Molekulární biologie
nádorů
Prof. RNDr. Jana Šmardová, CSc.
Ústav patologie, FN Brno
Přírodovědecká fakulta MU Brno
Lékařská fakulta MU Brno
2011
1. Úvodní přednáška
Studijní literatura
1. Texty přednášek
2. Robert Allan Weinberg: „The Biology of
Cancer“ GS Garland Science, 2007
3. Zdeněk Adam, Jiří Vorlíček, Jana Koptíková:
„Obecná onkologie a podpůrná léčba“
kapitola 2: Jana Šmardová, Jitka Pacholíková:
Molekulární podstata kancerogeneze
4. Robert Allan Weinberg: „Jediná odrodilá buňka.
Jak vzniká rakovina. “
Motto: Alfred G. Knudson (2000)
„Všichni pronásledovatelé démona nádoru v
minulém století museli být fascinováni
předmětem svého pronásledování a zároveň
museli cítit frustraci z jeho
neuchopitelnosti. Se vstupem do nového
milénia máme naději, že démon bude
nakonec pochopen a že na základě tohoto
pochopení najdeme způsob, jak ho přemoci.“
Historický přehled
• 400 p.n.l. Hippocrates popsal rakovinu jako dlouhé výběžky
(podobné račím nohám) vybíhajícím do zdravých tkání:
– řec: karkinos = rak; onkos = krab
– lat: cancer = rak
• popisné (epidemiologické) poznatky:
– 1848 - zvýšený výskyt rakoviny prsu u jeptišek (souvislost
s bezdětností a nekojením)
– 1775 - rakovina šourku u kominíků (souvislost s výskytem
škodlivin v sazích; souvislost s hygienickými návyky)
– 1902 - souvislost RTG paprsků a vzniku rakoviny
– poč. 20. stol. - rodinný výskyt nádorů
Historický přehled
• 1909 – Peyton Rous - infekční přenos nádoru u kuřat
studium nádorových virů (onkogen - fragment virových genů
způsobujících nádor) (1961 – Nobelova cena)
Historický přehled
• 1976 – Bishop, Varmus – objeven c-src (protoonkogeny):
souvislost s mitogenní signální dráhou
v souvislosti se studiem akutně transformujících virů
rozpoznáno asi 30 různých protoonkogenů
• pomalu transformující viry (inserční mutageneze): postupně
rozpoznáno 25 různých protoonkogenů
• Henry Harris (fúze buněk) - nádorové supresory – recesivní
geny (brzdy)
• Knudson – retinoblastom – „two hits hypothesis“
• přenosy DNA (transformace, transfekce)
Historický přehled
• biochemie: studium onkoproteinů, jejich lokalizace, interakcí
• molekulární biologie: izolace, charakterizace a cílená exprese
eukaryotických genů
• buněčná biologie: studium molekulárních mechanismů řídících
růst buněk, buněčné dělení
• genetika somatických buněk a virů: funkční testy
jednotlivých genů
p21: WAF1 - „wild type p53-activated fragment“
cip1 - „Cdk-interacting protein 1“
sdi1 - „senescent cell-derived inhibitor 1“
Nádor, tumor, neoplazma, novotvar
- je nová a abnormální tkáň v mnohobuněčném organismu,
která v tomto organismu nemá fyziologickou funkci a roste
neregulovaným způsobem.
- je geneticky podmíněný abnormální přírůstek buněčné
tkáňové hmoty klonálního charakteru. Jeho růst není v
koordinaci s růstem okolních tkání a rovnovážným stavem
organismu.
Základní pojmy
Klasifikace nádorů I:
podle schopnosti infiltrovat se do jiné tkáně
• Benigní (nezhoubné): zůstávají v místě svého vzniku,
nemigrují, neinvadují jiné tkáně.
• Maligní (zhoubné): pronikají do okolních tkání a
prostřednictvím krevního a lymfatického systému do
celého těla, v nových tkáních vyvolávají tvorbu
sekundárních nádorů (metastází)
• Z tohoto pohledu lze klasifikovat nádory na primární a
sekundární.
(Pozor: sekundární – therapy-related; vývoj z jiného méně
závažného stavu.
