Molekulární biologie nádorů Prof. RNDr. Jana Šmardová, CSc. Ústav patologie, FN Brno Přírodovědecká fakulta MU Brno Lékařská fakulta MU Brno 2011 ó. Apoptóza a nádory Šest získaných vlastností maligního nádoru získaná schopnost příklad (g Soběstačnost v produkci růstových signálů aktivace H-ras [j Necitlivost k signálům zastavujícím b.c. ztráta RB HU Poškození apoptózy produkce IGF Neomezený replikační potenciál aktivace telomerázy Úl Posílení angiogeneze produkce VEGF Tvorba metastáz inaktivace E-kadherinu Nestabilita genomu jako podmínka akumulace všech nutných změn. Bunečná smrt a vývoj nádoru • Rychlost růstu tkání je určována na jedné straně rychlostí bunečného delení a na straně druhé rychlostí buněčné smrti. • Při homeostáze jsou oba procesy v rovnováze. • U nádoru je rovnováha mezi buněčným dělením a buněčnou smrtí porušena. Nádory: buněčná smrt a homeostáze Apoptózo a nekróza Nekrózo: • týká se skupiny postižených buněk • vyvolána nefyziologickým poškozením (virová infekce, hypotermie, hypoxie, metabolické jedy, ..) • fagocytóza makrofágy • významná zánětlivá reakce Apoptóza - programovaná buněčná smrt: • postihuje jednotlivé buňky • indukována fyziologickými stimuly (nedostatek růstových faktorů, změny hormonálních hladin, ..) • fagocytóza okolních buněk nebo makrofágy • žádná zánětlivá reakce • na rozdíl od nekrózy je popsáno mnoho příkladů fyziologické apoptózy. NekrózQ Morfologické znaky: začíná bobtnáním cytoplasmy a mitochondrií a končí úplnou lyzí, netvoří se vesikly, rozpadají se organely, ztráta integrity buněčné membrány Biochemické znaky: ztráta regulace homeostáze, pasivní proces nevyžadující energii (běží i ve 4°C), nahodilá degradace DNA, postlytická fragmentace DNA (= pozdní událost během nekrózy) Me c r oslí ~ 10* - miiocnonflfiaí mcvf pnaio^car mt-m brané breakdown ftvťf&tblt s writing ilWSr&D* sure -g C í n-ígration Apoptóza Morfologické znaky: kondenzace buňky a jádra, výchlipky membrány („blebs"), kondenzace chromatinu, fragmentace jádra a rozpad buňky na apoptotická tělíska, membrána neztrácí svou integritu, . Biochemické znaky: přísně regulovaný, aktivní proces vyžadující energii (neběží při 4°C), nenahodilá fragmentace DNA (žebřík na ELFO), uvolňování specifických faktorů z mitochondrií do cytoplasmy, aktivace kaskád kaspáz, .. pievtfvciS 1 __. 1 Mi mení s /va \ * Si,' á) ^ 1 (^) Ľondänialiun iCíNblCWmiyJ hŕňgm í n taliq n secprcfrry riWrOSis Buňka procházející apoptózou myší fibroblast A. v přítomnosti séra B. v nepřítomnosti séra Buňka procházející apoptózou HeLa buňka 24 hod po přidání aktinomycinu D Další formy buněčné smrti Aponekróza • nedochází k dokončení buněčné smrti, v konečných stádiích se objevují známky nekrózy • klíčovým momentem je pravděpodobně intracelulární obsah ATP: není-li ATP k dispozici, je zánik buňky dokončen formou nekrózy Paraptóza • nápadná je tvorba vakuol a nabobtnání mitochondrií • nemá nic společného s apoptózou Nekroptóza • nekróza indukovananá externími stimuly (ligandy) prostřednictvím receptoru smrti, je-li znemožněna apoptóza, např. působením inhibitorů kaspáz Apoptóza je fyziologický proces Buněčná smrt se v mnohobuněčném organismu objevuje během celého vývoje. Je součástí embryogeneze a orogeneze: • hormonálně regulovaná involuce „pulčího" ocasu během vývoje • odumírání neuronů během vytváření CNS • odumírání buněk během tvorby končetin,... Apoptóza odstraňuje škodlivé buňky: • negativní selekce autoreaktivních lymfocytů • smrt buněk rozpoznaných