titl CZ OPVK_MU_vlevo_2 Analýza obrazu Jana Buršíková Oddělení funkční genomiky a proteomiky ÚEB PřF MU www.sci.muni.cz/pVpKnb/ „Rozvoj týmu pro výuku, výzkum a aplikace v oblasti funkční genomiky a proteomiky“ (CZ.1.07/2.3.00/09.0132) zahlavi CZ Analýza obrazu Ø * Srovnání a vyhodnocení 2D gelů (vizuálně nemožné) • * Převedení zobrazení do formy digitálních dat (pomocí skeneru nebo kamery) • * Analýza pomocí speciálního SW * zahlavi CZ Barvení proteinů • * Viditelné barvení – Coomassie briliant blue, stříbro * Fluorescenční barvení – Sypro Ruby, Flamingo Pink, Deep Purple, Oriole, Lumitein * Radioaktivní značení zahlavi CZ Barvení proteinů • •Obecné požadavky na vizualizaci proteinů: • * vysoká citlivost, * široký lineární rozsah závislosti intenzity • barvičky na množství proteinu v gelu, * kompatibilita s následnými analýzami. zahlavi CZ Barvení – rozsah lineární závislosti intenzity barvičky na koncentraci proteinu •Barvení stříbrem – lineární závislost pouze •v rozmezí do 100 ng proteinu. •Při vyšších množstvích odklon od linearity. •Lineární dynamický rozsah •= graf závislosti intenzity barvičky (osa y) •na koncentraci proteinu (osa x) * zahlavi CZ Snímání obrazu * Viditelné barvičky • - denzitometry (GS-800) * * Fluorescenční barvičky • - skenery (FLA 7000) • •(Ex/Em spektrum se musí shodovat s Ex/Em charakteristikami přístroje) * zahlavi CZ Od analýzy obrazu očekáváme: * * srovnání gelů „treated“ a non-treated“ vzorků, * interpolaci izoelektrických bodů a MW, * detekci nových, chybějících nebo modifikovaných proteinů, * kvantifikaci spotů, * určení pozice spotu pro následné vyřezání, * detekci a charakterizaci skupin proteinů, drah a řetězců, * statistickou analýzu experimentálních dat. • zahlavi CZ SW * Vývoj - kontinuální proces * Spolehlivost * Reprodukovatelnost * Automatizace * Srovnání gelů různých velikostí, tvarů, poškozených gelů zahlavi CZ SW •Přesná a správná práce v laboratoři je základem experimentu. • •Sebelepší SW nedovede ze špatných podkladů vytvořit dobré výsledky. • •Špatné vyhodnocení může zmařit předchozí dobrou práci. • • zahlavi CZ SW – přehled dostupných programů * Delta 2D * ImageMaster * Melanie * Progenesis * PDQuest * Ludesi • • Různá filozofie, různý stupeň možností zasahovat do vyhodnocení. * zahlavi CZ Nejkritičtější části analýzy obrazu * * Správná detekce spotů • * Odečet pozadí * * Nesmí být modifikována základní data zahlavi CZ 2 koncepty 2D * jeden gel – jeden vzorek * mnohonásobná separace – DIGE gely • •Princip: • proteiny v různých vzorcích značeny různými spektrálně odlišnými fluorescenčními barvičkami; směsný vzorek analyzován na jednom gelu; jiný způsob vyhodnocování, plně automatické. * zahlavi CZ 2D elektroforéza • •Neexistuje standardizace pro přípravu vzorků a průběh elektroforézy. •Není snadné srovnávat výsledky z různých laboratoří. •Protein nelze identifikovat pouze na základě jeho pozice v gelu. •Musí následovat identifikace – MS. • zahlavi CZ Řezání spotů * Manuálně • (viditelné barvičky, transiluminátor) * * Automaticky • (spot cutter) * zahlavi CZ Vyhodnocování pomocí PDQuestu * Skenování gelu * Úprava obrázku * Detekce spotů a analýza pozadí * Vytvoření „master“ gelu a přiřazení spotů * Editace * Normalizace * Analytické sety * Výběr spotů pro další analýzu zahlavi CZ PDQuest – načtení obrázku ve formátu TIFF nacteni tiff zahlavi CZ Redukce obrázků zahlavi CZ Úprava * * Vertical/horizontal • flip * * Transform * * Rotation * * Image cropping * zahlavi CZ Úprava obrázku - cropping zahlavi CZ Detekce spotů a filtrace pozadí * Spot detection wizard – průvodce nastavením parametrů (step by step) • * Nastavení parametrů pro vyhledání spotů a odfiltrování pozadí zahlavi CZ Detekce spotů a filtrace pozadí •Scanset • 3 zobrazení každého gelu • • •Raw 2D image Gaussian * * původní (Raw 2-D scan) * filtrovaný * Gaussovský • • • Filtered * zahlavi CZ Detekce - specle zahlavi CZ Detekce spotů a filtrace pozadí zahlavi CZ Match Set * Soubor gelů porovnávaných navzájem v rámci experimentu * Master gel = uměle vytvořený gel * Prostřednictvím Master gelu jsou gely srovnávány mezi sebou * • zahlavi CZ Editování zahlavi CZ Replikativní skupiny •Použití * máme-li 2 a více gelů od jednoho vzorku * umožňují seskupit kopie gelů daného vzorku a určit průměrnou kvantitu každého spotu * analýza gelů v replikách je podmínkou pro aplikaci statistických nástrojů (např. Student T-test) * * zahlavi CZ Biologické a technické repliky * * Biologická – vzorky z různých organismů, stejný „treatment“ • (x rostlinek Arabidopsis, x různých pacientů se stejným typem nádoru apod.), • * Technická – stejný vzorek, stejný „treatment“ (reprodukovatelnost) zahlavi CZ Normalizace * Rozdíly ve velikosti spotů a intenzitě (mezi gely) – nejsou způsobeny rozdílnou expresí * Variace způsobené různými faktory – pipetování, příprava a zpracování vzorku, barvení….. * •—>NORMALIZACE = předpoklad pro správné srovnání kvantity spotů * • * zahlavi CZ Spot quantity * celková intenzita definovaného spotu v daném zobrazení gelu (pro výpočet se používá gaussovské zobrazení spotu) * koresponduje s množstvím proteinu v aktuálním spotu • zahlavi CZ Normalizace •je kompenzace rozdílů nezpůsobených a nesouvisejících s vlastní expresí. •Provádí se pro každý gel v experimentu. •Zahrnuje: * nenormalizovanou intenzitu spotu, * „scaling“ faktor – volí si uživatel, * faktor kompenzující chyby pipetování, * normalizační faktor (v závislosti na zvolené metodě). zahlavi CZ Metody normalizace * * Total quantity in analysis set * Total quantity in valid spots * Total density in gel image * Specified value * Mean of log ratios * Local regresion model * zahlavi CZ Analytické sety •Tři typy analytických setů: • * kvalitativní, * kvantitativní, * statistické (pouze pro replikativní skupiny) * Booleův analytický set • zahlavi CZ Příklady zahlavi CZ Příklady • • • •Stejný vzorek dělený na různých typech gelů * zahlavi CZ zahlavi CZ OPVK_MU_vlevo_2 •Děkuji za pozornost. Tato prezentace vznikla s podporou projektu OP VK „Rozvoj týmu pro výuku, výzkum a aplikace v oblasti funkční genomiky a proteomiky“ (CZ.1.07/2.3.00/09.0132)