Metody značení a imobilizace biomolekul Petr Skládal Ústav biochemie PřF MU Kamenice 5, Brno skladal@chemi.muni.cz http://biosensor.chemi.muni.cz/edu/mib Úvod ■ modifikace biomolekul: - vzájemné spojování - zavádění vhodných značek - navázání na pevný povrch (separač mg. částice, sensory, ...) ■ základ řady moderních: -vědeckých výzkumných metod - bioanalytických procesů - terapeutických postupů ■ často zmiňovány jen okrajově - cílem přednášky je podat ucelený pohled na tuto problematiku Souhrn prednášky 1. Modifikace proteinů a peptidů. 2. Funkční skupiny nukleotidů, modifikace DNA a RNA. Modifikace (poly)sacharidů. 3. Chemické reakce vybraných skupin biomolekul. 4. Biokonjugační reakce, zesíťující činidla. Štěpitelné můstky. 5. Fluorescenční značky. 6. Biotinylace, chelatační skupiny, histidinové skupiny, boronátové komplexy. Radioaktivní značení. Liposomy, nanočástice. 7. Enzymové značky, metodiky značení a detekce aktivity. 8. Imobilizace biomolekul. Aktivace matric, polymerní materiály, porézní skleněné nosiče. 9. Aktivace povrchu zlata, platiny, uhlíku a křemíku. Spontánní vznik monovrstev, fotoaktivace. 10. Charakterizace biokonjugátů - stupeň substituce, povrchová hustota ligandu. 11. Aplikace: konjugace haptenů s nosiči, značení protilátek. 12. Aplikace: imobilizace proteinů na povrch zlata, příprava DNA biočipů. Literatura ■ P. Skládal: Metody značení a imobilizace biomolekul. Elektronický text (PDF), MU Brno, 2007. ■ Lowe C.R., Dean P.D.G.: Afinitní chromatografie. SNTL, Praha 1979. ■ Hermanson G.T., Mallia A.K., Smith P.K.: Immobilized Affinity Ligand Techniques. Academic Press, San Diego, CA, 1992. ■ Hermanson G.T.: Bioconjugate Techniques. Academic Press, San Diego, CA, 1996. ■ C.M. Niemeyer: Bioconjugation Protocols, Strategies and Methods. Humana Press, Totowa, NJ, 2004 ■ internetové zdroje - webové stránky dodavatelů reagencií (Pierce, Sigma, ...) Hermanson G.T., Mallia A.K., Smith P.K.: Immobilized Affinity Ligand Techniques. Academic Press, San Diego, 1992. Greg T. Hermanson PART I Bioconiugate Chemistry 1. Functional Targets 2_ The Chemistry ol Reactive Giojps PART II Bioconjugate Reagents 1 Zero-LengrJi Cross-linkers I. Hcmobifirictional Cross-iinkers 5, Heteio afunctional Crass-linkers 6. Trihinctional Cross-linkers 1. Cleavable Flea gen Sysiams 8. Tags arid Probes PART II! Bioconjjgate Applicancns 9- Preparation of Ha pien-Carrier lirimunogen Conjugates 10. Antibody Modification and Conization 11. Imnunotojiiri Coniug^iipn Techniques 11 Preparation of Liposome Conjugates arid Derivatives II fwvwv L51:jCi:■ System; 14. Preparation of ColloirJaJ Geld Labeled Proteins 15, Modification with Synttieuc Polymers 16 Eniyme Modification and Conjugation 17. Nucleic Acid and Oligonucleotide Modification and Conjugation 13/ is; Km Hermanson G.T., Mallia A.K., Smith P.K.: Immobilized Affinity Ligand Techniques. Academic Press, San Diego, 1992. ■ The matrix - Activation methods - Immobilization of ligands ■ Techniques of the trade - Selected applications CM. Niemeyer: Bioconjugation Protocols, Strategies and Methods. Humana Press, Totowa, NJ, 2004 Cmlenti Modifikace peptidů a proteinů ■ aminokyseliny spojené navzájem peptidovou vazbou: O R R H R HN H C C N H C 3 11 I H II O R O modifikovat lze některé postranní řetězce AK, koncovou aminoskupinu a karboxyskupinu, a případně také kovalentně připojené prostetické