Primární a sekundární struktura DNA Dvojice bazí Řetězec fosfát-cukr Watson a Crick, 1953 Nukleosom a chromatinové vlákno Nukleosomové jádro (oktamerní komplex histonů) H1 histon 6 nm DNA 6-8 nukleos. Histon H1 30 nm 11 nm 6 nm Spojovací DNA Nukleosom Nukleosomové jadro DNA Buňka Chromosom Jádro buňky Vyšší struktura chromatinu Chromosomová teritoria První experimenty, které vedly k závěru, že chromosomy se nacházejí v jádře v podobě ohraničených domén, byly pokusy T. Cremera v létech 1982-1984. Zavedení FISH podstatně urychlilo poznání chromosomů jak v mitóze, tak v interfázi. Chromosomové domény (teritoria) Chromosom Jadérko Proteinový komplex Jaderné pory Chromatinová vlákna Transkripce Poškození DNA zářením Jednoduché zlomy DNA vznikají řadou procesů, často přenesením radikálu báze do 4-té pozice pentózy. Poškození DNA zářením Jednoduché zlomy DNA. Vznik zlomů z radikálu na 5-té pozici pentózy. Typy poškození bazí Ztráta báze – z předchozího je vidět, že v řadě případů může dojít ke ztátě bazí. Výpočet produkce zlomů DNA po ozáření Modelování DNA – existují modely struktury DNA, které umožňují stanovit přístupná místa. Je několik přístupů – lze určit tzv. Van der Waalsův povrch a „dostupný povrch“ (nemusí být shodné). Výpočet produkce zlomů DNA po ozáření Modelování DNA – na obrázku jsou znázorněny atomy H4‘, H5‘1 a H5‘2 jako zelená, žlutá a fialová – je vidět jejich přístupnost v uzkém žlábku DNA Výpočet produkce zlomů DNA po ozáření Modelování DNA – na obrázku je van de Waalsův model (vlevo) a model s reakčními sférami (vpravo), v němž jsou poloměry úměrné reakčním rychlostem. Výpočet produkce zlomů DNA po ozáření Modelování působení OH radikálu na DNA – na obrázku DNA a pohybující se radikál, který ji zasáhne. Výpočet produkce zlomů DNA po ozáření Závislost pravd. vzniku zlomu na složení DNA – byl ozařován fragment DNA a analýzována produkce zlomů v daném místě. Pravděpodobnosti závisí na složení – v blízkosti TTG, TTC jsou minima. Křivka představuje teoretický výpočet. Výpočet produkce zlomů DNA po ozáření Vznik zlomů DNA v tetraplexech – vlevo je struktura DNA vytvářející tetraplex, vpravo je pravděpobnost vzniku zlomů podél DNA (experiment a teoretická předpověĎ). Výpočet produkce zlomů DNA po ozáření Vznik zlomů DNA v komplexu s proteinem – na obrázku je část řetězce DNA v komplexu s lac represorem, jsou zde opět znázorněny atomy vodíku v polohách H4 a H5. Výpočet produkce zlomů DNA po ozáření Vznik zlomů DNA v komplexu s proteinem – vznik zlomů pro volnou DNA a DNA s represorem (vpravo). Je vidět, že s represorem jsou pravděpodobnosti značně odlišné. Výpočet produkce zlomů DNA po ozáření Vznik zlomů DNA v komplexu s histony (nukleosomy) – na obrázku jsou dva pohledy na oktamer histonů. Výpočet produkce zlomů DNA po ozáření Vznik zlomů DNA v komplexu s histony (nukleosomy) – produkce zlomů závisí na přítomnosti nukleosomů. Teorie a experiment jsou ale poněkud posunuty. Poškození DNA působením UV-záření Působením UV záření dochází ke vzniku dimerů a 6-4 fotoproduktů. Kovalentní vazba vzniká mezi sousedními pyrimidiny, nejčastěji jsou to thyminy. Oba typy poškození mohou způsobovat špatné párování při replikaci nebo zastavení replikace. Proto se vyvinuly systémy reparace těchto poškození. Protože na Zemi žijeme v přítomnosti UVzáření, vyvinula se řada systémů pro reparaci poškození způsobených tímto zářením. Systémy