Instrumentální biochemické metody Literatura http://media.wiley.com/product_data/coverImage300/72/04700290/0470029072.jpg Literatura uAnzenbacher, Kovář : Metody chemického výzkumu pro biochemiky. MŠ Praha, 1986. u uFerenčík, Škárka : Biochemická laboratorní technika. Alfa Bratislava 1981. u u Separační metody u uVychází z klasických metod chemické analýzy u uUplatňují se zde i speciální metody Separace u kvalitativní uAnalytické u kvantitativní u uPreparativní u u Charakterizace – pI, MW, spektra, AMK … Problémy se vzorkem uKomplexnost u uMalá množství u uLabilita u Zásady pro práci s biologickým materiálem 1.Teplota 2.pH + iontová síla 3.Koncentrace 4.Pěnění 5.Lokální přebytky 6.Proteasy, RNAsy, DNAsy Separace bílkovin Literatura Plánování separace Cíl izolace uZískání homogenní bílkoviny uZachování biologické aktivity uČistota u uZávěr : získat vzorek o patřičné u čistotě s vynaložením u patřičného úsilí Volba vstupního materiálu uPreparát z daného organismu u uPreparát s největším obsahem dané bílkoviny uPreparát s nejmenším obsahem nečistot Volba a kombinace separačních metod uSelektivita uRozlišovací schopnost uKapacita uZpětný výtěžek uNáklady – materiál, přístroje, člověk uStupeň zřeďování a koncentrace uSlučitelnost mezi metodami uZnalosti o dané bílkovině (pI, MW) Základní zásady uNa začátek zařadit metody s vysokou kapacitou a malým výtěžkem a rozlišením ® velké množství levného vstupního materiálu u uPozději metody s vysokým rozlišením a výtěžkem, kapacita méně významná u ® ve vzorku již investovaná práce uPořadí volit tak, aby metody na sebe vhodně navazovaly u uMetody zřeďovací kombinovat s metodami koncentrujícími u uMetody nepoužívat opakovaně u u Sledování průběhu separace •Metoda •Celková bílkovina •Celková aktivita •Specifická aktivita •Přečištění •Výtěžek •extrakt •100 •100 •1 •- •100 % •HIC •50 •99 •1.99 •1.99 •99 % •IEX •25 •75 •3 •1.5 •75 % • • • • • • Stanovení koncentrace bílkoviny Kjeldahlova metoda – stanovení N2 uMineralizace vzorku – převedení u organického N na NH4+ u uStanovení NH4+ - titrace, fotometrie, u selektivní elektrody Kjeldahlova metoda – stanovení N2 UV spektrofotometrie u280 nm – aromatické AMK u interference nukleotidů u u180 - 230 nm – peptidická vazba u uVýhody - nedestruktivní metoda u - není třeba kalibrace UV spektrofotometrie UV spektrofotometrie •Vzorce pro přímé UV stanovení: • c (mg/mL) = 1.55 A280 - 0.76 A260 •c (mg/mL) = (A235 - A280)/2.51 •c (mg/mL) = (A224 - A233)/5.01 •c (mg/mL) = A205 [27 + 120 (A280/A205)] UV spektrofotometrie •Edelhochova metoda • •při znalosti aminokyselinového složení je možné spočíst extinkční koeficient proteinu e280. Podmínkou je přítomnost tryptofanu nebo tyrosinu v molekule. • •e280 = nTrp.5500 + nTyr.1490 + nCys.125 (M-1.cm-1) VIS spektrofotometrie uPřídavek činidla ® barevný derivát u uDestruktivní metoda u uNutná kalibrační závislost Biuretová metoda uPrincip : Cu2+ vytváří v alkalickém prostředí komplex se 4 N u peptidické vazby u u Cu2+ u uMěření : 540 – 560 nm u 310 nm Folinova metoda uPrincip : hydroxyfenolová skupina tyrosinu redukuje fosfomolybdenany (Folin Ciocalteovo reagens) na molybdenovou modř u uMěření : 725 nm Lowryho metoda uPrincip : kombinace Folinovy a Biuretové metody u uMěření : 600 nm Lowryho metoda •biuret é • •Lowryê Metoda dle Bradfordové uPrincip : při vazbě Coomassie Brilliant Blue G 250 na bílkovinu dochází k posunu absorpčního maxima z 465 na 595 nm. u uMeření : 595 nm Metoda dle Bradfordové BCA metoda uPrincip : Na+ sůl k. bicinchoninové (BCA), komplexuje Cu + tvořené reakcí peptidové vazby s Cu2+ u u u u u uMěření : 562 nm u BCA metoda Fluorescence uPrincip : - vazba fluoroforu na u bílkovinu ® měření vzniklé u fluorescence (OPA) u u Měření : exc.340 nm u em.440 nm u u - zhášení fluorescence přídavkem u bílkoviny u Polarografie uPrincip : Brdičkova reakce – SH skupiny bílkoviny vstupují v přítomnosti Co2+ katalytické reakce na Hg elektrodě ® proud Nejčastěji používané metody •Metoda •Rozsah (ng) •Poznámka •Biuretová •0.5 - 5 •okamžitý vývoj •Lowryho •0.05 - 0.5 •pomalý vývoj •UV - 280 nm •0.05 - 2 •interference •UV – 205 nm •0.01 - 0.05 •interference •Bradfordové •0.01 - 0.05 •sorpce barviva