Pozor: maligní, tj. zhoubný, tj. smrtelný může být i
nemetastázující nádor)
Normální →→→→ maligní tkáň
• hyperplasie- buňky nezměněné, ale zmnožené
• metaplasie – přechodná změna fenotypu buněk - v důsledku
vnějších signálů; buňky lokalizované na nesprávném místě, často v
místě, kde se setkávají dva typy epitelu: děložní čípek – děloha;
jícen – žaludek - tzv. Barrettův jícen: premaligní, metaplasie –
dlaždicobuněčné buňky nahrazeny sekretorickými obvykle se
nacházejícími v žaludku: ~ 30x zvýšené riziko vývoje karcinomu
jícnu
• dysplasie – obsahují již cytologicky abnormální buňky (velikost,
tvar, barvitelnost jádra, poměr jádro/cytoplazma, změněná
mitotická aktivita) a abnormální poměr buněčných typů
Normální →→→→ maligní tkáň
• polypy, papilomy, warty – útvary již viditelné okem, obsahují
buňky jako normální tkáň, ale expandují a tvoří makroskopickou
masu; jsou dysplastické, nepenetrují bazální membránu, jsou
benigní
• invadující nádory – překračují/prostupují bazální membránu,
jsou tedy již maligní
• metastazující nádory – zakládají sekundární ložiska, jsou
nejenom invadující, ale mají navíc schopnost adaptace na nové
prostředí (+ motilita)
Klasifikace nádorů II:
podle typu buněk (tkání), ze kterých vznikají
• karcinomy – nádory epiteliálních buněk (asi 80-90%
lidských nádorů)
• sarkomy – pevné nádory konektivních tkání – svalů,
kostí, chrupavky
• leukémie a lymfomy - odvozené od
hematopoietických buněk a buněk imunitního systému
• neuroektodermální - nádory odvozené z nervové
tkáně
• germinální nádory – odvozené z totipotentní
zárodečné buňky
• smíšené nádory
Karcinomy
Odvozeny z epiteliálních
tkání:
Epiteliální buňky (Ep)
tvoří vrstvu buněk, které
tvoří výstelku tělních
dutin a kanálů, povrch
těla. Nacházejí se na
jedné straně bazální
membrány (BM), pod BM
jsou stromální buňky a
kolagenová vlákna (C),
která spojují BM s
extracelulární matrix
(ECM).
Karcinomy
• tvoří asi 80-90% nádorů
• z endodermu, mesodermu i ektodermu: vývojová historie
nepřispívá ke klasifikaci
• spinocelulární/dlaždicobuněčné – odvozeny z buněk, které
tvoří tu ochrannou vrstvu
• adenokarcinomy – odvozeny ze specializovaných buněk
sekretujících do dutin a kanálů nejrůznější látky, jejichž
účelem je ochrana epiteliálních buněk před obsahem dutin,..
• smíšené – oba typy koexistují
Sarkomy/mesenchymální nádory
tvoří asi 1% nádorů
nádory odvozené z konektivních tkání, z mesenchymálních
buněk:
• fibrosarkomy (odvozeny z fibroblastů - sekretují kolagen)
• liposarkomy (z adipocytů - ukládají v cytoplasmě tuky)
• osteosarkomy (z osteoblastů - sestavují kalcium fosfátové
krystaly v kolagenu – tvoří kosti)
• leiomysorkomy a rhabdomyosarkomy (z myocytů – tvoří svaly)
• angiosarkomy – vznikají z prekurzorů endoteliálních buněk
Leukémie a lymfomy
Nádory odvozené z hematopoietických buněk a buněk imunitního
systému
• leukémie – z buněk, které se volně pohybují cirkulací
• lymfomy – (z B a T lymfocytů) agregují a tvoří solidní nádory,
často v lymfatických uzlinách
Neuroektodermální nádory
Nádory odvozené z různých buněk centrálního a periferního
nervového systému:
• gliomy
• glioblastomy
• neuroblastomy
• schwannomy
• meduloblastomy
Tvoří asi 1,3% diagnostikovaných nádorů, ale představují asi
2,5% úmrtí spojených s nádory
Další nádory
Některé nádory nezapadají do uvedené klasifikace:
• melanomy - odvozeny z melanocytů, buněk, které sekretují
pigment
• malobuněčné karcinomy plic – obsahují buňky se znaky
neurosekrečních buněk
• transdiferenciace – přepnutí/změna tkáňové linie, získání
nových diferenciačních znaků (EMT: epiteliální –
mesenchymální transice)
• dediferenciace – nelze vystopovat typ tkáně, z níž je nádor
odvozen: anaplastické nádory (1 až 2% nádorů)
Klasifikace nádorů III:
podle postiženého orgánu nebo tkáně
• karcinom plic
• kolorektální karcinom
• nádor prsu
• akutní myeloidní leukémie
• a mnoho dalších
Vsuvka: Klasifikace solidních nádorů
: v praxi
Co všechno stanovuje patolog?