reparace DNA DNA je na rozdíl od proteinů, lipidů a sacharidů unikátní molekula v buňce. Molekuly, kterých je mnoho se mohou při poškození prostě zaměnit. Udržet DNA v originálním stavu je pro buňku jedna z hlavních úloh. Proto existuje řada reparačních systémů DNA. DNA je relativně stabilní sloučenina; je však vystavena mnoha poškozujícím vlivům: 1) Teplota – denaturace, deaminace basí, ztráta basí glykosylickou hydrolýzou 2) UV záření – vznikají pyrimidinové dimery, 6-4 fotoprodukty 3) Ionizující záření – poškození bazí, jejich fragmentace, zlomy 4) Chemické modifikace – velký počet Reparace byla první prozkoumána u E.coli s různými mutanty při působení UV záření. Proto probereme první UV-poškození a související reparační procesy. Fotoreaktivace – prokaryotní i eukaryotní buňky První systém reparace se nazývá fotoreaktivace. Uskutečňuje se působením jednoho enzymu – DNAfotoliázy. Tento enzym štěpí dimery. Energie pro štěpení kovalentní vazby cyklobutanového kruhu se čerpá pohlcením světla (370 nm) chromofory. E. coli fotoliáza: - phr gen, 54 kd, monomer - izolován – modrá barva, absorbuje při 380 nm - chromofory FADH2 a pterin - reparuje pyrimidinové dimery rychlostí 25/min/molekulu - stimuluje ABC nukleasu Fotoreaktivace – prokaryotní i eukaryotní buňky Vazba PL (fotoliázy) na DNA: - Velmi selektivní – váže se na dimery - Nezávislá na formě DNA (relaxovaná supercoiled, ssDNA apod) - Rozpoznává cyklobutanový kruh (2 kovalentní vazby), jiné dimery nepozná - PL asociuje s 6-7 páry bazí v okolí dimeru, zapadá do menšího žlábku DNA Mechanismus reparace: - Aktivuje se enzym přes pohlcení světla oběma chromofory - FADH2 (flavin) je excitován a předává elektron dimeru, čímž zruší příčnou vazbu - Role druhého chromoforu je pravděpodobně zaplnění místa po odevzdaném elektronu v molekule flavinu Fotoreaktivace byla nalezena u mnoha organismů včetně ryb, plazů ale nebyla nalezena u savců. U člověka existuje gen CRY, jenž je sekvenčně podobný fotoliáze, není však schopen fotoreaktivace (uplatnění při nastavení denních rytmů). Citlivost baktérií k záření a dalším činidlům Citlivost bakterií k různým činidlům je silně závislá na přítomnosti a správné funkci genu uvr. Nukleotidová excisní reparace Excisní reparace dimerů se uskutečňuje působením uvrABC systému. Komplex uvrAuvrB skenuje DNA a vyhledává dimery. Při jejich nalezení dochází k odpojení uvrA proteinu (ATP závislá reakce) a k připojení uvrC. Tento kompex (urvBuvrC) štípne páteř DNA v blízkosti dimeru. Část řetězce je odstraněna uvrD proteinem – helikázou II za dodání energie z ATP Další reparace se uskuteční jako prostá syntéza polymerázou a ligázou. Nukleotidová excisní reparace Nukleotidová excisní reparace UvrA protein – 2810 bp, ATPaza, vazebná aktivita k DNA. Funguje v dimeru. Poznání substrátu souvisí s deformací helikální struktury DNA. Dimer odtáčí helix o 19-20 stupňů a vytváří přehyb o velikosti 27 st., který zasahuje do velkého žlábku do vzdálenosti 0.26 nm. UvrB protein – 2019 bp, neváže se k DNA samostatně, pouze spolu s uvrA, nemá ATP-ázovou aktivitu. UvrC protein 1764 bp – váže se k uvrB na DNA 1 i více molekul a způsobuje excisi. Naštípnutí je současné na obou místech, nikoliv postupné. Štěpí 8-mou fosfodiesterickou vazbu ve směru 5‘ od poškození a 4-tou nebo 5-tou ve smru 3‘, což dává 12-13 mer Genu uvrC odpovídá u člověka ERCC1 gen, u kvasinek RAD10 