skupiny (např. koenzymy) AK nepolární a hydrofobní: glycin, alanin, valin, leucin, isoleucin, methionin a prolin AK nepolární aromatické: fenylalanin a tryptofan - tyto jsou často orientovány dovnitř struktury proteinu, a tedy nepřístupné pro modifikační činidla ■ AK polární: asparagin, glutamin, threonin a serin - mimo Gln často posttranslačně modifikovány oligosacharidovými zbytky přes N- nebo O- glykosidické vazby - často modifikovány enzymově (např. fosforylace), avšak chem. modifikace ve vodném prostředí nesnadná, protože nukleofilní vlastnosti hydroxylu i amidu se blíží vodě ■ AK s ionizovatelnou skupinou - kyseliny asparagová a glutamová, lyzin, arginin, cystein, histidin a tyrosin - v deprotonovaném stavu jsou účinná nukleofilní činidla - hlavní cíl modifikačních reakcí Aminoskupina (Lys, Arg, His, N-konec) ■ volná aminoskupina (konec pept. řetězce a Lys) je nejčastějším cílem ■ Lys (pKa 9,3 až 9,5) je obvykle protonován ■ Arg (pKa přes 12) je protonován prakticky vždy ■ His s imidazolovým kruhem (pKa 6,7 až 7,1) ■ aminoskupiny se účastní alkylačních a acylačních reakcí, kdy fungují jako nukleofily ■ imidazol. kruh může být elektrofilní, např. při jodaci Alkylace a acylace aminoskupiny o ■ průběh při reakcích je nukleofilní substituce - vzniká tetraedrický intermediát, X je obecná odstupující skupina Karboxyskupina (Asp, Glu, C-konec) ■ postranní karboxyly (pKa 3,7 až 4,5) při fyziologickém pH nesou záporný náboj ■ vhodné pro tvorbu amidových, případně i hydrazidových derivátů ■ lze připravit i thioestery - ve vodném prostředí nestabilní ■ derivatizace probíhá přes reaktivní intermediáty -nejznámější je použití karbodiimidů (EDC, DCC, CMC): / \ /-n=c=n—ch2ch2"n o ., . . C 2j ^_ý H3C DCC CMC 3 tosyl" CMC ... cyklohexylmorfolinoethylkarbodiimid DCC ... dicyklohexylkarbodiimid - nerozp. ve vodě, spíše pro konjugace malých molekul Aktivace karboxylu karbodiimidem o Ro H3C N=C-N EDC ... ethyl-N,N-dimethyl--3-aminopropylkarbodiimid CH3 H CH3 o o H3C N N H / *•* L** \ **....»*r ' alkohol / amin / thiol R'-OH / R'-NH2 / R'-SH l + Ch o H,C ', N N 3 j j h H I +.CH3 ^ subst. / močovina CH3 O / A, o ✓R' H ester amid R S thioester o H r N R' H hydrazid Alternativní postupy ■ reakce s karbodiimidy je velmi rychlá - nesnadná kontrola průběhu, nežádoucí postranní reakce, konkurenční hydrolysa je rychlá ■ konjugační reakce se provádí přes stabilnější aktivované meziprodukty - NHS, N-hydroxysukcinimid, nebo rozpustnější sulfo-NHS o ■ vzniklé NHS-deriváty nebo imidazolylové deriváty jsou relativně stabilní ve vodném prostředí a ochotně reagují např. s aminoskupinou za vzniku amidů ■ komerčně je dostupná široká škála NHS-aktivovaných molekul (NHS-biotin, NHS-fluorescein, ...), které se pak velmi jednoduše mohou konjugovat s cílovou biomolekulou (R'-NH2): R' Thioskupina (Cys) ■ cysteinové zbytky jsou normálně protonované a bez náboje (pKa 8,8 až 9,1) ■ nejdůležitější reakcí v přirorozeném stavu je tvorba vzájemných disulfidů (cystinové uskupení) ■ mohou se účastnit alkylací a reversibilních redoxních reakcí O ■ z oxidované formy (disulfid) vzniká redukovaná forma (volná SH skupina) pomocí redukčního činidla dithiothreitolu (DTT, Clelandovo činidlo) ■ reakce může probíhat oběma směry Fenolická skupina (Tyr) ■ diazotační kopulace - elektrofilní substituce na aktivovaném benzenovém jádře - probíhá do ortho polohy, spojení s aromatickými