Molekulární biologie nádorů Prof. RNDr. Jana Šmardová, CSc. Ústav patologie, FN Brno Přírodovědecká fakulta MU Brno Lékařská fakulta MU Brno 2011 7. Telomery, telomeráza a nádory Šest získaných vlastností maligního nádoru získaná schopnost příklad Soběstačnost v produkci růstových signálů aktivace H-ras Necitlivost k signálům zastavujícím b.c. ztráta RB poškození apoptózy produkce IGF Neomezený replikační potenciál aktivace telomerázy Posílení angiogeneze produkce VEGF Tvorba metastáz inaktivace E-kadherinu Nestabilita genomu jako podmínka akumulace všech nutných změn. Starnutí buněk Normální diploidní buňky se nemohou v kultuře dělit nekonečně, ale naopak mají naprogramovaný (tzn. určený vnitřními faktory) konečný počet buněčných dělení, kterými mo^olít (L. Hayflick,1961). Pro lidské diploidní fibroblasty (HDF) je to asi 50-60 cyklů. Po dosažení tohoto počtu dělení se u buněk vyvine senescentní fenotyp: buňky změní morfologii, jsou nadále metabolicky aktivní ale nedělí se. S tím souvisí jiné expresní profily. Blok buněčného cyklu je ve stárnoucích buňkách udržován signalizací přes proteiny p53/p21 a p16/RB. Jsou-li vyřazeny tyto dráhy, buňky se dále (20 až 30x) dělí, až dosáhnou krize I potom se buňky mohou dělit, ale díky velkým chromozomálním aberacím vstupují často do apoptózy" Vzácně (1 x 10-7) mohou buňky uniknout krizi a stát se nesmrtelnými. „Telomerová hypotéza" Telomery jsou repetitivní sekvence na koncích lineárních chromozomů, na které se váží proteinové komplexy. Jejich hlavní funkcí je ochrana konců lineárních chromozomů (poprvé pozorováno 1938). telos = konec (end) meros = část (part) Telomeróza je ribonukleoproteinový enzym, který je nutný pro dompl etn repli kaci konců DNA, tj. pro udržování stabilní • Většina buněk neexprimuje telomerázu a telomery se proto progresivně zkracují při každém buněčném dělení. To souvisí s problémem neúplné replikace chromozomů: Problém neúplné replikace chromozomu DNA polymeráza katalyzuje prodlužování řetězce jen ve směru 5'® 3'. Proto se jedno vlákno uvnitř replikační vidlice syntetizuje kontinuálně a jedno diskontinuálně po Okazakta fragmentech z RNA primeru. RNA primery jsou potom odstraněny a nahrazeny sekvencí DNA. Jen na 5'-koncích dceřinného vlákna zůstává nedosyntetizovaná část vlákna zkrácení při každé replikaci. Telomerová hypotéza • Při dosažení kritické délky telomer jsou indukovány signály, které navodí stav senescence (M1 - „mortality stage 1"). Při dalším dělení (inaktivace p53 a RB) se telomery dále zkracují a způsobují chromozomální nestabilitu, která vyvolá krizi (M2 - „mortality stage 2"). Zkracování telomer funguje jako mitotické počítadlo, které určuje proliferativní kapacitu všech buněčných typů, které nemají telomerázovou aktivitu. Délka telomer určuje replikativní potenciál HDFs Senescence nezávislá na délce telomer Senescenci mohou navodit i jiné (externí) podněty než kritické zkrácení telomer (předčasná senescence X replikativní senescence): • látky poškozující DNA • oxidativní stres • aktivace mitogenních signálních drah (např. aktivace Ras) • kumulativní trauma nn vttro kultur („culture shock" - kultivační šok) - náhlá změna kultivačních podmínek 0 25 50 75 100 125 150 0 10 20 30 40 50 60 70 80 time (days) population doublings Typy senescence TelomerovQ hypotéza: smrtelné buňky Buňky s aktivní telomerázou Zárodečné buňky Některé kmenové buňky Některé somatické buňky za určitých fyziologických podmínek: - buňky endometria ve vztahu k proliferaci během menstruačního cyklu - mitogenně stimulované lymfocyty - buňky v proliferativní zóně střevních krypt - buňky proliferativní bazální vrstvy kůže - buňky lobulárního endotelia prsu během těhotenství Nádorové buňky: 85-90% všech nádorových buněk má