Molekulární biologie nádorů Prof. RNDr. Jana Šmardová, CSc. Ústav patologie, FN Brno Přírodovědecká fakulta MU Brno Lékařská fakulta MU Brno 2011 5. Genetická nestabilita nádorů Šest získaných vlastností maligního nádoru získaná schopnost příklad Soběstačnost v produkci růstových signálů aktivace H-ras Necitlivost k signálům zastavujícím b.c. ztráta RB Poškození apoptózy produkce IGF Neomezený replikační potenciál aktivace telomerázy Posílení angiogeneze produkce VEGF Tvorba metastáz inaktivace E-kadherinu Nestabilita genomu jako podmínka akumulace všech nutných změn. Bariéry chránící mnohobuněčný organismus před transformací/kancerogenezí • Omezený replikační potenciál • Neustálá připravenost ke vstupu do apoptózy... • Nejspolehlivější zábranou proti vývoji nádoru je stabilita DNA: DNA je nejstabilnější molekula v buňce. - Co u organismu zvyšuje „šanci" na vznik nádorů? • celkový počet buněk v organismu • doba života • metabolická rychlost genetická nestabilita nádorů Nádory vznikají postupnou akumulací genetických (a epigenetických) změn genů, které řídí buněčné dělení, buněčnou smrt a další důležité proceSy v buňce. Z výpočtu, který vycházel ze známé mutační rychlosti v somatických buňkách (10-6 na gen na generaci buněk), se zdálo, že k takové akumulaci mutací nemůže během lidského života dojít. Jakým mechanismem dochází k této akumulaci? • K akumulaci stačí normální rychlost mutací ve spojení s vlnami klonální expanze, které mohou být způsobeny pozitivní selekcí buněk "prenádorových". • Akumulace všech nutných mutací umožněna genetickou nestabilitou (tzv. „mutator hypothesis"). Nestabilita je záležitost rychlosti, s jakou k mutacím dochází, existence mutací sama o sobě neposkytuje žádnou informaci o tom, s jakou rychlostí se objevila. Většina nádorů je geneticky nestabilních. Typy genetických změn v nádorech 1. Menší změny v sekvenci DNA - missense mutace, menší delece a inzerce (např. missense mutace K-rasse vyskytuje u 80% nádorů pankreatu, Ppřevážně missense mutace p53 u téměř poloviny všech nádorů,..) 2. Změny v počtu chromozomů - ztráty případně zisky celých chromozomů (ztráta chromozomu 10 u glioblastomů spojena se ztrátou nádorového supresoru PTEN; získání chromozomu 7 u papilárních renálních karcinomů spojeno s duplikací mutantního onkogenu c-met) 3. Chromozomální translokace - fúze částí odlišných chromozomů nebo normálně nesouvisejících částí téhož chromozomu (na molekulární úrovni může být doprovázeno fúzemi mezi dvěma odlišnými geny) (Philadelphský chromozom a další translokace typické pro řadu leukémií a ly^mů) 4. Amplifikace genů (amplifikace genu N-mycu 30% neuroblastomů) • Ke genetické nestabilitě dochází na více úrovních. Míra genetické nestability Absence genetické nestability nedovolí dostatečnému množství buněk přejít přes první selekční bariéru na mnohostupňové cestě k malignímu fenotypu. Příliš velká míra nestability vede k rozsáhlým poškozením DNA a následně aktivuje apoptózu. Podobné závěry byly učiněny u baktérií při studiu fitness (reprodukční způsobilosti): musí být nastolena rovnováha mezi pozitivním a negativním dopadem genetické variability (zajištěné mutacemi): variabilita musí být dostatečná, aby bakterie byly schopny přežít v selektivním prostředí, ale nesmí ohrožovat životaschopnost buněk. • Zřejmě platí model „just-rightinstability." Rozsah genetické nestability se v průběhu vývoje nádorů zvyšuje. 