jako buněk napadených virem • buňky s mutací DNA Apoptóza je součást organogeneze Programovaná buněčná smrt se podílí na tvarování prstů vyvíjející se nohy myši. Změny v regulaci apoptózy jsou - patologické Zvýšená apoptóza • syndrom získané imunodeficience AIDS (CD4+ T-buňky) • neurodegenerativní nemoci (Alzheimerova, Parkinsonova nemoc, Huntingtonova choroba) • myelodysplastický syndrom (hypercelulární dřeň, periferní cytopenie) • některé autoimunitní nemoci • spinální svalová atrofie, roztroušená skleróza,... Nedostatečná apoptóza • nádory, MDS,... • některá autoimunitní onemocnění • virové infekce Regulace apoptózy u hlísta Caernohabditis s elegans C. elegans byl prvním modelem pro studium molekulárních mechanismů apoptózy. Pro apoptózu C eeegans jsou klíčové 3 proteiny: • CED-3 je kaspáza - cysteinová proteáza; existuje ve formě zymogenu - neaktivního proenzymu, který je aktivován „by • CED-4 se váže na CED-3 a iniciuje jeho aktivaci • CED-9 se váže na CED-4 a zabraňuje tak aktivaci CED-3 Normálně tvoří CED-9, CED-4 a CED-3 neaktivní komplex. Apoptóza je stimulována disociací CED-9 a následnou aktivací CED-3. Regulace apoptózy u Caernohabdttis elegans U buněk určených k apoptóze protein EGL-1 odstraní z komplexu CED-4/CED-3/CED-9 protein CED-9, zbylý komplex oligomerizuje a následně se aktivuje CED-3. Regulace apoptózy v buňkách obratlovců V buňkách obratlovců se vyvinuly celé rodiny genů, které ale odpovídají genům buněčné smrti C eeegans. Kaspázy jsou podobné CED-3. Jediný dosud známý homolog CED-4 je Apaf-1. Proteiny z rodiny Bcl-2 jsou homologní CED-9, s tím rozdílem, že některé proteiny z rodiny Bcl-2 jsou antiapoptotické, jiné jsou ale proapoptotické Regulace apoptózy Apoptotická mašinerie je držena pod kontrolou díky signálům přežití, které přicházejí z vnějšího prostředí, a díky vnitřním signálům, které monitorují buněčnou integritu. Apoptóza je indukována: • jestliže buňka ztratí kontakt s vnějším prostředím (anoikis) • jestliže je buňka neopravitelně poškozena • jestliže buňka simultánně dostává signály indukující buněčné dělení a apoptózu • jestliže buňka dostává signály smrti (smrtící signály) Regulace a průběh apoptózy Vnější cesta receptorová: vazbou ligandu na příslušný receptor smrti vzniká proapoptotický signál. Ten vede k aktivaci domény smrti za kooperace dalších proteinů. Cílem je aktivace prokaspázy 8. Vnitřní cesta: signalizací (např. přes p53) je zahájen apoptotický děj, jehož složkou je systém Bcl-2/Bax, signalizace přes mitochondrie, tvorba komplexu nazývaného'apoptozóm a cílem je aktivace prokaspázy 9. Regulace a průběh apoptózy 1. Signalizace přes receptory 2. Vnitřní signalizace (mitochondrie) 3. Efektory apoptózy Receptory smrti Jsou povrchové receptory, které přenášejí proapoptotické signály indukované ligandy smrti. Mohou aktivovat kaspázy během sekund po vazbě ligandů a způsobit odstranění buňky během několika hodin. Patří do superrodiny receptoru TNF („tumor necrosis factor"): - mají podobnou strukturu extracelulární domény (bohatou na cystein) - obsahují homologní cytoplasmatickou doménu smrti, která jim umožňuje přímo interagovat s apoptotickým aparátem Receptory smrti a jejich ligandy CD95 (Fas, Apol) - CD95L, FASL TNFR1 (p55, CD120a) - TNF, lymphotoxin DR3 (Apo3, WSL-1, TRAMP, LARD) - Apo3L (TWEAK) DR4 - Apo2L (TRAIL) DR5 (Apo2, TRAIL-R2, TRICK 2, KILLER) - Apo2L (TRAIL) Fas/CD95 - CD95L Fyziologická apoptóza: • periferních aktivovaných T-buněk na závěr imunitní odpovědi • odstranění