aktivní telomerázu! ObIasti aktivní teIomerázy Hematopoetic Primitiva cells Basal Telo me ras Progenitor cells Up-regulated Telomera&e (3 Matura cells Down-regulated 1 elomerase activity Telomerová hypotéza: nesmrtelné buňky Telomery Telomery jsou tvořeny DNA a proteiny. DNA: • tandemové sekvence (TTAGGG)n (Moyzis 1988) • při každé replikaci dochází ke zkrácení telomery v důsledku Problému neúplné replikace chromozomů (při každém dělení asi o 50 až 200 pb) • podstatná část telomer (až 15 kb) je tvořena dvouřetězcovou DNA, samotný konec telomer tvoří 3'-vlákno DNA, bohaté na G, zakončené často 2 až 4 G („G-přesahovák"): konec telomery musí tvořit správnou strukturu tak, aby nebyl zaměněn za dvouřetězawé zlomy DNA!! Struktura konce telomery 5f * ttaggg • • . • ttagggttagggttaggg - . . • ttaggg 3' 3'XAxAXAaaTCCC . . . . AATCCC 5' I_II_IL non-telomeric DNA of chromosome (many megabase pairs long) double-stranded region of telomeric DNA (5-10kbp long) single-stranded 3' overhang of G-rich strand of telomeric DNA (several hundred bases long) 3'-iednovláknovv konec telomery: G-bohaté vlákno telomerické DNA přesahuje C-bohaté vlákno a tak je vytvořen tzv. 3' přesah/G-přesah. Ten je dlouhý několik set nukleotidů (délka dvouřetězcového úseku telomery je asi 5 až 10 kb). Struktura konce telomery 3' -jednovláknový konec telomery se balí dovnitř, hybridizuje v dvouřetězcové oblasti s příslušnou sekvencí, ze které vytlačuje původní vlákno a tvoří D-smyčku. Dvouřetězcová část konce telomery tvoří strukturu T-smyčky. Struktura je stabilizována vazbou některých proteinů, např. TRF2. Struktura konce teIomery 3>řesah: • zatím se neví, jak přesně se - postreplikačně - jednovláknový konec tvoří • jeho význam spočívá v tom, že po „zanoření" do dvouvláknové struktury nevyvolává odpověď/signál jako jednořetězcový zlom DNA Proteinový komplex • tzv. shelterin (telosom) • váže se v mnoha kopiích (100 - 1000) na telomerové „repeaty" • funkce: ochrana chromozomů a regulace délky telomer Nukleosomy • s modifikacemi histonů typickými pro heterochromatin Telomery Proteiny: TRF1 a TRF2 („telomere repeat factor") • první identifikované faktory vázající se na telomery • podílejí se na tvorbě správné struktury telomer • váže se na dvouřetězcovou část telomer • funguje jako represor telomerázy (overexprese TRF1 vede ke zkracování telomer i v přítomnosti aktivní telomerázy) • Kooperace TRF1 a 2 podobná spolupráci dvou rukou při zavazování tkaniček: TRF1 tvoří smyčku a TRF2 ji utahuje a zabezpečuje. TIN2 interaguje s TRF1 a 2 (jeho identifikace vedla ke konceptu multiproteinových komplexů na telomerách, kdy je obtížné urPčit efektjediného proteinu bez souvislosti s ostatními proteiny komplexu) Telomery Proteiny: Tankyráza • fnteraguje s TRF1, ale má i další netelomerické • může ADP-ribozylovat TRF1 - TRF1 je po ADP-ribozylaci rychle ubikvitinován a degradován fáze b.c. Pot1 („protection of telomeres") se váže na G-přesahovák a tím chrání konce telomer. Na telomerách se vyskytují také proteiny, které se účastní oprav a rekombinace DNA: Rad50, Rad51, Rad52, Ku70/Ku86, NBS1, MRE11 a další. Struktura telomer Struktura telomer Telomery • Blok buněčného cyklu je ve stárnoucích buňkách udržován signalizací přes proteiny p53/p21 a p16/RB. • Telomera zkrácená na kritickou délku je signálem ke spuštění signálních drah, které vedou k bloku buněčného cykklu: - signalizuje nejkratší telomera - telomeráza má afinitu k nejkratší telomeře Signalizace se účastní např. Ku (účast v NHEJ), RAD50/MRE11/NBS1, ATM Možné dopady zkracování telomer Telomeráza: podjednotka hTR Složena ze dvou podjednotek: hTERT a hTR. hTR: RNA podjednotka, která slouží jako templát pro syntézu telomerových sekvencí. • Je 451 nt dlouhá, bez