1. Nestabilita v sekvenci DNA Tento typ nestability je u lidských nádorů vzácnější, ale když se vyskytne, má dramatické následky. Zdrojem nepřesností při replikaci DNA jsou chyby vzniklé při DNA polymeraci (tj. kvalitaa DNA polymeráz a souvisejících „proofreadingových" procesů) a chyby v systémech oprav DNA. U nádorů nebyly prokázány defekty v DNA polymerázách, aieTylyTrokázány defekty ve dvou hlavních systémech oprav DnA 1. Nukleotidová excizní oprava („nucleotide-excision repair" -NER) - s ní spojená nestabilita („NER-associated instability" - NIN) 2. Oprava chybného párování („mismatch repair" - MMR) - s ní spPojená mikrosatelitová nestabilita (MIN) Nukleotidová excizní oprava - NER X Oprava špatného párování - MMR Lynchův syndrom Mutace MMR jsou recesivní, tzn. jedna "funkční" alela je dostatečná k udržení normální hladiny MMR, teprve po inaktivaci druhé alely příslušného MMR genu se začnou kumulovat mutace. Nositelé jedné mutantní alely v zárodečných buňkách jsou disponováni k vývoji nádorů x heterozygoti v genech NER nenesou zvýšené riziko vývoje nádorů!! (to souvisí s tím, že ani mutace ve druhé alele genu NER nemusí způsobit zvýšení rychlosti akumulace mutací, k tomu je nezbytné ještě působení vnějšího mutagenu, např. UV) 2. Nestabilita v počtu chromozomu - CIN Ve srovnání s NIN a MIN jsou ztráty nebo zmnožení celých chromozomů mnohem běžnější a vyskytují se téměř u většiny nádorů - např. 85% kolorektálních nádorů je vysoce aneuploidních. Běžná je ztráta chromozomu související s LOH, často je doprovázena získáním opačného chromozomu. => Ne vždy změny karvotypu souvisejí s CIN!-- U kolorektálních a endometriálních nádorů platí inverzní vztah mezi MIN a CIN: nádory, které vykazují defekty v MMR, jsou diploidní a mají také normální rychlost výskytu rozsáhlých chromozomálních změn, zatímco nádory bez MMR jsou často aneuploidní a vykazují zvýšenou rychlo* hromadění těchto změn. => Alespoň u kolorektálních nádorů jsou MIN a CIN ekvivalentní mechanismy z hlediska navození genetické nestability^- Oba typy nestability se objevují spíše v ranných fázích vývoje nádoru a během dalšího vývoje nádoru se hromadí genetické změny jako následek této nestability. Vztah mezi MIN a CIN: Fúzí buněk s CIN a MIN vznikají buňky vykazující CIN: „CIN buněk" Fenotyp CIN je dominantní: možná7 Souvisí s „gain-of-function" mutací; naznačuje to také, že možná stačí „single mutational hit" k vývoji CIN fenotypu Molekulární podstata CIN U kvasinek může CIN způsobit až 100 různých mutací: geny související s kondenzací chromozomů, s kohezí sesterských chromatid, se strukturou kinetochorů, se strukturou a funkcí centrozomů a mikrotubulů,... Během buněčného cyklu se vyskytuje několik kontrolních bodů, které monitorují správný postup buněčného dělení a zajišťují, aby před vstupem buněčného cyklu do další fáze byly předchozí fáze zcela a bezchybně skončeny. Zatím chybí jednoznačná kriteria k určení genů odpovědných za CIN a k určení jejich „míry zodpovědnosti". Některé kontrolní body mitózy (buněčného cyklu) A. Pozastavení vstupu do mitózy při poškození DNA B. Pozastavení kondenzace chromozomů při poškození mikrotubulů C. Pozastavení separace chromatid při nesprávném připevnění chromozomů D. Pozastavení vytvoření dceřinných buněk při nesprávné orientaci vřeténka Bod restrikce vs. kontrolní body bod restrikce: proliferation quiscence (resting state) differentiation senescence cell death bod restrikce vs. kontrolní bod - V bodě restrikce se dá skutečně buněčný cyklus zastavit - V kontrolním bodě se buněčný cyklus pouze pozastaví □ Full repair vs. adaptation to DNA damage Současné dogma: full repair Now model: timing and adaptation (ubikvitinace vs. fosforylace) Concept of treshold Buňka má jakýsi timer (PLK?); pokud se poškození neopraví včas, buňka se adapTule~a jede dál ® mitóZa: ® mitotická katastrofa ® ... Kontrola mitotického vřeténka 1902 (!!) hypotéza Theodora Boveriho: „Aneuploidie vyvolává tvorbu nádorů". Nádory jsou často aneuploidní. Kontrola mitotického vřeténka Tento kontrolní bod („mitotic checkpoint" nebo „spindle checkpoint" nebo „spindle assembly checkpoint") zajišťuje přesnou segregaci Chromozomů: tím, že zajišťuje, aby s°e sesterské chrÔmatidy nerozcházely dříve, než jsou všechny chromozomy správně uspořádány kolem mitotického vřeténka. Zajištěno uspořádáním chromozomů/sesterských chromatid na bipolárním mitotickém