white“ přesunul do blízkosti heterochromatinu. Jev bylo možno potlačit nebo naopak zesílit. Časem bylo nalezeno 50 genů modifikujících tento fenomén. Nejlépe charakterizovaným modifikátorem je HP1 protein. HP1 obsahuje evolučně stálou chromo doménu, která se vyskytuje také u vývojového regulátoru Polycomb (PC) proteinu. Dalším je pak SUV39H1, který zajišťuje metylaci H3-K9. Opačný efekt mají tzv. trithorax proteiny. Úloha heterochromatinu při řízení exprese Heterochromatin - tmavě zbarvená část chromatinu, - kondensovaná po dobu buněčného cyklu - nachází se hlavně v centromerických a telomerických oblastech - je genově chudý, - obsahuje repetitivní sekvence - nachází se většinou na okraji jádra - DNA v heterochromatinu je špatně přístupná pro transkripční faktory, - histony jsou málo acetylovány a hodně metylovány na H3-K9 - obsahuje HP1 protein vázaný na metylovaný H3-K9 BrUTP – late S phaseDAPI Me9H3 Dvoustupňová regulace exprese (Francastel et al., 1999) Úloha heterochromatinu při řízení exprese Měřena vzdálenost genu od nejbližší oblasti heterochromatinu pro 3 typy buně T-MEL – exprese umlčená gen je blízko heterochrom atinu Struktura se může otevřít - dole a k expresi ještě nemusí dojít N-MEL – struktura je otevřená, gen je aktivní Buňky HL-60 Granulocyty Vzdálenost Rb genů k chromocentrům (Bártová et al) Úloha heterochromatinu při řízení exprese Metylace DNA - Existují enzymy metylující de novo (DNMT3a a DNMT3b) - Existují enzymy, které metylují druhý řetězec DNA podle prvního („maintenance methylaes“) – ty jsou odpovědné za dědičnost metylace - Existuje demetyláza, která odstraní metylaci z DNA. - Metylace DNA nastává nejčastěji v symetrických CG sekvencích (CpG islands), které se nacházejí u poloviny lidských genů transfer metylové skupiny S-adenosylmethioninu na 5-tou pozici cytosinu Zachování metylace při replikaci „udržovací metylázou“ CH3 CH3CH3 CH3 CH3 CH3 CH3 CH3 Replikace Metylace DNMT1 Metylace DNA je důležitá - Metylace DNA se nachází hojně u zhoubných nádorů (jak u onkogenů tak i u tumor supresorových genů) - Poškození metyláz (mutací) vede k těžkým onemocněním (bez methyltransferáz se embryo nevyvine) Úloha metylace při řízení transkripce - Transkripčně aktivní geny obsahují podstatně menší hladinu metylované DNA ve srovnání s inaktivními geny, - Inaktivní chromatin je obvykle metylován (např. inaktivní Xchromosom nebo inaktivované supresorové geny u nádorů) - Chromatin v místě metylace DNA je kondensovanější a brání přístupu TF - Promotory, které nemají CpG ostrůvky, mohou být citlivé na methylaci jednotlivých cytosinů – TF mohou být metylačně závislé (např. AP-2), existují však proteiny, které se vážou pouze na metylovanou DNA Mechanismus jak metylace DNA vede ke kondensovanému chromatinu DNA metylace usnadňuje vazbu HDAC komplexů (přes MBP – methyl binding proteins) a histon metylázy (HMT). Tyto enzymy odstrani Ac skupinu a přidají M skupinu na H3-K9, která je rozpoznána HP1 proteinem. Tento stav je dále šířen vazbou histon metyltransferázy na HP1. Umlčení exprese genu metylací de novo Umlčení genu probíhá v následujících krocích: 1) Odstranění regulačních proteinů 2) Metylace DNA 3) Vazba metylačně závislých proteinů 4) Deacetylázy a histon- metylázy 5) HP1 se váže na met. H3-K9 a posílí kondenzaci chromatinu Insulator – hraniční element Vzhledem k působení aktivátorů na velkou vzdálenost, musí být jejich vliv oddělen (aby si nepřekážely). To zprostředkovávaní insulatory – elementy jež vážou proteiny, které 1) chrání geny před šířením heterochromatinu (jejich přenos společně s genem do blízkosti heterochromatinu vyloučí PEV) 2) blokují funkci enhancerů (pokud se nacházejí mezi enhancerem a cílovým genem) gen A gen B gen A insulator enhancer insulator heterochromatin gen A není ovlivněn blízkým heterochromatinem gen A není ovlivněn enhancerem, zatímco gen B je Úloha Polycomb group proteinů (PcG) a trithorax group proteinů (trxG) při řízení vývoje Ontogeneze je kontrolována důmyslnou kaskádou genů, jež zahrnují transkripční faktory nejprve rozdělující embryo do větších domén a následně do jemnějších podjednotek. Identita jednotlivých částí těla je dána určitým TF. U Drosophily tyto TF tvoři tzv. HOM-C komplex, u obratlovců je to Hox komplex. Stabilní expresi těchto TF zajišťují PcG proteiny (udržují