• typing
• grading
• staging
• rating
„Typing“
Přesný typ nádorového procesu. Vychází ze závazných
klasifikací, obvykle doporučených WHO. Každá jednotka má
přidělen svůj unikátní číselný kód ICDO (International
Classification of Diseases for Oncology)
Např. kód 8850/0 je lipom.
První číslo za lomítkem označuje biologické vlastnosti:
0: benigní
1: nejisté chování
2: carcinoma in situ
3: maligní
6: metastáza
Např. kód 8850/3 je liposarkom.
„Grading“
Stupeň diferenciace (jak moc se nádorové buňky podobají
normálním buňkám)
G1: dobře diferencovaný nádor s dobrou prognózou
G2: středně diferencovaný nádor s prostřední prognózou
G3: málo diferencovaný nádor se špatnou prognózou
Příklad: karcinom močového měchýře
Grade 1 Grade 2 Grade 3
dobře diferencované středně diferencované málo diferencované
„Staging“
mucosa
lamina propria
vnitřní svalová vrstva
vnější svalová vrstva
Anatomický rozsah choroby (jak dalece je nádor rozšířen) podle
světově unifikovaných systémů. Každá topika má svůj vlastní
systém. Kategorizace podle velikosti a anatomických bariér, které
nádor svým růstem překonal.
Příklad: karcinom močového měchýře
T1: malý lokalizovaný nádor
T2: větší, ale ohraničený uvnitř
orgánu
T3: nádor na hranici orgánu
T4: nádor, který se lokálně rozšířil
do dalších orgánů
„Rating“
Změny detekovatelné na molekulární úrovni.
• Některé jsou přímo diagnostické pro danou nosologickou
jednotku (např. specifické chromozomální translokace u
lymfomů či některých sarkomů, specifický imunofenotyp u
lymfomů či leukémií).
• Jiné mají vysokou prognostickou váhu a tím bezprostřední
vliv na volbu terapie (např. amplifikace genu N-myc u
neuroblastomu, amplifikace HER2/neu u karcinomu prsu).
• Další molekuly jsou cílem protinádorových léčiv a jejich
přítomnost/stav v buňce predikují účinnost této léčby (např.
Herceptin, Rituximab, Glivek,..).
Kancerogeneze
- je proces vzniku a vývoje nádoru
• je vícestupňový proces
• podstatou kancerogeneze je postupné hromadění
genetických (a epigenetických) změn
Neoplastická transformace - je přeměna somatické
buňky v buňku nádorovou
Podstatou kancerogeneze je postupné
hromadění genetických změn
Klonální model vývoje nádoru:
selekce, klonální expanze
normální
buňky
soutěžící subklony buněk maligní klon
ROKY
Jsou nádory monoklonální nebo
polyklonální?
Jsou nádory monoklonální nebo
polyklonální?
• Klonalitu lze studovat na základě sledování nějakého
unikátního genetického/epigenetického markeru (např.
Barrovo tělísko) ⇒ tak lze prokázat, že buněčná populace v
nádoru je monoklonální
X Na počátku mohl být vývoj polyklonální, ale přerostla
nejúspěšnější buněčná populace.
X Během vývoje narůstá genetická nestabilita a tedy i
heterogenita.
• Nicméně obecný konsensus říká, že nádory jsou většinou
monoklonální a jejich vývoj začíná jedinou odrodilou buňkou.