gen, uvrD genu (helikáze) odpovídá ERCC2 u člověka a RAD3 u kvasinek. U člověka je excizní reparační systém složitější – 4 geny (XPC, DDB, XPA, RPA se mohou vázat k DNA. Genu uvrB odpovídají dva geny XPB a XPD, které jsou oba potřebné pro vznik pre-incizního stavu. Pro incisi jsou potřebné dva geny XPG a XPF – pro každou zvlášť – míst uvrC u E.coli. Celý kompex disociuje s 24-32 oligonukleotidem, mezeru zaplní pol δδδδ nebo εεεε a ligáza LIG1 Nukleotidová excisní reparace u člověka Excisní reparace poškozených bazí Dochází k odstranění poškozených bazí (nikoliv nukleotidů), kdy se hydrolyzuje N-glykosylická vazba mezi bazí a cukrem a odstraní se báze (DNA glykosylazou). Vzniká AP místo (apurinové nebo apyrimidinové), které se opraví endonukleázou (štípe páteř DNA v blízkosti AP místa) a dRpázou (deoxyribofosfodiesterazou). Vloží se nukleotid polymerázou a páteř se spojí ligázou. DNA glykosylázy: -Malé 20-30 kD, velmi specifické (např. uracil, hypoxantin, 3metyladenin,hydroxymetyluracil apod), záření vyvolává např. 4,6-diamino-5FAPY (formamidopyrimidin), který odstraňuje enzym genu fpg (30 KD). Hydroxymethyluracil vzniká rovněž působením záření nebo jiných oxidačních činidel AP endonukleázy: - Štípou fosfodiesterickou vazbu 3‘ nebo 5‘ od AP místa (podle toho existují 4 druhy endonukleáz (štípou buď na 3‘ straně nebo 5‘ straně od AP a vzniká 3‘OH + 5‘PO4, 3‘PO4 + 5‘OH). - Dále jsou různé druhy endonukleáz, např. endo IV – mutanti citliví k alkylujícím činidlům (mitomycin C, bleomycin), endo V – degraduje DNA s uracilem, u člověka existují také AP endonukleázy Excisní reparace poškozených bazí u člověka U člověka exitují 3 odlišné glykosylazy pro oxidativní poškození a čtvrtá pro alkylované puriny. Další 4 mohou odstranit uracil z DNA (např. UNG glykosyláza je homologická Ung enzymu E.coli, asociuje se s replikační vidlicí a odstraňuje chybně vložený uracil naproti adeninu. SMUG1 je unikátní pro vyšší eukaryoty a odstraňuje uracil vzniklý po deaminaci cytosinu v DNA). Byla nalezena pouze 1 endonukleáza pro AP místa(APE1). Delece tohoto genu způsobuje embryonální letalitu u myší. Na obr. je znázorněna reparace residua po deaminaci 5-methylcytosinu – thyminu. TDG gylkosyláza odstraní thymin a přivolá APE1 nukleázu, ta očistí okraj a přivolá POL b, ta vsadí cytosin a přivolá LIG3-XRCC1 komplex. Citlivost mutantů E. coli k UV záření V 60-tých létech byli izolováni mutanti E. coli citliví k UV-světlu. Nejzajimavější byli mutanti uvrA a recA, u nich u obou byla citlivost k UV podstatně větší než u buněk standardního (divokého) kmene. Ukázalo se, že existuje dvojitý mutant uvrA recA, jehož citlivost je ještě daleko vyšší, u kterého existuje pouze fotoreaktivace, tj. reparace závislá na světle. Existence dvou mutantu se zvýšenou citlivostí k UV záření nezávislých na sobě svědčila o existenci dvou reparačních systémů Dávka záření Log(přežítíbuněk) Wild type uvrA uvrA recA recA W-reaktivace fágových částic Při ozáření bakteriofága dochází k jeho poškození a ztrátě funkce. Čím je větší dávky, tím méně fágových částic přežívá (je schopno infikovat bakterii). Jestliže však bakterie předtím ozáříme, přežije více fágových částic – tomu se říká W- reaktivace (Weigle). SOS systém u E. coli SOS systém u E. coli je inducibilní enzymatický systém, který je odpovědný za reparaci, mutagenezi a další funkce. Základ regulace spočívá na lexA a