vřeténku. Chromozomy jsou připojeny pomocí kinetochorů: proteinové struktury, které se sestavují a rozpadají při každé mitóze v místě centromerické DNA. Nepřipojené kinetochory vytvářejí komplex, který produkuje signál „počkat s anafází!" („wait anaphase signal"), který pozastavuje ireversibilní separaci chromatid,dokud nejsou připojeny všechny kinetochory. Kontrola mitotického vřeténka a. Profáze: začíná se tvořit vřeténko ve formě mikrotubul organizovaných centrozomy na pólech buňky b. Metafáze: vřeténko je vytvořeno a chromozomy se začínají připevňovat k vřeténku v oblastech nazývaných kinetochory c. Anafáze: chromozomy se pohybují se zkracujícími se mikrotubuly směrem k pólům buňky, kinetochory napřed. Kontrola mitotického vřeténka Buňky s poškozenou kontrolou vřeténka se chovají typicky při použití vřeténkových jedů (nocodazol poškozuje mikrotubuly; odlišným mechanismem blokuje mikrotubuly colcemid). Zatímco působení těchto látek vyvolá u nepoškozených buněk blok buněčného cyklu, poškozené buňky pokračují v mitóze. Při segregaci chromozomů před připojením obou sesterských chromatid k vřeténku může dojít bUď ke ztrátě nepřipojené chromatidy (ztráta chromozomu 1:0) nebo k segregaci obou chromatid do jedné dceřinné buňky (nondisjunkce 2:0). Kontrola mitotického vřeténka Jak je monitorováno sestavování vřeténka? Na nesprávné sestavení vřeténka reagují proteiny typu Bub a Mad a nedovolí aktivaci APC (APC/C). Kontrola mitotického vřeténka strsZM^ proteinu sekurin který je ^^^^ deficient"), Mad2 na kinetochory nepřipevněné na mitotické vřeténko. Zde jsou konvertovány na inhibitory proteinu CDC2G, který se podílí na aktivaci APC/C. Je nezbytný pro specifickou vazbu na sekurin a cyklin B. Po připojení všech kinetochorů je signál utlumen a APC/C ubikvitinuje a degraduje sekurin... Kontrola mitotického vřeténka Během prometafáze nepřipojené chromatidy vyvolávají signál, který zastavuje progresi do anafáze: tento signál je zprostředkován proteiny CENPE a Mad/Bub a způsobuje inhibici komplexu APC/C - CDC20. Kontrola mitotického vřeténka Sekurin zabraňuje separaci sesterských chromatid, a to vazbou na separin/separázu, což je cysteinová proteáza, která katalyzuje štěpení multiproteinového komplexu kohesin. Kohesinové můstky se tvoří okamžitě po^ replikaci chromatid v S fázi, spojují sesterské chromatidy a zůstávají až do jejich separace v anafázi. Sekurin funguje jako inhibitor separinové proteázy. Aktivace APC/C při přechodu metafáze - anafáze spouští degradaci sekurinu a uvolnění separinu. Aktivní separin spouští degradaci kohesinu a umožní tak separaci sesterských chromatid. Kontrola mitotického vřeténka Sekurin má ještě další roli: mutace sekurinu má za následek, že vůbec nedojde k separaci chromatid! Sekurin je nezbytný ke správné lokalizaci a/nebo aktivaci separinu => dvojité" spojení vazby sekurin:separin - sekurin je nutný k aktivaci separinu a zároveň funguje jako jeho inhibitor = dvojité zabezpečení toho, že chromatidy neseoreouií nes^ráv^!! Model interakce separin - sekurin Sekurin funguje pro separin jako chaperon - jen tak může separin dosáhnout aktivní konformace. Pro proteázovou aktivitu separinu je nezbytná interakce jejího N- konce s proteázovou doménou: sekurin interaguje s oběma doménami, a tak zabraňuje jejich vzájemné interakci. Zabraňuje také interakci se substrátem (Scc1 je podjednotka kohesinu). Kontrola mitotického vřeténka Po připojení posledního kinetochoru k vřeténku se APC/C - CDC20 stává aktivní, sekurin je degradován a uvolňuje proteázu separin. Ta rozštěpí kohesin, který spojoval sesterské chromatidy a ty se mohou začít pohybovat směrem k pólům. Kontrola mitotického vřeténka Wild-lypa^lls ÉV1AD2 miibits APCft: APC/C actrvo Equal segregation äecurifi nol (Jegracted Secure degraded d sister chromatids Sepa/in praiea&ů inaäwe Sepsán praleaw active aianaptiĚse V nepoškozené buňce je normální segregace sesterských