aminoskupinami, aktivací s kys. dusitou (dusitan a HCl) vzniká regující diazoniová sůl - vzniklé konjugáty mají oranžovou barvu ■ další možnost - jodace, radioaktivní značení 125I ■ Manichova kondenzace - připojení aminosloučeniny v přítomnosti formaldehydu Specifita modifikačních reakcí ■ účastní se bílkoviny, které obvykle poskytují řadu různých skupin - jejich srovnání dle síly nukleofilních vlastností: R-S- > R-SH, R-NH2 > R-NH3+, R-COO- > R-COOH, R-O- > R-OH * H-OH ■ úlohu hraje přítomnost náboje (protonovaná / deprotonovaná forma) - lze ovlivnit volbou pH, ale protože se hodnoty pKa často překrývají, tak to není příliš spolehlivé ■ pro přesné cílení modifikace na konkrétní skupiny je zapotřebí zvolit specificky reagující činidlo Cílené zablokování postranních skupin 0,n ..... , D Ml_| 2 \_ trinitrobenzensulfonova 2 _ ., _ „ // v, kyselina (subsť) i R-N=C=S HOS—(f v—N0, ' v ' (Lys) 1 x 1,1 w w 1 \ / ■i|v-'2 isothiocyanat / aldehyd R-CH=0 (adice - thiomočovina) 0,N (+ redLkce borohydridem) p sh /—\ r Cl-Hg—(\ /)—COOH n-chlormerkuri ^^-''^^í^O (Cys) ^ benzoová k. - /=\ /=\ maleimidy, např. NEM 02N—^ h—S—S—d A—N02 (adice) / \ 5,5'-dithio-bis(2-nitrobenzoová k.) H00C C00H dtnb Ellmanovo činidlo (substituce) ,c0—0c2h5 ■ P n nh ° diethylpyrokarbonát (alkoxylace) p N-i%/ c0—0c2h5 (His) Cílená modifikace postranních skupin P-OH (Ser) 0 r—p. .0—ch(ch3)2 0—ch(ch3)2 diisopropylfluorfosfát DFP (fosforylace) 0 C—s—f 2 0 fenylmethylsulfonylfluorid PMSF (sulfonylace) (Tyr) NH ■ P (Arg) c(n02)4 0H tetranitromethan (nitrace) NH2+ NH2 CH3 ij—n N C0-CH3 2,3-butandion (kondenzace) N-acetylimidazol NAI (acetylace) fenylglyoxal (kondenzace) Modifikace nukleových kyselin ■ nukleové kyseliny (DNA a RNA) jsou tvořeny z jednotlivých nukleotidů spojených fosfodiesterovou vazbou mezi sacharidovými kruhy ■ základní složkou jsou báze - pyrimidinové (C cytosin, Tthymin a U uracil) - purinové (A adenin, G guanin) ■ spojením s molekulou sacharidu (ribosa nebo deoxyribosa) poskytují nukleosidy (např. Ade adenosin nebo dAde deoxyadenosin) ■ připojením fosfátu vznikají nukleotidy (např. AMP adenosin monofosfát). Nukleové kyseliny nh 2' hydroxyl schází u DNA (deoxy ...) 5' konec o- c o -P-o ho o: -o modifikační reakce mohou typicky směřovat na molekuly bází méně časté je využití sacharidové části (2' hydroxyl u RNA) velmi běžné je připojení dalších funkčních molekul na konec řetězce nukleové kyseliny 0 3' konec ^=p— 1 0 1 Pyrimidinové base y x hn' nh2 o n I U n' o n o n ^s. I C ch, části jejich molekul mohou být cílem ataku elektrofilních (červeně) i nukleofilních (modře, pozice 4 a 6) činidel v molekule uracilu nukleofilní substituce v C6 pozici následně aktivuje C5 pozici pro elektrofilní atak: y+ h n oo TI— -hx hn i"t o o n x o n x o n Reakce cytosinu s hydrogensiřičitanem vzniká sulfonovaný derivát, r v přítomnosti nukleofilu (amin) hn dojde k transaminaci - možnost + zavést funkční skupiny hn nh2 o n h hso3 hn o n nhľ R-N H. h2o o hn' on hn so hn * o n hso3 v slabě kyselém prostředí pak dojde k hydrolyse aminoskupiny na C4 a následně po alkalizaci se odštěpí hydrogensiřičitan - proběhla konverze na uracil o Biotinylace cytosinu O NN l-LN" NhL O HN O N S, O O T NH. HSO3 HN HN O O O NN reaktivní adukt cytosinu s hydrogensiřičitanem se v reakci s biotin-hydrazidem přemění na žádaný derivát S + O + + Cytosin - halogenace ■ možností vpravení vhodné reaktivní