např. virem infikovaných nebo nádorových buněk T-buňkami nebo NK buňkami • odstranění zánětlivých buněk např. v oku CD95L je homotrimer - váže se na tři receptory CD95 - a způsobuje jejich „clusterování" - na tuto strukturu se váže adaptorový protein FADD („Fas-associated death domain"; Mort 1) a prostřednictvím vlastní domény smrti interaguje s podobnou doménou na kaspáze 8, která je touto interakcí indukována k aktivaci seberozštěpením a může dále aktivovat další kaspázy, např. kaspázu-10 (amplifikace). Apoptotickd signalizace receptorem CD95 CD95L DD - death domain DED - death effector domain Caspase 8 Effector caspases A po ptosis Další způsob regulace receptoru Fas/CD95 Byla popsána molekula DcR3 („decoy receptor 3"): tento receptor také váže ligand FasL, a tak blokuje jeho vazbu k receptoru Fas. Fas/FasL brzdí kancerogenezi Vrozené defekty v expresi nebo funkci Fas způsobují vrozené dispozice k autoimunitním nemocem, ale jsou také spojeny se zvýšeným rizikem vývoje nádoru. Cytotoxické lymfocyty exprimují FasL a mohou tak zabíjet Fas-pozitivní buňky Některé tkáně (oči, testis) exprimují FasL konstitutivně, v jiných tkáních lze jeho expresi indukovat (např. látkami, kteVé poškozují dNa, ..). Signalizace Fas/FasL je nádorově supresivní! Fas/FasL a nádory Gen pro DcR3 je amplif ikován u některých nádorů plic a kolorektálních karcinomů. - Mutace receptoru Fas. Snížená exprese receptoru Fas. TNFR1 -TNF TNF je produkován hlavně aktivovanými makrofágy a T-buňkami jako odpověď na infekci. Aktivace TNFR1 vede jednak k zánětlivé odpovědi organismu (aktivaci NF-kB a AP-1), u některých buněčných typů k apoptóze. Na rozdíl od CD95, TnFrI nevyvolává apoptózu, pokud není blokována syntéza proteinů (® existence proteinů blokujících apoptózu). Po vazbě TNF receptor TNFR1 tvoří trimery a dochází tak k asociaci jejich domén smrti. Na ně se váže adaptorový protein TRAĎĎ, který funguje jako platforma pro vazbu dalších proteinů - TrAf2 a RIP, které stimulují aktivaci transkripčních faktorů NF-kB a AP-1. Ke komplexu TNFR1-TRADD se může vázat adaptor FAĎĎ, který potom aktivuje kaspázu-8. DR3 Receptor DR3 je velice podobný TNFR1, po stimulaci aktivuje nF-kB přes TRADD, TrAF2 a RIP a indukuje apoptózu přes TRADD, FADD a kaspázu-8. Funkčně jsou DR3 a TNFR1 velmi podobné, ale zásadně se liší expresí svou a svých ligandů: • TNF je exprimován hlavně u aktivovaných makrofágů a lymfocytů,zatímco Apo3L je konstitutivně exprimován téměř ve všech tkáních. • Naopak TNFR1 je exprimován obecně ve všech tkáních, zatímco DR3 je přítomen hlavně ve slezině, thymu a v periferní krvi a je indukován aktivovanými T-buňkami. Apo signalizace receptory TNFR a DR3 Nekroptóza nekróza indukovaná externími stimuly (ligandy) prostřednictvím receptoru smrti, je-li znemožněna apoptóza, např. působením inhibitorů kaspáz proces je regulovaný, ale morfologicky shodné znaky s neregulovanou nekrotickoU buněčnou smrtí klíčovým hráčem regulace je kináza RIP1 (receŕtor-interacting protein 1) - inhibitory nekroptózy jsou malé molekuly nekrostatiny. Např. necrostatin-1 je efektivním inhibitorem kinázové aktivity RIP1 DR4 a DR5 - TRAIL/Apo2L Mechanismus fungování DR4 a DR5 je částečně shodný s ostatními receptory smrti, částečně zatím ne zcela znám (adaptorové proteiny?). Podobá se hodně fungování CD95, ale jehoexprese stejně jako exprese Apo2L je mnohem méně specifická. Jaká je ochrana buněk, které exprimují DR4 a 5, před apoptózou vyvolanou Apo2L? ® Expresí decoy receptoru: kompetují s DR4 a DR5 o vazbu ligandu -vychytávají ligand • DcR1 (TRID, TRAIL-R3, LIT) - má podobnou strukturu jako DR4 a DR5, ale zcela postrádá cytoplasmatickou část; mají glycosyl-fosfatydilinositolovou skupinu, kterou jsou přichyceny na membránu • DcR2 (TRAIL-R4, TRUNDD) - má zkrácenou cytoplasmatickou část o kritické aminokyseliny nutné k vyvolání odpovědi Apo signalizace receptory DR4 a ĎR5 Apo2L/TRAlL Adaptor? Caspase? Effector caspases Apoptosts Receptory smrtí Pět rodin receptorů smrti je exprimováno/ exponováno na povrchu různých savčích/lidských buněk. Po vazbě ligandů cytoplasmatické části těchto receptorů - prostřednictvím FADD domén - vytvářejí DISC („death-inducing signalig complex"), který štěpí proĚspázu B na aktivní kaspázu Využití receptoru smrti k indukci apoptózy nádorových buněk Pro: • DR mají přímou návaznost na apoptotickou mašinerii • navozují apo nezávisle na p53 apod. Proti: • silné vedlejší účinky působení CD95L a TNF - šok připomínající septický šok (indukce zánětlivých odpovědí) • indukce apo u hepatocytů myší při použití protilátek namířených na CD95 Možná bude úspěšnější využití Apo2L: • DR4 a DR5 aktivují NF-kB, ale APO2L indukuje tuto dráhu jen slabě • DR4 a DR5 jsou exprimovány u mnoha normálních i nádorových buněk, ale DcR1 a DcR2 jsou exprimovány u normálních, ale jen vzácně u nádorových buněk. Úloha mitochondrií v apoptóze Mitochondrie hrají klíčovou úlohu v regulaci buněčné smrti. (Endosymbiotický původ mitochondrií a evoluce aerobního metabolismu u eukaryot vytvořily základ pro evoluci aktivní buněčné smrti.) Pro průběh apoptózy je klíčové vytvoření apoptozómu, proteinového komplexu, který je nutný k aktivaci iniciační kaspázy Apoptozóm je tvořen cytochromem C, Apaf-1 a prokaspázou-9. Kritické pro vytvoření apoptozómu je uvolnění cytochromu C z mitochondrií Z mitochondrií uvolněny i další faktory: AIF („apoptosis-inducing factor"/ Diablo/SMAC) a intrami^chondriální prokaspázy (3). Apoptozóm: „kolo smrti" Apoptozóm se tvoří v cytosolu, je-li uvolněn cytochrom C z mitochondrií a asociuje s Apaf-1. Tak se vytvoří sedmiramenné kolo, kde ramena jsou tvořena sedmi podjednotkami Apaf-1 a jejich vrcholy tvoří cytochrom C (červená). Toto kolo přitahuje prokaspázu 9, která se váže do středu/osy kola (modrá) a je aktivována na kaspázu 9 Úloho mitochondrií v opoptóze outer membrane mitochondrial™ membránou. Regulace permeability mitochondrial™ membrány Bylo popsáno mnoho molekul, které ovlivňují permeabilitu mitochondriální membrány - mitochondrie tak fungují jako integrátory (pro- a anti-) apoptotických signálů. Především proteiny z rodiny Bcl-2*. Je to rodina (více než 20) proteinů strukturou a funkcí homologní s proteinem CED-9. Některé proteiny z rodiny Bcl-2 mají antiapoptotickou funkci: Bcl-2, Bcl-XL, Bcl-W,některé proapoptotickou funkci: Bax, Bak, Bid, Bim. *Bcl-2 („B-cell lymphoma gene-2") byl první apoptotický gen objevený v savčích buňkách (1988) díky své roli v maligní přeměně B-buněk - tak také poprvé popsána nová třída pp^to-onkogenuí ne aktivátory buněčné proliferace, ale blok buněčné smrti. t(14;18) - FL (identifikace homologie Bcl-2 a CED9 = „Aha! moment") Mitochondrie jako integrátory apoptotických signálů Proteinová rodina Bcl-2 Struktura proteinu Bcl-2 Pro všechny proteiny rodiny Bcl-2 je typická konzervovaná sekvence označovaná jako Bcl-2 homoiogní motiv. Každý člen rodiny obsahuje alespoň jednu tuto sekvenci ze čtyř: BH1 až BH4. Většina anti-apoptotickvch členů obsahuje