polyadenylace. • Templátová oblast je tvořena 11 nt sekvencí 5' -CUAACCCUAAC-3' (1 kompletní a 1 částečná sekvence telomerového „^tu") • Gen je lokalizován v oblasti 3q26.3 • V promotoru CpG ostrůvky (u ALT+ buněk metylován) Telomeráza: podjednotka hTR • Na řízení transkripce se podílejí: Nf-Y (esenciální), Spi a RB (aktivátory), Sp3 (repPresor). • Dyskerin* - protein, který interaguje s hTR a je nutný pro správné fungování telomeíázy. *Nepřítomnost nebo poškození dyskerinu je jednou z příčin vzácného vrozeného onemocnění Ďyskeratosis congentta křehké kosti, nepřítomnost vlasů, progresivní dystrofie nehtů, nedostateečně vyvinuté genitálie, abnormality trávicího traktu, plicní fibróza, imunitní dysfunkce a zvýšené riziko nádorů kůže. Podjednotka hTR slouží jako templát při prodlužování telomer telomerázou Telomeráza: podjednotka hTERT hTERT:katdytická podjednotka s aktivitou reverzní • te7kDa protein, 1132 AA, limitující součást Aktivita ^ exprese (hTERT) telomerázy. • Gen je lokalizován v oblasti 5p15.33*. • Promotor může být metylován. Äčap53 takébuje ^ HyÍÍo^^z^^^třp23IJ hsp90právnému Telomeráza • Aktivita telomerázy dále kontrolována na posttranskripční a posttranslační úrovni (fosforylace -role i p16, p15). Funkční domény podjednotky hTERT: • „anchor" doména - váže konec telomery • katalytická doména - vlastní polymerace nukleotidů Mechanismus fungování telomerázy vazba telomery ® elongace ® translokace ® ® disociace Nádory, telomery a aktivní telomeráza • 85 až 90% nádorů má aktivní telomerázu. • K aktivaci telomerázy dochází v pozdních stadiích kancerogeneze. • Ektopická exprese telomerázy nemá transformační účinek. EktopickQ exprese telomerQzy nemQ transformační účinek Zkracování telomer brání vzniku nádoru Zkracování telomer v buňkách bez aktivní telomerázy suprimuje tvorbu nádorů tím, že limituje, kolikrát se buňka může rozdělit; omezením replikační kapacity snižuje šanci na „úspěšnou, dokonanou kancerogeneZi". Je těžké určit, kolikrát se buňka musí být schopná rozdělit, aby měla dostatečnou kapacitu k vývoji nádoru! Stabilizace telomer je nutnou podmínkou vývoje nádoru. Telomery nádorových buněk jsou často kratší než telomery ostatních buněk (i ke stabilizaci telome7ďo~chází až v některé pokročilejší fázi vývoje nádoru). Např. myš „knock-out"pouze v Cdkn2a (p16, Arf) má vyšší výskyt nádorů aa v mladším věku než myš knock-out v Cdkn2a a s krátkými telomerami (podobně myš ApcMin' - pouze adenomy). Brání zkracování telomer vzniku nádoru? 1. nádory jsou klonální, vznikají z jediné buňky 2. 1 cm3 tkáně obsahuje asi 109 buněk 3. průměrný život ohrožující nádor je velký asi 103 cm3, tj. asi 1012 buněk => tj. 40 cyklů exponenciálního růstu a dělení, tedy 40 generací buněk in vttro je možných 50-60 cyklů, to by vyšlo!! Tak brání zkracování telomer vzniku nádoru nebo ne? — toto je ideální předstaVa realita vypadá takto ® v mnohobuněčném organismu existují ochranné bariéry a mnoho buněk zemře (nedostatek růstových faktorů, kyslíku, přítomnost odpadů, atd.) reálně je třeba mnohem více buněk, aby uspěly ve snaze vytvořit nádor Důsledky kritického zkrácení telomer Zkracování telomer přispívá vzniku nádorů i Zkracování telomer zvyšuje genetickou nestabilitu, a tím přispívá k tvorbě nádorů. Typickým projevem kriticky zkrácených termer je vznik „e^d-to-end" fúzí a tvorba multicentrických chromozomů, které se potom lámou během mitózy (Barbara McClintock, 1941!). Dvojí role telomerázy a telomerové dysfunkce v genetické nestabilitě a růstu nádoru Telomere Shortening K- Telomerase Activation Tumor Growth Telomerová rovnováha Zdá se, že úloha zkracování telomer v kancerogenezi je nakonec vybalancována: podle genetického kontextu zkracování telomer buď přispívá nebo brzdí kancerogenezi. Myší