Nejčastěji používané metody Stanovení biologické aktivity Enzymatické,imunologické, toxické, hormonální receptorové atd. Vlastní separace Obecné schéma •Získání vstupního materiálu •Rozrušení buněk •Separace Vstupní materiál Mikroorganismy uBakterie, kvasinky, plísně, řasy u uVýhody - lze jej snadno získat v dostatečné množství u - selekce mutantů o požadovaných vlastnostech u - genetické inženýrství u - termofilní organismy u - psychrofilní organismy u •CCM uchovává více než 3 000 kmenů bakterií (asi 1 400 druhů) a 800 kmenů vláknitých hub (přibližně 550 druhů), které nabízí ve svém Katalogu kultur. • •Specializovaná sbírka vodních hyfomycetů obsahuje asi 500 kmenů (60 rodů se 130 druhy). Mikroorganismy Selekce optimálních producentů u umaximální produkce enzymu uoptimální vlastnosti enzymu usnadné získání producenta usnadnost purifikačního postupu Mikroorganismy Bezobratlí uHmyz, plži, mlži u uNevýhody - málo se používá, nesnadno se u získává Živočišné tkáně uLaboratorní zvířata – myši, krysy, králíci u uJateční zvířata – orgány, krev u uČlověk – tělní tekutiny Rostlinné tkáně uŠpenát, řepa, hrách, tabák, Arabidopsis thaliana u uNevýhoda – problematický růst za u definovaných podmínek Manipulace s biologickým materiálem uPokud možno zpracovat co nejdříve u uZmražení – při – 60 - 80 oC u uRozmrazování – co nejrychleji Rozbití a extrakce Bakterie u u Bakterie uZáleží na lokalizaci •Extracelulární •Intracelulární uCytoplasma uPeriplazma u u • • • •cytoplasma •periplasma Balotina uPrincip – jemné skleněné kuličky přidány do bakteriální suspenze a rychle třepány nebo míchámy – nutno chladit French (X) press uPrincip – zmražená bakteriální suspenze protlačována malým otvorem, přičemž dochází k rekrystalizaci a rozrušení buněk • • French (X) press Ultrazvuk uPrincip – ultrazvuk (> 20 kHz) v roztoku vyvolává střižní síly – nutno chladit Lysozym + osmotický šok (mírný osmotický šok) uPrincip – lysozym rozruší buněčnou stěnu, následně je bakteriální suspenze zředěna destilovanou H2O – bakterie popraskají • • • • • • • Další uAlumina Al2O3 – roztírání v třecí misce u uOpakované zmrazování a rozmrazování u u Kvasinky Kvasinky uToluenová autolýza uPrincip – toluen extrahuje při 35 –40 oC fosfolipidy buněčné stěny ® osmotický šok ® enzymová autolýza u uBalotina, French press, u Živočišné tkáně uTřecí miska s pískem u u u u uRuční homogenizatory – Potter – u Elvehjemův Živočišné tkáně uBez buněčné stěny uVelmi křehké uTkáňové kultury Živočišné tkáně uMixery u u uOsmotická lyse - erytrocyty Rostlinné tkáně uSilná buněčná stěna - celulosa uTkáňové kultury křehké Rostlinné tkáně uRozrušení buněčné stěny pomocí celulas, u uObsahují hodně fenolických látek, které mohou být oxidovány na chinony – melaniny, které mohou modifikovat bílkoviny Rostlinné tkáně uRozrušení buněčné stěny pomocí celulas, u uObsahují hodně fenolických látek, které mohou být oxidovány na chinony – melaniny, které mohou modifikovat bílkoviny Optimalizace extrakce uTeplota – 4 - 6 oC chlazení upH – optimální pro danou bílkovinu – práce v pufrech uI – v prostředí o definované iontové síle uPřídavky látek – EDTA, b-merkaptoethanol, kovové ionty, inhibitory proteas Inhibitory proteas uTeplota – 4 - 6 oC chlazení upH – optimální pro danou bílkovinu – práce v pufrech uI – v prostředí o definované iontové síle uPřídavky látek – EDTA, b-merkaptoethanol, kovové ionty, inhibitory proteas Separace subcelulárních organel •Organela •Tíhové zrychlení •Čas •Eukar.buňky •1 000 g •5´ •Jádra, chloroplasty •4 000 g •10´ •Mitochondrie, bakterie •15 000 g •20´ •Lysozomy, membrány •30 000 g •30´ •Ribozomy, fragmenty end.retikula a Gold.systém •100 000 g •60´ Enzymy - markery •Organela •Enzym •Cytoplasma •LDH •Endoplazmatické retikulum •Glukosa-6-fosfatasa •Goldiho systém •galaktosyltransferasa •Peroxisom •katalasa •Lysozom •Kyselá fosfatasa •Mitochondrie in •cytochromoxidasa •Mitochondrie out •monoaminoxidasa Membránově vázané bílkoviny Izolace membránových bílkovin uChemicky – detergenty, chaotropní soli, organická rozpouštědla, nízká iontová síla, u uFyzikálně - homogenizace, sonikace u uEnzymaticky – fosfolipasy, lipasy, proteasy u u u u Detergenty Detergenty Detergenty