geny v reprimovaném stavu) a trxG proteiny (udržují aktivní stav). Mechanismus, kterým se tak děje zahrnuje modulaci struktury chromatinu. Existují významné paralely mezi regulací vývoje a umlčováním genů prostřednictvím modifikace chromatinu. Některé PcG proteiny mají HDAC aktivitu a naopak trxG proteiny mají HAT aktivitu. Molekulární gradienty v anteriorposteriorálním a dorso-ventrálním směru vedou k formování parasegmentů a poté segmentů u embrya i dospělého jedince V každém segmentu je exprimován jiný řídící protein Segmentace u embrya a dospělého jedince Úloha PcG a trxG proteinů při řízení vývoje prekursorová buňka 1 1 1 12 2 1 2 1 32 33 31 2 2 REGULAČNÍ PROTEIN 1 REGULAČNÍ PROTEIN 3 REGULAČNÍ PROTEIN 2 REGULAČNÍ PROTEIN buněčné dělení 3 REGULAČNÍ PROTEIN 3 REGULAČNÍ PROTEIN 3 REGULAČNÍ PROTEIN buňka A buňka C buňka D buňka E buňka F buňka Hbuňka Gbuňka B Úloha PcG a trxG proteinů při řízení vývoje Regulace exprese lidského genomu Úvod (tok genetické informace, skladba lidského genomu, velikost - porovnání s jinými organismy, úrovně regulace) Porovnání regulace transkripce u pro- a eukaryot Regulace transkripce na úrovni genetického kódu Regulace na úrovni chromatinu a jádra Úroveň sestřihu, translace, degradace RNA a proteinu Transkripční mapa genomu (Caron et al., 2001) Average expression [tags/105 tags] 2 4 6 8 10 Centretodomaindistances[%] 40 50 60 70 80 90 4 18 3 148 10 9 1 11 22 17 20 16 19 Lymphocytes Positions of all chromosomes in nuclei of different cell types Distance in % of radius 0 20 40 60 80 100 Probability 0.000 0.005 0.010 0.015 0.020 0.025 0.030 0 20 40 60 80 100 0.000 0.005 0.010 0.015 0.020 0.025 0.030 0.035 0 20 40 60 80 100 0.000 0.005 0.010 0.015 0.020 0.025 TP53 cen17 RARA Distance in % of radius 0 20 40 60 80 100 Probability 0.000 0.005 0.010 0.015 0.020 0.025 0.030 Iso-q Distance in % of radius 0 20 40 60 80 100 Probability 0.000 0.005 0.010 0.015 0.020 0.025 0.030 0.035 0.040 0.045 Iso-p Distance in % of radius Distance in % of radius Umístění genetických elementů HSA 17 vzhledem ke středu jádra a jejich umístění na transkripční mapě TP53 ISO-p RARA ISO-q centromere p11.2 p13.1 q12-q22.1 q21.3-q32 Umístění genetických elementů HSA 17 a HSA 12 na transkripčních mapách chromosomů TP53 Cen17Iso p RARα Iso q 206, 97, 116 73, 103, 189, 197 108, 140, 190 C12, 185 77, 71, 156 Okumura et al., 2000Lukášová et al., 2002 Vliv genové exprese na strukturu chromosomových teritorií Volpi et al., JCS, 2000 Chromosomy jsou polární s aktivní (dekondensovanou) doménou uvnitř a neaktivní (kondensovanou) doménou na okraji jádra. Toto uspořádání se v zásadě vytvoří v telofázi/G1 fázi a zůstává v průběhu cyklu neměnné. Tím se nastaví expresní profil buňky. Je dáno metylací DNA??? Chromosome backboneChromatin loopes (shown short for clarity) Schéma interfázního chromosomu Regulace exprese lidského genomu Úvod (tok genetické informace, skladba lidského genomu, velikost - porovnání s jinými organismy, úrovně regulace) Porovnání regulace transkripce u pro- a eukaryot Regulace transkripce na úrovni genetického kódu Regulace na úrovni chromatinu a jádra Úroveň sestřihu, translace, degradace RNA a proteinu Regulace exprese na úrovni zpracování mRNA Existuje několik regulačních mechanismů: Alternativní polyadenylace – podle toho kde se přidá polyA konec (jeden gen může dát proteiny zcela odlišné funkce) Alternativní sestřih – podle toho, který exon je začleněn do konečné mRNA Malé molekuly RNA (siRNA) – 20-25 nukleotidů dlouhé dsRNA mohou potlačit expresi určitého genu (RNAi efekt), jiné mohou aktivovat expresi. Nobelova cena – Adrew Fire a Craig Mello v roce 2006 „RNA interference“ MicroRNA (miRNA) – kodovány genomem, regulují expresi 30% genů u člověka podobně jako siRNA (buď degradací mRNA nebo post-transkripčně. Exprese miRNA deregulována u nádorových onemocnění, snížená exprese miRNA vede k rychlejší onkogenezi u modelových organismů. Tyto mechanismy mohou fungovat i současně Regulace exprese na úrovni zpracování mRNA dsRNA lze do buňky dopravit pomoci plasmidu, který umožní její expresi. dsRNA štěpí protein DICER, po navázání dalších proteinů se aktivuje Komplex rozpoznává mRNA a degraduje ji Proběhlo již testování terapeutických možností u lidí. Byly objeveny microRNA, které mají podobnou funkci, kodovány genomem