modely úlohy telomer v kancerogenezi mTR-/- • zvýšená frekvence spontánních nádorů (hlavně v proliferativních tkáních) ve srovnání s wt. Cdkn2a-/- mTR-/- • snížená frekvence mutageny indukovaných nádorů ve srovnání s mTR-/- ApcMin/mTR-/- • zvýšená frekvence iniciace nádorů (mikroskopické adenomy) • snížená frekvence a velikost makroskopických adenomů ve srovnání s ApcMin p53-/- mTR-/- • zvýšená frekvence tvorby nádorů ve srovnání s p53-/-. Změna spektra nádorů - krátké telomery by mohly souviset s tvorbou epiteliálních nádorů (souvislost s výskytem nádorů u stárnoucích lidí). Telomery a telomeráza v ruzných stadiích kancerogeneze Buňky bez aktivní telomerázy: • Zkracování telomer buď navodí genetickou nestabilitu nebo inhibuje růst nádoru senescencí* a/nebo apoptózou. Není zcela jasné, co rozhoduje, která z možností se uplatní. • Aktivace telomerázy může v další fázi omezit genetickou nestabilitu a umožnit růst nádoru. • Spojení buněk s aktivní telomerázou s pozdějšími agresivnějšími stadii může souviset se selekcí výrazně proliferujících buněk (klonální expanze). Senescentní fibroblasty stimulují proliferaci neoplastických a preneoplastických buněk (růstové faktory, mezibuněčný kontakt) Model úlohy telomer a telomerázy ve vývoji nádoru Telomery a telomeráza v ruzných stadiích kancerogeneze Buňky s aktivní telomerázou: • Vypnutí telomerázy může být jedním mechanismem, jak indukovat genetickou nestabilitu. • Alternativní ochranou buňky proti kancerogenezi může být předčasná senescence nebo apoptóza navozená např. aktivovanými onkogeny. Regulace telomerázy během kancerogeneze Klinické využití poznatku o telomeráze Asi 85 až 90% nádorů má aktivní telomerázu => klinické využití? Aktivní telomerázou se buňky nádorové liší od většiny somatických buněk => využití v diagnostice: Inaktivace telomerázy může omezit růst nádorových buněk, zatímco většina „normálních" buněk telomerázu nepotřebuje => využití pro terapii: Využití telomer v diagnostice TRAP assay využívá PCR k amplifikaci produktů prodlužování tdomerózou velmi citlivo: detekuje 0.01% pozitivních buněk tam kde tkóň/histologické prostředí nádoru přirozeně obsahuje aktivní telomerózu (střevní epitel) se za pozitivní považuje pouze hladina telomerázy vyšší než u odpovídající kontrolní tkáně Využití telomer v diagnostice U některých dětských nádorů může aktivita telomerázy sloužit jako prognostický markeY. Z Kaplan-Meierových křivek přežití vyplývá, Že např. u neuroblastomů nebo Ewingova sarkomu je aktivní telomeráza výrazně negativním prognostickým faktorem. Aktivní telomeráza a neuroblastomy Neuroblastomy dětí (nádory periferních nervů) mají obecně velmi variabilní výhled vývoje: některé spontánně regredují, zatímco jiné jsou agresivní, metastázující... fatální. Špatná prognóza silně souvisí s amplifikací genu N-myc. Špatná prgnóza silně souvisí s aktivní telomerázou. Podle některých patologů jsou neuroblastomy u dětí velmi běžné, ale většina spontánně eroduje a zanikne (c= nemají aktivní telomerázu tak buňky předají do senescence/krize a spontánně zaniknou) Telomeráza jako terapeutický cíl • inhibice telomerázy v kultivovaných nádorových buňkách indukuje krizi a apoptfeu inhibitory telomerázy jsou potenciálně účinné protinádorové látky ? kmenové a další buňky s fyziologicky aktivní telomerázou ? - mají delší telomery než nádorové buňky - dělí se pomaleji než nádorové buňky, tj. zkracují se jim telomery pomaleji než nádorovým buňkám => dostatečné terapeutické okno Telomeráza jako terapeutický cíl • např. antisense oligonukleotidy komplementární k hTR (stabilizované /proti půsoobení nukleáz/ chemickými modifikacemi např. 2'-0-methyl RNA) • přenosem dominantně negativního genu hTERT • použitím inhibitorů reverzní