recA proteinech. Za normálních okolností je v buňkách určitá bazální úroveň těchto proteinů, kdy lexA represor ve formě dimerů nasedá na operátory řady genů včetně recA a sebe sama a blokuje syntézu těchto genů. Koncensuální sekvence pro vazbu lexA proteinu je sekvence 5‘-CTGN10-CAG-3‘, tzv. „SOS box“. Vznikem poškození DNA dochází k vazbě recA proteinu na ssDNA a dále k asociaci s lexA proteinem, který se tímto štěpí (často se mluví o recAproteáze), hydrolýza lexA odblokuje syntézu řady genů, včetně recA, který pak má ještě další funkce – nasedá na DNA a chrání jí v průběhu reparace, způsobuje rekombinaci. Jakmile je poškození reparováno, klesne úroveň proteázy, lexA protein nasedne na operátorová místa a zablokuje syntézu. SOS (postreplikativní) reparace SOS systém umožňuje reparaci DNA v průběhu replikace – na poškození se polymeráza zastaví, disociuje od DNA a syntéza je inicializována ve vzdálenosti 1000 bp dál podél řetězce, zanechávajíce mezeru s poškozenou bazí (nebo dimerem). RecA protein se váže k ssDNA a má schopnost přenést do této mezery řetězec ze sesterského duplexu (chromatidy), který má nepoškozený templát. Tento „crossing over“ zanechává malé gapy, které se uzavřou polymerázou a ligázou. Poškození se neodstraní – pouze dochází ke zředění a poškození čeká na další reparaci (pokud je možná). Mismatch reparace Po replikaci se při chybně vloženém nukleotidu oprava děje tzv. „mismatch repair“ s využitím genů mutHLS. mutH se váže na GATC sekvenci s metylovaným A – tím se pozná starý řetězec DNA, mutS se váže na nespárované místo. MutL spojí mutH a mutS a dojde k vyštěpení řetězce za pomocí helikázy (uvrD). Reparace zlomů DNA SSB se reparují velmi rychle s využitím stejných reparačních systémů jak BER nebo NER. Existují však různé typy SSB – část se reparuje ligázou, část s použitím excizní reparace a zbývající poškození těžšího kalibru indukují SOS-reparaci. DSB se reparují pomocí rekombinace, což u E.coli při 1 genomu na buňku není možné. Replikace u bakterií však probíhá synchronně a doba zdvojení může být kratší než je doba replikace – pak je na buňku více genomů (např. 6-8 kopií). Pak je možná rekombinace. U savčích buněk se reparují DSB prostým spojením konců. To vyžaduje enzymy, které konce rozpoznají a dotáhnou je k sobě. Reparace nevyžaduje homologii a nazývá se nehomologní spojování konců (NHEJnonhomologous end-joining). Pro tuto reparaci je důležitý protein Ku. Je to heterodimer podjednotek Ku70 a Ku80. Defekt této reparace vede ke vzniku translokací. Dalším typem reparace DSB u savčích buněk je homologní rekombinační reparace. Tato reparace probíhá na sesterských chromatidách (G2 fáze cyklu) nebo s pomocí homologního chromosomu – v G1 fázi to předpokládá hledání tohoto homologa v jádře, což je málo pravděpodobné, proto se předpokládá, že v G1 probíhá pouze NHEJ. Další možnost je u chromosomů s duplikovanou sekvencí. NHEJ reparace Proteiny, které se účastní: DNA ligáza IV – kooperuje s XRCC4 na spojení konců po jejich patřičném opracováni XRCC4 - analog LIF1 genu u kvasinek – spojení konců XRCC5 – analog HDF2 u kvasinek – označuje se nyní jako Ku80 – spolupracuje s Ku70 nasedá na konce a spojuje je XRCC6 – analog HDF1, označuje se Ku 70, je velmi hojný tvoří heterodimer s Ku80, nasedá na konce a rozplétá částečně konce. XRCC7 – DNA protein kináza – aktivuje Artemis ARTEMIS – nukleáza regulovaná