Nádor je komplexní tkáň
V nádorové tkáni se vyskytují nejenom transformované nádorové
buňky (a), ale také normální „nepozměněné“ buňky, které
„spolupracují“ při vývoji nádoru (b).
kancerogeneze vs. buněčná transformace
Histologická skladba nádoru
1. Nádorové stroma
• mezenchymální tkáňové složky: cévní
komponenty, podpůrné mezenchymální tkáně,
lymfocyty, makrofágy,..
• slouží hlavně k výživě parenchymu a jako
kostra pro uspořádání parenchymu
• transportní úloha (přenos signálů, rezervoár
růstových faktorů…)
• klíčová úloha při nádorové angiogenezi a
metastázování
2. Nádorový parenchym
• vlastní nádorově transformovaný
parenchym/buňky
Klasifikace nádorů IV:
podle histologické skladby
1. Nádory organoidní
dobře patrné rozdíly mezi stromatem a parenchymem
2. Nádory histoidní
při vysoké proliferační aktivitě transformovaných i
netransformovaných buněk v nádoru a odchylkách v
jejich diferenciaci může docházet k setření
cytomorfologických rozdílů mezi parenchymem a
stromatem
Kolik a které geny jsou změněny
během kancerogeneze?
• Kdyby k vývoji nádoru stačila
jediná změna, byla by
pravděpodobnost onemocnění
rakovinou stejná v každém
věku člověka - křivka
závislosti by byla lineární.
• Pravděpodobnost prudce
roste s věkem. Křivky
závislosti odpovídají složitým
procesům, kdy jednotlivé na
sobě nezávislé události
nastávají postupně jedna za
druhou.
Kolik a které geny jsou změněny
během kancerogeneze?
• Nádor není monogenní onemocnění.
• Odhaduje se, že pro vývoj nádoru je nezbytných 4-
7 událostí (zásahů).
• Konkrétních genů, které mohou být během
kancerogeneze změněny, jsou desítky, stovky.
• Obecně existuje šest (sedm?) základních
vlastností plně maligního nádoru:
Šest získaných vlastností maligního
nádoru (Robert A. Weinberg 2000)
Soběstačnost v produkci růstových signálů aktivace H-ras
Necitlivost k signálům zastavujícím b.c. ztráta RB
Poškození apoptózy produkce IGF
Neomezený replikační potenciál aktivace telomerázy
Posílení angiogeneze produkce VEGF
Tvorba metastáz inaktivace E-kadherinu
získaná schopnost příklad
Nestabilita genomu jako podmínka akumulace všech
nutných změn.
Tři vlastnosti vystihující maligní nádor
(Richard Klausner 2002)
• Nemoc genomové nestability
(výjimky: leukémie, některé lymfomy, Ewingův
sarkom)
• Nemoc změněného buněčného chování
• Nemoc změněného tkáňového chování
Kancerogeneze má obecné rysy
Kancerogeneze má individuální průběh
Individuální je - pořadí zásahů
- počet zásahů
- konkrétní zasažené geny
Onkogeny
Protoonkogen je strukturní gen eukaryotické buňky,
který se svým translačním produktem podílí do
značné míry na regulaci dělení buněk a jejich
diferenciace.
Onkogen je protoonkogen pozměněný nebo aktivovaný
tak, že vyvolává neoplastickou transformaci buňky.
Aktivace protoonkogenu je přeměna protoonkogenu na
onkogen.
Mutace protoonkogenů jsou:
- aktivující
- dominantní
- vyskytují se v somatických buňkách a jen výjimečně
v zárodečných buňkách
Nádorové supresory
Produkty genů pro nádorové supresory
(antionkogeny) v normálních buňkách nevyvolávají
proliferaci, ale naopak ji potlačují a udržují buňky
ve stadiu klidu (G0). Jejich ztráta se projevuje
neregulovanou proliferací.