BH1 a BH2, proteiny nejvíce podobné Bcl-2 obsahují všechny čtyři. Pro-apoptotické proteiny tvoří dvě podrodiny: jedna (např. Bax, Bak, Bok) je blízce příbuzná Bcl-2 a obsahuje Bh1, bh2 a bh3, druhá je vzdáleně příbuzná (např. Bik, Blk), obsahuje jen bh3 a představuje spíše funkční analog proteinu EGL-1 (označují se někdy jako BH3 faktory). bh3 je nezbytná pro funkci pro-apoptotických proteinů. Struktura anti-apoptotických proteinů Bcl-2 Struktura pro-apoptotických proteinů Bcl-2 Proteinová rodina Bcl-2 Význam multiplicity pro-apoptotických proteinS Různé fyziologické stresy/signályy fungují prostřednictvím různých proapoptotických proteinů, které mají za úkol antagonizovat anti-apoptotický protein Bcl-2 Význam multiplicity pro-apoptotických signálů microtubule actin granzyme-B Násobné/paralelní způsoby aktivace pro-apoptotických proteinů BH3 souvisí také s jejich rozmanitými způsoby inaktivace přichycením na nej^nější cytoplasmatické struktury nebo inhibiční komplexy „Součinnost" pro- a anti-apoptotickýCh proteinů Každý člen rodiny Bcl-2má svůj vlastní soubor antagonistických proteinů. V centru stojí anti- apoptotické proteiny Bcl-2, Bcl-XL Bcl-w a Mcl-1. Každý má svůj soubor antagonistů. Proteiny Box a Bak - pokud nejsou „neutralizovány" vazbou „opozičních" proteinů indukují apoptózu otevřením mitochondriálních vnějších kanálů. Apoptotické dráhy u hlísta a savčí buňky Klíčové rozdíly apoptotické mašinerie nematod a savců: cytochrom C, proteiny IAP => savčí apoptóza je komplexnější Struktura proteinu Bcl-2 Proteiny z rodiny Bcl-2 mohou tvořit heterodimery a titrovat, ovlivňovat navzájem svůj účinek: jejich nájemné ko řKAntroce tak mohou fungovat jako Sekvence BH1, BH2 a BH3 ovlivňují schopnost Hete^odiímerizace není nezbytná pro anti- U pro-apoptotických proteinů je heterodimerizace nezbytná pro BH3 faktory, nle postr-adatelná pro efoteiny typu Bax (zřejmě Mechanismus účinku proteinů Bcl-2 Z analogie CED-4/CED-3/CED-9 - přímá interakce: Zdá se, že Bcl-XL interaguje přímo s Apaf-1 a inhibuje jeho asociaci s prokaLspázou-9. Pro^optotické proteiny (např. Bik) mohou fungovat tak, že uvolňují tuto interakci. Anti-apoptotické proteiny zřejmě udržují integritu organel a zabraňují uvolnění cytochromu C z mitochondrií. Zřetelně to ale není jediná jejich funkce (např. Bcl-2 může blokovat apoptózu i po uvolnění cytochromu C). Proteiny s motivem BH1 a BH2 zřejmě mohou tvořit póry v organelách - mitochondriích (Bcl-XL, Bcl-2, Bax - nn vttro) Model regulQce ApQf-1 proteiny Bcl-2 Anti-apoptotický protein (Bcl-XL) zabraňuje Apaf-1 aktivovat prokaspázu-9. Pro-apoptotický protein (Bik) může být stimulován k interakci s tímto prote^m a tak zrušit tuto inhibici apoptózy. Model fungování BH3 proteinu • Jsou-li BH3 proteiny („BH3-only" proteins) aktivní, zanořují se svou Bh3 doménou do rozsáhlého hydrofobního žlábku antiapoptotických („pro-life") proteinů Bcl-2, a tak je neutralizují • To vede k agregaci Bax a Bak na endoplasmatickém retikulu a mitochondriální membráně a k uvolnění apoptotických proteinů, jako cytochrom C. • U mnoha nádorů je vysoká exprese bc--2 nebo snížená exprese BH3 proteinů => terapeutická strategie: simulace inhibice Bcl-2 malými molekulami Proteiny Bcl-2 a nádory Potenciálně jsou anti-apoptotické proteiny onkogenní: • bc--2v translokacích spojených s folikulárními lymfomy a difúzními velkobuněčnými lymfomy a CLL. • Nepřímá účast v kancerogenezi: Myb, Ras,.. indukují expresi bd-2. Exprese bd-2 zvýšena např. u myeloidních