Molekulární biologie
nádorů
Prof. RNDr. Jana Šmardová, CSc.
Ústav patologie, FN Brno
Přírodovědecká fakulta MU Brno
Lékařská fakulta MU Brno
2011
2.Mitogenní signalizace
II
Sítě onkoproteinů II
Protoonkoprotein Src - pp60c-src
• První popsaný buněčný analog virového onkoproteinu v-Src,
obsaženého ve viru Rousova sarkomu (1909 - Peyton Rous) - pp60v-
src.
První objevený protoonkogen, ale až v roce 1999 (tedy po více než
25 letech!) nalezeny mutantní varianty (asi u 12% pokročilých CRC)
• Nereceptorová (cytoplazmatická) tyrozinová proteinkináza,
přenašeč signálu.
• Účastní se řízení řady buněčných procesů jako proliferace,
diferenciace, pohyb, adheze.
• Normálně je v inaktivním stavu, může být přechodně aktivován,
např. během mitózy.
• Je asociován s buněčnými membránami, především s plazmatickou
membránou a endozomální membránou.
• Rodina Src má mnoho členů: Fyn, Yes, Lck, Hck, Blk, Fgr, Lyn, Yrk.
Struktura c-Src
• Molekula c-Src má 536 AA (pp60).
• N-konec je modifikován myristylátem.
• Následují domény SH3, SH2 a SH2 linker
• Dvě hlavní fosforylační místa:
1. Tyr 530 (527) negativní regulační místo na C-konci
2. Tyr 419 (416) pozitivní autoregulační místo v katalytické
doméně
Vsuvka: myristylace
• posttranslační modifikace
• připojení zbytku nenasycené mastné kyseliny
CH3-(CH2)12-COOH
• tato modifikace umožňuje ukotvení proteinů na
buněčných membránách
Regulace c-Src fosforylací
Hlavním regulačním místem na molekule Src je
Tyr(530/527): Je-li fosforylován, interaguje s
SH2 doménou Src, a tak inhibuje
tyrozinproteinkinázovou aktivitu Src.
Tyr(419/416) se nachází v katalytické doméně. Jeho
fosforylací je umožněn přístup Src k jeho
substrátům.
Na molekule Src další fosforylační místa (např.
Thr34, Thr46, Ser72, a další), ale mají menší
význam.
Aktivace c-Src
V inaktivním stavu (Tyr 530/527 fosforylován) je
vytvořena interakce mezi C-koncem a SH2
doménou a dále mezi SH3 doménou a SH2
linkerem, Tyr 419/416 obvykle defosforylován.
1. Defosforylace Tyr 530/527 způsobí uvolnění
interakcí C-konce s doménou SH2 a Tyr 419/416
může být autofosforylován, a tím aktivován.
2. Vazba Src (doménou SH2) na fosforylovaný RTK
uvolňuje interakci C-konce a umožňuje fosforylaci
Tyr 419/416 a tím aktivaci Src.
Dále vliv celé řady kináz a fosfatáz, které mohou
fosforylovat a defosforylovat Src.
Aktivace c-Src
Porovnání struktury kuřecího c-Src a RSV
v-Src
• Několik jednoaminokyselinových záměn.
• 19 C-koncových AA c-Src je nahrazeno jinými 12
AA.
Regulace c-Src interakcemi s dalšími
proteiny
PDGF a FAK interagují s SH2 doménou, a tak Src
aktivují.
FAK vedle vlastní aktivace Src také reguluje jeho
lokalizaci - přivádí ho do fokálních adhezí, kde Src
dále fosforyluje FAK, zvyšuje jeho aktivitu a
následuje aktivace Ras/MEK/ERK dráhy.
Nef a Sin interagují s SH3 doménou, a tak aktivují
některé členy rodiny Src.
Popsána řada kináz, které specificky fosforylují Src
a řada fosfatáz, které specificky defosforylují
Src.
Regulace c-Src buněčnou lokalizací
Src asociuje s buněčnými membránami: částečně
díky myristylátu na N-konci, a dále
zprostředkováno některými sekvencemi AA na N-
konci.