Mutace nádorových supresorů jsou:
- inaktivující
- recesivní (spojeno s LOH) („recesivní onkogeny“)
- vyskytují se v somatických a také v zárodečných
buňkách
Geny poškozené během kancerogeneze
1. Onkogeny
Nádorové supresory
2. Onkogeny
Nádorové supresory
Geny zajišťující genomovou stabilitu („stability
genes“)
Sedm získaných vlastností maligního
nádoru
⇒⇒⇒⇒ vícestupňová kancerogeneze ⇒⇒⇒⇒ modely
Modely vícestupňové kancerogeneze
• Vývoj kolorektálního karcinomu
• Transformace onkogenními DNA viry
Onkogenní (nádorové) viry
• Retroviry (RNA viry): obsahují ve svém genomu onkogen (akutně
transformující viry) nebo aktivují protoonkogen, vedle kterého se
integrovaly (pomalu transformující)
• DNA nádorové viry používají jinou strategii transformace:
neobsahují onkogeny, ale kódují proteiny, které interagují s
nádorovými supresory (RB, p53, p300/CBP) hostitelské buňky a
tak hostitelskou buňku tlačí do S fáze:
SV40: velký T antigen různými doménami interaguje s p53, RB,
p300/CBP
adenoviry: E1A interaguje s RB a p300/CBP; E1B interaguje s p53
papilomaviry HPV-16, HPV-18: E6 interaguje s p53, p300/CBP;
E7 interaguje s RB
Vsuvka: Některé způsoby inaktivace
p53 virovými onkoproteiny
Inaktivace p53 patří ke klíčovým událostem při transformaci
buňky DNA viry.
• LT (SV40) - váže se do DNA vazebné domény p53 a
znemožňuje vazbu p53 na DNA
• E1B (adenovirů) - váže se do transaktivační domény p53 a
znemožňuje transaktivaci cílových genů
• E4orf6 (adenovirů) - způsobuje degradaci p53
• HBV X (viru hepatitidy B) - zadržuje p53 v cytoplasmě
• E6 (papilomavirů) - indukuje degradaci p53 užitím ubikvitin
ligázy E6AP; E6 dále inhibuje i přímo transaktivační
schopnost p53
Podíl proteinů E6 a E7 papilomavirů na
transformaci buňky
Virové onkoproteiny: stimulují proliferaci, inhibují apoptózu,
zvyšují replikační potenciál, mění morfologii buněk, indukují
maligní fenotyp
Vsuvka: Podíl proteinů E6 a E7
papilomavirů na transformaci buňky
E6 - inaktivuje p53 (blok G1, dep. apoptóza, gen.
stabilita)
- interaguje s p300/CBP (narušení homeostáze)
- aktivuje expresi hTERT (aktivace telomerázy)
- inaktivuje p16ink (narušení udržování klidového
stádia)
- interaguje s Bak (inhibice apoptózy)
- interaguje s E6BP/ERC-55 (inhibice terminální
diferenciace)
- indukuje degradaci hDlg (a další interakce s
proteiny obsahujícími vazebný motiv PDZ) (změna
morfologie, získání invazivního charakteru)
E7 - váže se na RB (uvolnění TF E2F)
- inaktivace p21Cip a p27Kip (rozpojení: diferenciace -
proliferace)
- ruší inhibiční působení TGF-ββββ na růst buněk
- způsobuje tvorbu násobných centrozómů
Podíl proteinů E6 a E7 papilomavirů na
transformaci buňky
Klinický význam papilomavirů
• Popsáno více než 100 odlišných typů papilomavirů.
• Dělí se na „high-risk“ a „low-risk“ typy podle prognózy, s níž jsou
spojeny. „Low-risk“ viry vyvolávají tvorbu benigních nádorů,
„high-risk“ viry jsou spojeny s maligní progresí.
• Asi 30 typů HPV preferenčně infikuje anogenitální oblasti,
infekce „high-risk“ viry je spojena téměř se všemi nádory
děložního čípku.
• Asi 20% všech nádorů ústní dutiny, které nejsou spojeny s
historií kouření a alkoholismu, je spojeno s infekcí HPV.