leukémií, nádorů žaludku. Pro-apoptotické proteiny jsou potenciálními nádorovými supresory: • baxje mutován u některých nádorů trávicího traktu, a některých leukémií. - • Exprese baxje redukována u nádorů s mutací p53. Signály přežití (X signály smrti) • Některé cytokiny mají povahu signálů přežití (nikoli matických signálů!). • IGF-I („insuline-like growth factor") - jeho signalizace zprostředkována PI3K a c-Akt. c-Akt fosforyluje Bad na Ser136, který potom interaguje s pp^teinem 14-3-3. Interakce s proteinem 14-3-3 zabraňuje proteinu Bad interagovat s Bcl-XL. Anoikis Většina buněk potřebuje být přichycena k bezdomovectví). Úloha proteinu RGD v apoptóze Buňky přisedají k ECM vazbou integrinů. Přidání solubilních RGD proteinů způsobuje apoptózu aktivací kaspázy-3. Vazbou integrinů k ECM získává' buňka signály k přežití. Anoikis • Na zprostředkování „anchorage-dependent cell survival" se podílí FAK. • FAK je jedním z cílů kaspáz během apoptózy. • Signalizace FAK je pravděpodobně zprostředkována PISK, a to buď přímou interakcí FAK s podjednotkou p85 nebo aktivací Rqs a následnou aktivací PI3K. • Signalizace PI3K potom vede přes c-Akt k foiforylaci pro^optotického proteinu BQd. Kaspázy - efektory apoptózy • Rodina cysteinových proteáz, které mají specifitu k aspartátové kyselině na substrátu Uysteine aspartyl^pecific proteases"). • Analogy proteinu CED-3. První savčí popsaná kaspáza: ICE* („interíeukin-ip-converting enzyme") - kcaspáza-1 • Jsou hlavními vykonavateli finální exekuční fáze apoptózy. • Jsou konstitutivně přítomny v cytosolu buněk, a to ve formě jednořetězcového proenzymu jako prokaspázy. Např. prokaspáza-8 má asi 1-2% aktivity plně funkční kaspázy-8. • Sdílejí podobnost sekvenční, strukturní a substrátovou. • ICE nemá prokazatelnou úlohu v apoptóze, ale byla to první identifikovaná proteáza celé rodiny proteinů, které mají úlohu v apoptóze a zánětu. Aktivace kaspáz Proenzym má velikost 30 až 50 kD a tři domény: N-terminální, velkou podjednotku (20 kD) a malou podjednotku (10 kD). Prokaspázy jsou aktivovány dvojím proteolytickým štěpením: • Molekula prokaspázy je rozštěpena na dvě podjednotky - menší a větší. • Je odštěpena N-terminální r aktivace Podjednotky vytvoří tetramer (2+2 podjednotky) se dvěma aktivními místy. Aktivace kaspáz • Kaspázy patří k proteázám s nejvyšší specifitou a vysokou aktivitou Ve specifitě jsou mezi kalami rozdíly - mají odlišné funkce. • Všechny prokaspázy jsou aktivovány štěpením v místě, které je k^us sekvencí* pro kaspázy. kaspázy jsou aktivované autokatalyticky nebo enzymy s podobnou specifitou.---^- • Během apoptózy fungují jako iniciátory (8 a 9), kdy iniciují řetězec - kaskádu událostí jako odpověď na proapoptotické signály, a jako efektory (3, 6 a 7), kdy se podílejí na odstranění buňky(degradaci proteinů). * Štěpí za kyselinou aspartovou a rozpoznávají alespoň další 4 aminokyseliny směrem k N-konci molekuly. Struktura a funkce kaspáz Regulace kaspáz Kaspázy jsou v neaktivní formě konstitutivně přítomné v buňce: jejich aktivitu lze rychle indukovat jejich regulace musí být velmi efektivní 1. Aktivace iniciačních kaspáz - především kaspázy-8 a kaspázy-9 2. Aktivace efektorových kaspáz Různé iniciační kaspázy zprostředkovávají různé signály (receptory smrti - kaspáza-8, cytotoxické látky - kaspáza-9), ale spouštějí stejné následné efektorové kaspázy. Tak je vysvětleno, jaak různé apo>totické signály vedou ke stejným biochemickým a morfologickým změnám. Proapoptotické signály kulminují aktivací iniciačních kaspáz, které potom následně aktivují efektorové kaspázy - kaskádový^ model. Různé apoptotické signály mají stejný výsledek Kaspázy fungují v aktivační kaskádě Aktivace iniciačních kaspáz Kaspázy jsou regulovány pomocí jak aktivátorů, tak inhibitorů. Zdá se, že apoptotické signály iniciují tři dráhy: 1. Aktivaci kofaktorů • uvolnění cytochromu C, tvorba komplexu s APAF-1,.. • Aktivace FADD, .. 