transkriptázy, např. AZT (používaných při léčbě HIV) Telomeráza jako terapeutický cíl • Vedle množství aktivní telomerázy ještě mnoho dalších faktorů rozhoduje o efektivitě, s jakou je telomeráza přiváděna k telomerám Tankyráza • může ADP-ribozylovat TRF1 - TRF1 je po ADP-ribozylaci rychle ubikvitinován a degradován => vytváří se otevřenější konfigurace proteinového komplexu na telomeře a zpřístupňuje se G-přesah pro telomerázu overexprese tankyrázy vede k prodlužování telomer u buněk exprimujících aktivní telomerázu i výrazně snížená aktivita telomerázy (o 80%) může zajistit stabilizaci telomer (nejkratší telomera má nejvyšší afinitu pro telomerázu -pravděpodobně kvůli snížené schopnosti vázat multiproteinový komplex) => kombinace inhibitorů telomerázy a tankyrázy je velmi účinná a umožňuje vyhnout se toxickým dávkám pouze jednoho nebo druhého inhibitoru Alternativní způsob prodlužování telomer Aktivní telomeróza detekována "jen" u 85-90% nádorových buněk - co těch zbylých 10 až 15%? ALT - „Alternatíve Telomere Lengthening" - založen na rekombinaci DNA " • ALT je spojen s velice heterogenní délkou telomer. • Mechanismy ALT a telomeráza koexistují v buňce vedle sebe, ale aktivní telomeráza (exprese telomerázy) reprimuje mechanismy ALT (nezdá se ale, že by tím represorem byla přímo telomeráza). • poprvé popsán u kvasinek Alternativní způsob prodlužování telomer u kvasinek Popsány dva typy prodlužování telomer: • I. Rekombinací subtelomerických V elementů, kdy G-konec zůstává krátký. Spojeno s požadavkem na funkční RAD51. To vede k tvorbě velice dlouhých telomer, které mohou být příčinou růstové nevýhody takových buněk. ® Mohou konvertovat na typ II. • II. Rekombinací G-bohatých konců telomer. Spojeno s požadavkem na funkční RAD50. Telomery v nepřítomnosti telomerázy mohou být substrátem pro různé typy rekombinací. Modely ALT Navrženy 4 modely udržování délky telomer • Replikace indukovaná zlomy (BIR) • Integrace extrachromozomální DNA • Replikace otáčivou kružnicí • Elongace t-smyčky Genetické změny, které potencujírekombinaa (např. defekty v MMR), pot encují také prodlužování délky Prodlužování telomer rekombinací passage 40 population doublings later Důkaz o rekombinaci jako mechanismu ALT: do jedné telomery jednoho chromozomu byla vložena specifická značka detekovatelná fluorescenční sondou. Po opakovaných děleních byla značka detekována v pěti různých chromozomech. Telomery a starnutí Hutchison-Gilford progeria • zrychlené stárnutí již od 2 let; kratší postava, abnormální držení těla, typický fenotyp stárnutí: holohlavost, ztuhlost kloubů, atrofická a vrásčitá kůže, ateroskleróza, stav cév -angina pectoris, infarkt myokardu... • fibroblasty těchto pacientů mají kratší telomery než fibroblasty kontrol, vstupují do fáze senescence rychleji; po transfekci genu hTERT se stávají nesmrtelnými Wernerův syndrom • předčasné stárnutí včetně vaskulárních nemocí, diabetes mellitus, katarakta (šedý oční zákal), atrofie kůže, šedivé vlasy, nádory, průměrná délka života 47 let Trisomie 21 - Downův syndrom • zrychlené stárnutí • délka telomer lymfocytů se zkracuje 3x rychleji než u zdravých jedinců Telomery a stárnutí Syndromy charakteristické mutacemi v telomerových genech a v důsledku toho zrychleným zkracováním telomer: • Dyskeratosis congenita. Mutace buď přímo v TERTnebo TERC(® telomeráza), nebo v DKCl(® interagující protein související se stabilitou telomerázy): malá postava, hypogonadismus, infertilita, defekty kůže a hematopoietického systému, selhání kostní dřeně, předčasná smrt, zvýšená genetická nestabilita, zvýšená incidence nádorů; anticipace onemocnění • Aplastická anemie. Mutace TERC a TERT předčasná smrt Idiopatická pulmonární fibrosa: respirační selhávání KONEC