Lokalizace ovlivňuje funkci Src:
• Plazmatická membrána (fokální adheze,
cytoskeleton, místa mezibuněčných kontaktů,...) mitogenní
signalizace přes RTKs a GPCRs; adheze
buněk, migrace, mezibuněčné kontakty.
• Cytoplazma a perinukleární prostor (Golgi,
endozomy, synaptické vezikuly,...) - transport
proteinů, progrese buněčného cyklu.
• Jádro - regulace buněčného cyklu.
c-Src a nádory
Hladina proteinu a ještě více aktivita Src jsou často
zvýšeny v nádorových buňkách ve srovnání s normálními
buňkami a tyto hladiny rostou se stupněm malignity.
Aktivita kinázy Src je zvýšena 4-20x u nádorů prsu
oproti normálním tkáním. Jeden z možných mechanismů
tohoto zvýšení souvisí s aktivitou fosfatázy
defosforylující Tyr530 . U nádoru prsu se Src nachází
převážně v perinukleárním prostoru, zatímco v
normálních tkáních je pravidelněji v celé cytoplazmě.
U většiny kolorektálních nádorů je aktivita Src zvýšena
5-8x, je to spíše časná událost (i v premaligních
stádiích) a se zvyšujícím se stádiem se zvyšuje aktivita
Src (zřejmá souvislost také s lokalizací metastáz).
Úloha onkoproteinu Src v kancerogenezi
Protoonkoprotein Myc
Myc je jaderný fosfoprotein (430 AA) s mnoha znaky
transkripčního faktoru.
Původně popsán jako buněčný homolog v-myc viru
ptačí myelocytomatózy
Do rodiny proteinů Myc patří tři odlišné proteiny,
které se uplatňují v kancerogenezi: c-Myc, N-Myc
a L-Myc.
Pro úspěšnou transformaci většiny buněk potřebuje
onkogen myc kooperaci s dalším onkogenem (např.
ras).
Struktura proteinu Myc
Pro biologickou funkci Myc jsou nezbytné vysoce
konzervované oblasti na N-konci MBI a MBII
(„Myc Boxes I a II“), na C-konci bazická oblast (b)
a motivy HLH („helix-loop-helix“) a LZ („leucine
zipper“) - bHLHZ.
Myc patří mezi tzv. proteiny bHLH : typicky tvoří
homodimery a heterodimery. Na DNA - v
promotorech svých cílových genů – rozpoznávají
tzv. E boxy (obsahující sekvenci CACGTG).
bHLHZ - zajišťuje vazbu na DNA a proteinproteinové
interakce (včetně dimerizace s Max),
MBI a II - transaktivaci a obsahuje řadu
fosforylačních míst.
Struktura proteinu Myc
• transaktivační doména • DNA vazebná doména
• dimerizační doména
Mutace ovlivňující fosforylační místa (především threonin 58) zvyšují
transformační potenciál Myc a byly nalezeny u některých nádorů.
Fosforylace T58 vede k degradaci Myc proteazomem ⇒ mutace T58
zvyšuje hladinu Myc.
Myc/Max jako transaktivátor
• Myc tvoří heterodimery s proteinem Max.
Ty potom fungují jako TF a aktivují
transkripci svých cílových genů, které
posilují proliferaci.
• Hladina Myc je silně potencována
mitogenními signály, zatímco hladina Max
je relativně konstantní.
• Transaktivace cílových genů dimerem
Myc/Max dále regulována proteiny, které
se váží na N-konec proteinu Myc: BIN-1,
TRRAP. TRRAP zprostředkovává asociaci
Myc s proteiny zajišťujícími acetylaci
histonů.
Max/Mad
• Protein Mad (také z
rodiny bHLH)
kompetuje s Myc o
Max. Mad/Max tvoří
represor, a tak
negativně ovlivňuje
transkripci cílových
genů.
• Proteiny rodiny Mad
nejen nahrazují v
dimeru Myc, ale
přivádějí k
promotorům komplex
Sin3/HDAC a tak je
aktivně reprimují.
• S úbytkem proliferace ubývá Myc a přibývá Mad.