2. Modifikace prokaspázy • např. přemístění prokaspázy-8 k receptorovému kompou,. 3. Inaktivace inhibitorů • FLIP, ARC, IAP,... Inhibitory kaspáz FLIPs („FADD-like ICE inhibitory proteins") - mají sekvenci podobnou prokaspáze-8( ale chybí jim katalytické místo -Pravděpodobně kompetují s proWpázou-8 o kofaktor FADD („decoy"). Na podobném principu funguje ARC („apoptosis repressor with caspase recruitment domain"; CARD) Nechtěná apoptóza může bVt blokována působením proteinu z rodiny IAP (>hibitor-of-aPoptosis protein"): tyto Proteiny se váží na prokaspázy a kaspáZy a blokují jejich aktivitu. Naopak proteiny DIABLO/Smac se mohou vázat na proteiny IAP a inhibovat jejich působení. Ovlivňují tak citlivost buněk k apoptotickým signálům. Regulace apoptózy: IAP a DIABLO/Smac Inhibitory kaspáz IAPs Některé viry si vytvořily nástroje k potlačení apoptózy hostitelských buněk, včetně inhibitorů kaspáz: • Bakulovirový protein p35 má širokou specifitu a tvoří kovalentní vazby s katalytickým místem kaspázy-8. • Protein crmA („cytokine response modifier") některých poxvirů je inhibitorem kaspázy-1 a kaspázy-8 (je to supresor zánětlivé" reakce) a funguje podobně jako p35. • Bakulovirové IAPs jsou charakteristické doménou BIR („baculoviral IAP repeat") a jejich analogy nalezeny v mnoha dalších organismech • U č lověka popsáno alespoň 7 různých IAP - např. Survivin, XIAP, cIAPl, cIAP2, .. (U některých nádorů je např. zvýšená exprese Survivinu.) Inhibitory kaspáz IAPs • Pro inhibici proteiny IAP je nezbytná přítomnost domény bir (např. protein XIAP obsahuje 3 BIR doméni). Její struktura je konzervovaná'' mezi proteiny IaP z různých organismů. Může to být obecnějjší protein-proteinová interakční doména. • Smac/DIABLO antagonizuje funkci IAPs vazbou do domény BIR. • IAP blokují jak iniciační, tak efektorové kaspázy, a tak blokují apoptózu zprostředkovanou ^tory smrti i mitochondriemi. • Je odlišný mechanismus inhibice iniciačních kaspáz a efektorových kaspáz. Inhibice efektorových kaspáz proteinem XIAP Pro inhibici kaspázy-3 a -7 je nutná doména BIR2. Inhibiční komplex je typicky složen ze dvou heterodimerů dvou aktivních kaspáz a dvou molekul XIAP - zprostředkováno doménou BIR2. Inhibice iniciačních kaspáz proteinem XIAP Pro inhibici kaspázy-9 je nutná doména BIR3. Vazebné místo pro BIR3 se na molekule kaspázy-9 odhalí až po iniciační proteolýze. Apoptotická kaskáda • Vnější mitochondriální membrána tvoří kritický vstup do apoptózy. S jejím otevřením je Uvolňován cytochrom C, což vede k vytvoření apoptozómu a posléze k aktivaci kaspáZy 9, která aktivuje kaspázu 3, která aktivuje.. • Kaspázy/prokaspázy mohou být inhiboíány vazbou IAPs. Z mitochondrií jsou ale uvolňovány i faktory Smac/DIABLO, které antagonizují IAPs. Úkoly kaspáz 1. Inaktivace inhibitorů apoptózy, např.: • Inaktivace ICAD, který je inhibitorem CAD -nukleázy, která je odpovědná za fragmentaci DNA. • Inaktivace Bcl-2 - pravděpodobně je tak nejen inhibován inhibitor apoptózy, ale produkován i fragment, který potencuje apoptózu (amplifikace!). 