PKcs, připravuje konce pro ligázu. Mechanismus reparace: Oba zlomy jsou podrženy pohromadě v tzv. synapsi následujícím způsobem: 1) Ku proteiny nasednou na konce zlomů a interagují mezi sebou (tj. drží konce u sebe) 2) Ku přivolají protein kinázu PKcs, která se asociuje s ARTEMIS endonukleázou a aktivuje ji, aby očistila konce (ořezala jednořetězcové zbytky) 3) Po očištění se konce spojí – účastní se DNA ligáze IV a XRCC4 protein. NHEJ reparace Oba zlomy jsou podrženy pohromadě v tzv. synapsi následujícím způsobem: Homologní rekombinace u lidských buněk Existují dva dobře dokumentované procesy – SDSA a SSA Homologní rekombinace Rekombinační reparace může nastat tam, kde je k dispozici homologní DNA Hierarchie reparace zlomů u E. coli Prvotní zlomy DNA (sites) se zčásti mění na zlomy opravitelné systémem excizní reparace (enzym polA, a DNA ligáza) zčásti se mohou reparovat velmi rychle DNA ligázou. Z těchto poškození vznikají jednoduché zlomy (SSB1) na úrovni fyzikálně chemických procesů, ale také z poškozených bazí při excizní reparaci (BER). Tyto zlomy jsou převážně reparovány NER. Část těchto zlomů se transformuje na SSB2, což jsou dlouhé mezery v DNA (gapy). K této transformaci dochází kvůli poškození konců, nebo z jiných příčin, jestliže na zlom narazí replikační mechanismus. Tyto gapy pokud nejsou chráněny recA proteinem, se transformují na DSB (DSB enzymatického původu) a jsou letální u kmene E. coli recA. Přímé DSB jsou letální u buněk standardního kmene (wild type). Kinetika reparace zlomů v N2 a O2 MN a MO jsou radikály DNA, je jich více v přítomnosti kyslíku; v přítomnosti vychytávačů se jejich počet zmenší. Z prvotních zlomů (Nγ)se část reparuje, jak v přítomnosti kyslíku, tak bez něho (p1), část je nereparovatelná excizní reparací (NSSB1ir) a vyžaduje indukci SOS systému (p3) Model reparace zlomů u E.coli Nyní si schéma zjednodušíme a připustíme existenci dvou (hlavních) reparačních systémů – rychlé (excizní) reparace a pomalé (SOS reparace). Množství zlomů označíme Nssb,ir - pro zlomy nereparabilní rychlou (F-fast) reparací, Nssb,r – reparabilní zlomy v anoxických podmínkách a za přítomnosti kyslíku. Existence nereparabiliní zlomů je zřejmá. Hypotézou modelu je nezávislost Nssb,ir na přítomnosti kyslíku. Takovými poškozeními mohou být např. komplexní zlomy doprovázení poškozením báze (bazí). S N SF N N irSSBrSSB let 11 + ⋅ = Nechť frakce zlomů reparovaných rychlou reparací je F a pomalou je S. Pak dostaneme pro počet zlomů zbylých po reparaci (pomalá reparace je schopna reparovat i Nssb1,ir) Model reparace zlomů u E.coli Zkusíme využít experimentálních výsledků, abychom stanovili parametry modelu (předpokládáme, že 37% buněk hyne jestliže je v populaci v průměru 1 letální událost – nereparovaný zlom -na buňku): Kmen OER rec A 0.062 1.8 wild type 0.01 3.4 pol A 0.049 4.6 letN Model reparace zlomů u E.coli Pro kyslíkový poměr pak dostaneme: Zkusíme spočítat parametry podle naměřených údajů pro reparačně defektní buňky. OER pro mutanty E.coli s defektem excizní reparace, tj. polA1- kmen, je největší ze všech mutantů (pro polA1 kmen by mělo platit, že F=1): irSSBrSSB N irSSBrSSB NFN NFN OER 11 11 / /0 + + = irSSBrSSB N irSSBrSSB pol NN NN OER 11 11 0 6,4 + + == Střední letální dávka, která odpovídá počtu nereparovaných DSB pro recA kmen je podle tohoto modelu: irSSB rec rSSBrecAlet NFNN 11 /062,0 0 , +== Model