chromatid zajištěna regulací in^b^/aktivace komplexu APC/C . Kontrola mitotického vřeténka V buňce s oslabenou funkcí (heterozygot!!) proteinu Mad2 není dostatečná inhibice APC/C, a tak dochází k předčasné destrukci separinu a předčasné separaci sesterských chromatid. Kontrola mitotického vřeténka Ji Securirr1' cel r& MA02 iíviibiis AFC/C APOD active, Non disju ncticn of Secu m absent but sepaiin prataas? sisľier c*rornaiiíds anaphase Buňky, které nemají sekurin, nemají aktivován separin. Nemůže u nich proto dojít k dostatečné degradaci kohesinu a k úspěšné segregaci sesterských chromatid. Kontrola mitotického vřeténka Snížená exprese hMad2 byla pozorována u některých nádorů pravděpodžujeěseplatrsoev;sechanísmiosd;ap^uftcience2 se Malá frakce kolorektáních nádorů má somatické mutace buď v^genu hBu b1 nebo hBubR1. Mutace hBubl mají dominantní Protein hMad1 je napadán proteinem Tax, produktem T-cell leukaemia viru typu 1: tato vazba má za následek vyřazení „spindle checkpoint" u indukovaných leukémií. některých nádorů (nadbytek sekurinu pravděpodobně inhibuje segregaci chromatid). Vztah APC k CIN Vrozené mutace APC („adenomatous polyposis coli") způsobují FAP („familial adenomatous polyposis"), somatické mutace patří k nejčastějším a nejrannějším metacím kolorektálních karcinomů. APC má dvě funkce: 1. WNT signalizace zprostředkovaná vazbou na p-katenin - mezi cílové geny této dráhy patří Myc a Cyclin D1, které zřetelně souvisejí s tvorbou nádorů (=* zvýšení proliferace) 2. APC je lokalizován prostřednictvím vazby svým C-koncem na EB1 - na kinetochorech metafazických chromozomů, kde zprostředkovává vazbu mikrotubulů vřeténka ke kinetochoru; mutanti APC (zkrácené proteiny) tuto vazbu nemohou zprostředkovat, a tak je vazba mezi vřeténkem a kinetochory poškozena (=* zvýšení CIN) [v buňkách Apc/- se navíc objevují násobné centromery, které způsobují zvýšený výskyt chromozomálních translokací] Dvojí úloha proteinu APC v buňce: A. Regulace hladiny volného p-kateninu B. Úloha APC při tvorbě mitotického vřeténka a. U buněk s funkčním APC se APC akumuluje na kinetochorech, kde se účastní vazby mikrotubulů vřeténka ke kinetochoru prostřednictvím vazby s proteinem EB1, který asociuje s mikrotubuly; b. U buněk se zkráceným APC je vazba mezi kinetochorem a mikrotubuly vřeténka zničená, což navozuje CIN Vztah APC k CIN Kolorektální karcinomy bez mutace APC, ale s mutací B-kateninu neprogreduji zdaleka tak rychle jako nádory s mutací kadľrrseumpoaňujeekztnáta cxpoanncze' APfeé- vývoje zpSeobiíjecířm íkffiídř* nádorových supresorů Násobné centrozomy • Přítomnost více než dvou centrozomů v buňce vede k tvorbě defektního mitotického vřeténka (vytváří se více pólů), což způsobuje navýšení chyb v segregaci chromozomů => to vede ke zvýšení genetické nestability Centrozomy denzní matrix proteinů, Seřícenn4iolární Fungují jako ^Fpirákrotubul Centrioies PCM Cyklus duplikace centrozom Na konci mitózy každá dceřinná buňka zdědí jeden centrozom, během následujícího cyklu se musí centrozom duplikovat. Duplikace začíná v pozdní Gl/časné S fázi ^ přechodu bodem restrikce!) Dceřinné centrioly (procentrioly) se tvoří v blízkosti existující centrioly, dorůstají během S a G2 fáze. Mechanismy vzniku násobných 1. Deregulace kontrolních bodů duplikace centrozomů-- • kontrola iniciace duplikace centrozomů • suprese re-duplikace centrozomů 2. Neproběhnutí cytokineze 3. Nekontrolovaná separace centriolového páru 4. Zvýšená exprese některé složky PCM a vytvoření acentriolárního centrozomu Mechanismy vzniku násobných (A) Multiple duplication of centrosomes within a single cell cyele (D) Ov e rex p res si on of certain PCM components formation of acentrioiar MTOCs Abnormální centrozomy u nádoru • Násobné centrozomy jako příčina aneuploidie byly pozorovány u nádorů prsu, Plic, prostaty, střeva, nádoru mozku a dalších" - - • Co může být špatně: centrozomy větší než