2. Desintegrace buněčných struktur, např.: • Destrukce jaderné laminy - struktura pod jadernou membránou, která se podílí na kondenzaci chromatinu. Úkoly kaspáz 3. Inaktivace některých proteinů (separováním regulační a katalytické podjednotky) účastnících seľ • regulace cytoskeletu (FAK, kináza PAK2,..) • replikace DNA • oprav DNA • sestřihu mRNA, .. (4. Účast kaspáz a dalších „apoptotických" molekul -např. FADD - v regulaci buněčného cyklu!) Úkoly kaspáz A Inactivation of inhibitors of apoptosis B Disassembly of call structures C Deregulation of protein activity ! j - Caspase cleavage site Poškození apoptózy u nádorů • up-regulace bcl-2 (chromozomální translokací) v lymfomech • up-regulace faktorů přežití IGF-1, IGF-2 • mutace receptoru smrti Fas • down-regulace Fas • mutace bax • inaktivace p53 (regulace apo přes transaktivaci baxa přímáá regulace mitochondrií) • u některých nádorů je zvýšená exprese survivinu (IAP protein obsahující BIR) Anti- apoptotické Strategie nádorů Nádory používají nejrůznější strategie, jak zmenšit šanci na vstup do apoptózy. Buď snižují hladinu/aktivitu proapoptotických (modře) proteinů, nebo zvyšují hladinu/aktivitu antiapoptotických (červenohnědě) proteinů. Využití apoptózy v terapii nádorů • Aktivací receptorů smrti. • Propojení onkogenní transformace jako proapoptotických signálů na jedné straně s aktivací kaspáz na druhé straně. Autofagie Fyziologický program autofagie vede k degradaci buněčných organel (např ribozómů, mitochondrií), což umožňuje využít výsledné katabolity k biosyntéze a metabolismu energie. To stimuluje přežití v podmínkách stresu a hladovění, nedostatku. Intracelulární váčky - autofagozomy - pohlcují organely a fúzují s lysozomy, následně probíhá degradace. Normálně běží jen na bazální úrovni, ale může být výrazně stimulována stresem a nedostatkem živin. Zřejmé propojení regulace autofagie, apoptózy a buněčné homeostáze Signální síť zahrnuje'PI3-K, AKT, mTOR. Specifickým regulátorem autofagie je Beclin-1, který patří mezi BH3-only proteiny. Autofagie • Indukce autofagie může sloužit jako bariéra proti vývoji nádorů a může fungovat nezávisle na apoptóze, ale také v kooperaci s aapoptózou. Možná tak představuje další nezávislou bariéru proti nádorům. • Hladovění, radioterapie, některé cytotoxické léky mohou stimulovat autofagii, která má zřetelné cytoprotektivní účinky na nádorové buňky. Může spíše umožňovat jejich poškození než přímo zničení. • Těžce stresované buňky se mohou díky autofagii zmenšit a vstoupit do stavu přechodné dormance, což umožní přežití a pozdější (po odeznění účinku terapie) další růst a vývoj. „dvojsečný meč" {doubee-edgedsword) autofagie při modulaci nádorů Autofagie moduluje přežití a regeneraci nádorových buněk stres odstranění stresu autofagie dormance regenerace terapie nádoru kancerogenez kancerogeneze MCCR -minimal cells capable of recovery Nekróza • Nekrotické buňky se zvětšují a prasknou, vylijí svůj obsah do okolního mikroprostředí. • Buněčná smrt nekrózou JE v některých případech jasně geneticky řízena (není to nahodilý, neřízený proces). • Důsledkem nekrózy (na rozdíl od apoptózy nebo autofagie) je uvolnění pro-zánětlivých signálů a tím vtažení buněk zánětu imunitního systému. Ty mohou aktivně podporovat nádorové buňky: stimulací ang^eneze, proliferace a invasivity. • Nekrotické buňky mohou uvolňovat aktivní regulátory (IL-1a) stimulující proliferaci sousedních buněk... Nekróza má dvojí dopad na vývoj nádoru: omezuje ho i stimuluje!! (dvojsečný meč)