Myc jako transaktivátor
Cílové geny dimeru Myc/Max se podílejí na řízení buněčné
proliferace:
• gen pro cyklin D2 (CND2)
• gen pro CDK4
• Cul1, který následně degraduje p27Kip1
Myc indukuje expresi E2F1, E2F2 a E2F3
Myc/Max indukuje aktivitu telomerázy transaktivací katalytické
podjednotky hTERT
Myc/Max indukuje expresi Bim; Bim váže a tím inaktivuje Bcl-2
(⇒ wt Myc indukuje apoptózu)
Myc jako represor
K C-konci Myc se mohou vázat další
proteiny ovlivňující vazbu na DNA, jako
např. Miz-1.
• Geny uplatňující se při zastavení
buněčného cyklu p15INK4B a p21WAF1.
• Zpětnovazebnou regulací Myc reprimuje
vlastní expresi.
• Geny uplatňující se v buněčné adhezi integriny
ααααLββββ2 a αααα3ββββ1.
• Geny specifické pro diferenciaci mim-1,
lysosyme a C/EBPαααα.
Myc reguluje progresi G1-S aktivací i
represí
Aktivace cyklinu D2 a CDK4
Represe p15 a p21
Vliv Myc na
buněčný cyklus
• Dimer Myc-Max indukuje expresi
cyklinu D2 a CDK4 → ↑↑↑↑BC (G1)
• Dimer Myc-Mac indukuje expresi
Cul1, který zprostředkovává
degradaci p27 → ↑↑↑↑BC (G1)
• Dimer Myc-Max indukuje expresi
E2Fs → ↑↑↑↑BC (S)
• Dimer Myc-Miz-1 reprimuje
expresi p15, p21 a p27 → ↑↑↑↑BC (G1)
Myc a nádory
Do rodiny proteinů Myc patří tři odlišné proteiny:
c-Myc, N-Myc a L-Myc.
Jsou si podobné svou strukturou a mechanismem
účinku.
Výrazně se liší expresí během vývoje a také se zdá,
že ovlivňují - i ve stejném buněčném kontextu jiné
sady genů, participují - i ve stejných
buněčných typech - na jiných buněčných
programech.
Liší se významně také svou úlohou ve vývoji
jednotlivých typů neoplastických onemocnění.
c-myc a nádory
Burkittův lymfom:
Téměř všechny případy Burkittova lymfomu souvisí s translokací
genu c-myc (na chromozomu 8) buď s těžkým řetězcem µ
nebo λ nebo lehkým řetězcem κ imunoglobulinů (na
chromozomech 14, 22 a 2).
c-myc a nádory
Ostatní lymfomy:
• Low-grade folikulární lymfom je většinou spojen s
translokací Ig/Bcl-2, jen vzácně lze detekovat
přestavby c-myc. 60-80% těchto lymfomů
transformuje v agresivnější formu a u těch už jsou
detekovány i přestavby Ig/c-myc.
• Difúzní velkobuněčné lymfomy B-buněk jsou
heterogenní a asi u 50% lze detekovat translokaci
Ig buď s BCL2, BCL6 nebo c-myc.
c-myc a nádory
Solidní nádory:
Amplifikace a/nebo zvýšená exprese c-myc se
vyskytuje u významného podílu invazivních
duktálních karcinomů prsu (spojeno s horší
prognózou), u některých nádorů prostaty, u
gastrointestinálních nádorů (souvislost cmyc:APC:β-katenin:
jaderný β-katenin slouží jako
koaktivátor TF Tcf-4, který transaktivuje c-myc),
u některých melanomů a u mnohočetného myelomu
(koreluje s agresivitou onemocnění).
N-myc a nádory
Amplifikace N-myc se vyskytuje asi u 30% (až 40% pokročilých)
případů neuroblastomu (tumor periferního NS) a je spojena s
horší prognózou onemocnění. Některé nádory mají 10 až 30 kopií
genu N-myc, jiné až 100-150 kopií (žlutě značená sonda FISH).
Zvýšená exprese N-myc byla popsána u významného podílu případů
malobuněčného nádoru plic a u menšího počtu případů medulárního
tyroidního nádoru, retinoblastomu, rhabdomyosarkomu a
astrocytomů.
L-myc a nádory
Amplifikace a zvýšená exprese L-myc (a také c-myc a N-myc)
byla pozorována u některých případů malobuněčného
karcinomu plic.
Konec