aminoskupiny v postranním řetězci je halogenační reakce ■ vodný roztok jodu nebo bromu, případně pomocí N-bromosukcinimidu ■ poslední krok je substituce diaminem: Purinové base pozic pro nukleofilní i elektrofilní ataky je celá řada NH2 ^ N t N N H2N / N I > f G halogenační reakce s N-bromosukcinimidem poskytuje brom v pozici C-8 jak v případě adeninu, tak guaninu reakce s kyselinou jodoctovou: N \ nh, nh2 n i n n n n r o o pomalá alkylace v slabě o kyselém prostředí nn n n n r nh zvýšená teplota, alk. prostředí Fischer-Dimrothův přesmyk n n r karboxyskupina na N6 nh2 o T o ho fr + Modifikace DNA ■ in vitro enzymová synthesa DNA polymerasou pomocí komplementárního templátového vlákna ■ do reakční směsi se přidají pozměněné nukleotidy, schopné párování, které tak do struktury DNA vnesou žádané funkční skupiny ■ je-li vyžadováno správné párování, tak stupeň substituce max. 30-40 modifikovaných míst/1000 bází - derivatizace na cukr-fosfátové kostře nebo na koncích vlákna párování nevadí ■ pozměněné base - deriváty s biotinem, nebo methylenový řetězec s volnou aminoskupinou - menší modifikace - není ovlivněna rychlost připojování bází ■ mnohočetné včlenění značených bazí může být nevýhodné pro hybridizační reakci Derivatizované base o O o HN^'^NH HN |T|-I II5 000 . II II II O— P— O— P— O— P—OH 1 I I O O O H N ■ biotin-11-dUTP O O ■ biotin-14-dATP 'O-v ->^v O O O O— P— O— P— O— P— OH I I I O O O NH2 NH NN NH2 000 . II II II O— P— O— P— O— P—OH 1 I I O O O ■ 8-aminohexyl-dATP OH OH OH Metoda náhodných primerů ■ směs náhodných hexanukleotidových úseků sloužících jako 3'-OH primery s templátovou DNA ■ modifikované nukleotidy se připojují pomocí DNA polymerasy I - pouze Klenowův fragment, který postrádá 5'-3' exonukleasovou aktivitu přítomnou v nativním enzymu z E. coli ■ výsledkem je náhodné včlenění značených bazí Nick-translace ■ nick-translační značení účinkuje na dvojitou šroubovici ■ směs pankreatické deoxyribonukleasy I (DNasa I) a DNA polymerasy I ■ v přítomnosti Mg2+ DNasa (v limitujícím množství) provádí hydrolýzu pouze v jednom vlákně ■ vzniklé štěpy jsou však ihned zaplněny přítomnými modifikovanými i nativními nukletidovými monomery za katalysy DNA polymerasy ■ výsledkem je modifikace původní molekuly dsDNA Značení v průběhu PCR nejúčinnější metodou je provést značení DNA v průběhu polymerasové řetězové reakce (PCR) - současně se samozřejmě zmnoží množství původní DNA ■ buď se do reakční směsi prostě přidají značené nukleotidy a jsou náhodně vestavovány do nově syntetizovaných řetězců o......$ IMI nebo je možné použít pouze značené primery (např. biotinylované) ^plllllll Koncové značení cílem je zamezit modifikaci uprostřed řetězce DNA využití terminální transferasy - přidává nukleotidy ke 3'-OH koncům DNA bez potřeby templátového vlákna např. také pro radioaktivní značení ....................... Sekvenčně-specifické značení rozpoznání cílového místa, vytvoření kovalentní vazby se značkou DNA methyltransferasy (MTasy) - přenáší methylovou skupinu z S-adenosyl-L-methioninu (AdoMet) na A nebo C zbytky methylová skupina se nahradí něčím "užitečnějším" -aziridinový reaktivní zbytek pro vytvoření kovalentní vazby s DNA v průběhu enzymové methylace, biotinová skupina připojena v postranní části značení DNA v předem určeném místě, daném polohou cílové sekvence MTasy Značení pomocí methyltransferasy Fosforamidová metoda ■ aktivace