reparace zlomů u E.coli Kyslíkový poměr pro recA buňky je pouze 1,8 a platí tedy: Odtud plyne, že počet zlomů nereparovatelných rychlou reparací u buněk recA souvisí jednoznačně s objemem rychlé reparace: Vzhledem k tomu, že recA buňky mají excizní reparaci vpořádku, je Frec»1. Proto bude produkce zlomu blízká Nssb1,ir=0.026 Gy-1genom-1. Dále pak pro buňky recA platí: irSSB rec rSSB N irSSB rec rSSB rec NFN NFN OER 11 11 / / 8,1 0 + + == 1 026,01 − ⋅= rec rec irSSB F F N 033,0/0 1 =rec rSSB FN ( )029,030 0 1 −⋅= SSB rec NF Pro polA máme podobně: ( )0 120 SSB pol NS ⋅= Model reparace zlomů u E.coli Pro počet letálních zlomů a OER buněk standardního (divokého) kmene platí (experimentální hodnoty jsou dosazeny) : wt rSSB wtwt rSSB wtlet S N SF N N 11 0 , 01,0 + ⋅ == irSSB wt rSSB N irSSB wt rSSB wt NFN NFN OER 11 11 / / 4,3 0 + + == Jestliže dosadím pro NO SSB1=2.2 10-12 cGy-1.D-1 = 0.66 Gy-1 genom-1 (ve shodě s experimentálními výsledky) pak dostaneme pro Frec=18.9 a Spol=13.2. Z těchto rovnic lze vypočítat: Fwt=3.6 a Swt=21.2 Model reparace zlomů u E.coli Výsledky výpočtů jsou tedy: Kmen F S rec A 18.9 1 wild type 3.6 21.2 pol A 1 13.2 Je vidět, že rychlá (excizní) reparace je u recA kmene efektivnější, než u standardního kmene při stejných podmínkách kultivace. Pomalá reparace u polA kmene je naopak méně efektivní ve srovnání se standardním kmenem. Model reparace zlomů u E.coli Pro buňky uvrA, tj defektní v nukleotidové excizní reparaci budou přispívat k letálnímu efektu pyrimidinové dimery vzniknuvší po ozáření. Jejich příspěvek při ozáření γ-zářením je 0.042 Gy-1genom-1. PD mají vlastnosti velmi podobné Nssb1,ir, protože jsou nezávislé na kyslíku. Reparovat se budou pomalou reparací, při které však bude jejich počet zřeďován, ale nebudou odstraněny. Bude platit: Z hodnoty OER=2 dostaneme Swt/Quvr=2.1 – tedy reparace PD je zhruba 2x méně efektivní než u ostatních zlomů na vstupu pomalé, tj. SOS reparace. Počet Nlet,uvr pak vychází 0.014, což je ve shodě s experimentem. Podobně pro dvojitý mutant recAuvrA máme: uvr PD wt irSSB wtrec rSSB uvrlet Q N S N SF N N ++= ,1 0 , 1 PDirSSB recN PDirSSB recO ur NNFN NNFN OER rSSB rSSB ++ ++ = 11 11 / / ( ) ( )uvrwt PDirSSB wt rSSB N uvrwt PDirSSB wt rSSB wt QSNNFN QSNNFN OER // // 11 11 0 ⋅++ ⋅++ = PDirSSBrec rSSB urlet NN F N N ++= 1 1 0 , Tyto hodnoty můžeme spočítat: Nlet,ur=0.1 Gy-1genom-1, OERur=1.35, což je ve shodě s experimentem. Model reparace zlomů u E.coli Podobně lze na základě modelu analyzovat i jiné kmeny E. coli. Je však třeba mít na paměti, že model je jednoduchý a odráží pouze určité aspekty reparace. Zajímavé je porovnat citlivost a kyslíkový efekt buněk standardního kmene pěstovaných v různých podmínkách (různě bohatá půda). Pro tyto různé podmínky se bude lišit poměr příspěvků obou hlavních reparačních systémů (vzhledem k tomu, že SOS reparace je závislá na energii a tedy podmínkách růstu). Předpokládejme, že hodnoty F a S pro oba reparační systémy jsou ve vztahu: (F-1).(S-1)b=K. Toto je empirická formule, která má tu vlastnost, že pro větší rychlost SOS reparace se zmenšuje objem polA-závislé reparace a naopak. Pokud se F nebo S blíží 1, objem opačné reparace se rychlé zvětšuje. Koeficienty b a K lze určit z experimentu a činí: b=0.7 K=21.5. Čím méně vydatné bude médium, tím větší bude citlivost buněk (více nereparovaných zlomů) a tím bude menší kyslíkový poměr.