normál; centrozomy obsahují více než 4centrioly; více než dva centrozomy v buňce; navýšení pericentriolárního materiálu; abnormální orientace centriol; změněná polarita umístění centrozomů v buňce. Regulace duplikace centrozomů Při regulaci duplikace centrozomů je klíčová role Cdk2/cyklinu E - přes tento komplex je provázána regulace buněčného cyklu a duplikace centrozomů. Při separaci centriol je substrátem Cdk2/cyklin E nucleophosmin, který je asociován s neduplikovanými centrozomy a disociuje po fosforylaci Cdk2/cyklin E. U některých nádorů prsu, hlavy a krku a prostaty koreluje výskyt mutaceo p53 s výskytem amplifikace centrozomů (možné spojení přes p21Waf-1 - inhibitor Cdk2/cyklinu E). Regulace duplikace centrozomu • Lidský homolog genu drozofily aurora2/STK-15 (BTAK/STK-15) ovlivňuje sestavení centrozomů a segregaci chromozomů a je vysoce exprimován, případně amplifikován u některých nádorů. • V některých nádorech je také silně exprimována kináza PLK1 (Polo-like kinase), jejíž funkce je spojena s centrozomy a která je podobná proteinu aurora2/STK15. 3. Chromozomální translokace A. komplexní typ Vyskytuje se často u solidních nádorů. Pozorované translokace jsou individuální, téměř nahodilé, nepodobné mezi nádory téhož histologického subtypu. Velké části chromozomů bývají deletovány, lze pozorovat "marker chromosomes" obsahující složitá přeskupení mnoha různých chromozomů. Mohou často vést ke ztrátám a ziskům chromozomů podobně jako CIN, ale navíc dochází také ke vzniku nových genových produktů. - Molekulární podstata není známa, jedna z možností je, že translokace vznikají jako následek vstupu buňky do mitózy bez toho, že by byly odstraněny dvouřetězcové zlomy. Proto kandidátními geny jsou: ATM, ATR, BRCA1, BRCA2, p53. B. Jednoduchý typ Je charakterizován jako specifická přestavba chromozomálního segmentu ve specifickém typu nádoru. Typicky se tento jednoduchý typ translokace vyskytuje u Unií a lymfomů, u některých sarkomů a vzácněji u dalších typů nádorů Většinou bývá tento typ translokace tak charakteristický, že ho lze použít ke klasifikaci onemocnění. Specifické translokace také mohou vzniknout jako následek ionizujícího záření. Např. v nádorech štítné žlázy u dětí z oblastí kolem Černobylu se často vyskytuje translokace na chromozomu 10, která vede k tvorbě fúzního genu zahrnujícího RET. Na molekulární úrovni bývá translokace zmapována a určena do relativně malé oblasti na DNA. Tyto specifické translokace ovšem nebývají spojeny s genetickou nestabilitou, spíše představují aberaci normálního procesu rekombinace, který" se podílí na přeskupování subgeenů při tvorbě protilátek. 4. Amplifikace genu Objevuje se u některých typů nádorů vyšších stádií a bývá podstatou rezistence k chemoterapeutikům. Nejčastěji amplifikované geny jsou N-myc, erb a ras, vzácněji abl myb MET, GtIÍ, ets, hst Obecně se amplifikace objevují v pozdních stádiích maligní transformace, jsou spojeny s agresivně rostoucími nádory a signalizují nepříznivý prognostický vývoj. Kvantitativní hodnocení ukázalo, že amplifikace jsou častější u nádorových buněk než u buněk normálních, přesný mechanismus ale není znám. Amplifikace genů Zdá se, že amplifikace se objevují snadněji u buněk s inaktivovaným p53. Podle jedné z možností není rozdíl ve frekvenci výskytu amplifikací, ale spíše ve schopnosti buněk p53-/- amplifikace genů přežít. V noímálních buňkách je přítomnost amplikonu signálem poškození DNA a navození p53 dependentní apoptózy. poškození p53 by tak buňka mohla přeežít a akumulovat další typy amplifikací během další mitózy. Tento model definuje specifickou "amplifikační nestabilitu" odlišnou od CIN. V této souvislosti představují specifickou skupinu amplifikace MDM2, které samy o sobě inaktivují p53. Kriticky krátké telomery a genetická nestabilita Souvislost genetické nestability a vnějšího prostředí Souvislost genetické nestability a vnějšího prostředí