Onkogenní viry a lidské nádory
DNA viry:
• Virus Epstein-Barrové (EBV) - Burkittův lymfom (BL),
Hodgkinův lymfom (HD), lymfomy, nazofaryngální karcinomy
(NPC)
• Virus hepatitidy B (HBV) - hepatocelulární karcinom (HCC)
• Lidské papilomaviry (HPV 16, 18,..) - anogenitální nádory,
nádory ústní dutiny, bradavice
• Lidský herpesvirus typu 8 (HHV8) - Kaposiho sarkom (KS)
Onkogenní viry a lidské nádory
RNA viry:
Obecně: nepotvrdila se myšlenka, že retroviry způsobují mnoho různých
nádorů, ale jejich studium přineslo mnoho vhledů do podstaty
kancerogeneze
(1) Akutně transformující, (2) pomalu a transformující a
(3) Lidský lymfotropní virus typu I (HTLV-1) - T-leukémie (lymfom)
dospělých (ATTL).
• Infikováno asi 1% obyvatel Kyushu (jižní ostrov Japonska) a méně někteří
obyvatelé Karibiku.
• Infekce se přenáší z matky na dítě (asi mlékem) a představuje asi 3-4%
celoživotní riziko vývoje T-buněčné leukémie.
• Určitě se neuplatňuje mechanismus inserční mutageneze (pomalu
transf.r.). Virový gen tax je odpovědný za aktivaci transkripce
provirových DNA sekvencí a pravděpodobně aktivuje také 2 buněčné
geny: IL-2 (interleukin2) a GM-CSF („granulocyte macrophage colonystimulating
factor“). Pravděpodobně stimulace těmito faktory stojí na
počátku neoplasie T buněk.
Úloha infekčních agens v
kancerogenezi
Infekční agens souvisí asi s 1/5 všech úmrtí způsobených
nádorem:
• 9% - světová mortalita na ca žaludku: spojeno s dlouhodobou
infekcí Helicobacter pylori
• 6% - světová mortalita na hepatom: spojeno s chronickou
hepatitidou B a C (HBV, HCV)
• 5% - světová mortalita na ca děložního čípku: spojeno s
infekcí HPV
Incidence nádorů v různých populacích
Incidence nádorů
Různá v různých zemích, etnických skupinách:
• Některé nádory vznikají náhodou, objevují se ve srovnatelné
frekvenci v různých populacích. Např. pediatrické nádory.
• Roli může hrát dědičnost: různé populace nesou alely s dispozicí k
nádorům s různou frekvencí.
• Prostředí: voda, dieta, vzduch, reprodukční chování, kouření,..
- Japonci přestěhovaní do Ameriky: Japonsko 6-8x vyšší incidence
nádorů žaludku, příští generace již srovnatelná incidence.
- Zhruba od 1950 pozorována až 20x vyšší pravděpodobnost
výskytu rakoviny plic u těžkých kuřáků.
- Adventisté sedmého dne: asi poloviční výskyt nádorů oproti
ostatní americké populaci (⇐ zákaz kouření, alkoholu, masa).
⇒ Pouze změnou životního stylu by bylo možné snížit výrazně
incidenci nádorů.
Závěrečné poznámky „Úvodu“
• Geny nemají výlučnou funkci v jediném procesu v buňce
(buněčný cyklus vs. apoptóza vs. genomová stabilita vs. …).
• Jenom omezený počet signálních drah je inaktivován téměř
univerzálně u většiny nádorů (RB, p53).
• Jednotlivé signální dráhy jsou většinou postižené v jediné své
složce → tzv. princip exkluzivity.
• Existují „párové mutace“: mutace příčinná a mutace
navozující toleranci k příčinné mutaci (zajišťující přežití).
(→ tzv. princip „just right“).
• Existují specifické nebo preferované kombinace změn v
nádorových buňkách?
Program přednášky
• Úvod - základní pojmy, historický přehled,
klasifikace nádorů, onkogenní viry (1)
• Některé signální dráhy (protoonkogeny): regulace
buněčného cyklu, mitogenní a antimitogenní
signalizace (2 I, 2 II)
• Genetické dispozice k nádorům (nádorové
supresory): základní přehled syndromů spojených
se zvýšeným výskytem nádorů (3, 4)
• Genetická nestabilita nádorů (5)
Program přednášky
• Apoptóza (6)
• Telomery a telomeráza (7)
• Angiogeneze (8)
• Tvorba metastáz (9)
• Epigenetika nádorů (10)
• („Novinky“: epiteliální-mesenchymální transice 11,
úloha kmenových buněk v kancerogenezi 12,..)
• („Přesahy“)