konc. fosfátu EDC vede s aminy k fosforamidům ■ reakci lze provést také s imidazolem, čímž vznikne fosforimidazolidový produkt - má ve vodném prostředí prodlouženou životnost a reaguje velmi dobře s aminy - vyšší výtěžky fosforamidové reakce oligonukleotid s5'-Pi /r\y\y- o -O—P—OH O" CH3 H CH3 EDC aktivní EDC fosfodiester o NN H CH3 I CH3 imidazol fosforimidazolid o -o—P—OH M-' H3C N H H3C Fosforimidazolid Modifikace RNA ■ molekuly RNA obvykle jednořetězcové, vnitřní vzájemně komplementární krátké sekvence ■ párování vede ke vzniku různých třídimenzionálních struktur (helikální úseky, smyčky, vlásenky, G-kvartety...) ■ další změnou oproti DNA je existence diolového uskupení v molekule ribosy - lze specificky oxidovat jodistanem, na reaktivní aldehydové skupiny ■ vhodně orientované struktury RNA (i DNA) mohou vytvářet vazebná místa, komplementární k jiným biomolekulám - APTAMERY - možnost náhrady protilátek - tyto vazebné struktury, tzv. aptamery, lze vytvářet uměle kombinatorickými postupy (SELEX, systematic evolution of ligands by exponential enrichment) - nejznámější je aptamer vážící thrombin Modifikace sacharidů ■ volné existují v monomerní, oligo- a polymerní formě ■ vázané ve formě konjugátů s proteiny (glykoproteiny) nebo lipidy (glykolipidy) ■ reaktivní skupiny - hydroxyly a oxoskupiny - monosacharidy - dle polohy oxo skupiny aldosy a ketosy - ve vodném prostředí přítomna zejména hemiacetalová forma - glukosa jako glukopyranosa a fruktosa jako fruktofuranosa oh - následně jsou přirozené oxoskupiny jsou méně reaktivní ■ k modifikaci se využívají postranní glykosidické skupiny pokrývající povrch glykoproteinů ■ velký význam má derivatizace polysacharidových matric sloužících jako stacionární fáze (separace, sensory, ...) Aktivace bromkyanem BrCN ■ klasická metoda aktivace polysacharidových materiálů ■ nevýhodou je vysoká jedovatost činidla ■ výhodou dobré výtěžky reakce ■ reakce probíhá v alkalickém prostředí, rozsah je úměrný koncentraci činidla ■ meziprodukt imidokarbonát reaguje s aminoskupinou biomolekuly B za vzniku různých derivátů: i— i— oh oh o, ^c=nh h2n— o nh o i—o—c—nh—{bj i ^c=n—QBj i_, I—oh + I—o + * I derivát N-snbstitiiovanv N-sub H— derivát isomočoviny o N-substituovaný imidokarbonát o -o—c—nh-oh N-subst. karbamát Aktivace bromkyanem Oxidace jodistanem ■ jodistan (periodate) za mírných podmínek a v neutrálním pH účinkuje na diolová uskupení v molekule sacharidů ■ vhodné i pro postranní sacharidové složky glykoproteinů - postup je např. často využíván k oxidaci peroxidasy při výrobě enzymových imunokonjugátů ■ získají se reaktivní aldehydové skupiny Reaktivní skupiny ■ obecný pohled na reaktivní skupiny bez vazby na konkrétní typ biomolekuly - univerzálně použitelné metody ■ možnosti konverze existujících skupin ■ reakce typické pro vybrané skupiny Vnášení reaktivních skupin ■ přirozené reaktivní skupiny biomolekuly nemusí dostačovat pro zamýšlené syntetické postupy ■ konjugace bílkovin - často heterobifunkční činidla, která vyžadují různé koncové skupiny v obou partnerech ■ jeden z reakčních partnerů předem upraven zavedením potřebné skupiny Thiolace (zavedení -SH) ■ volná -SH skupina je pro konjugace velmi oblíbená ■ v bílkovinách obvykle zřídka, nebo blokováno ve formě disulfidických -S-S- můstků ■ stabilita -SH špatná - oxidace (inertní atmosféra, chelatace iontů kovů - katalyzují oxidaci) + NH2 NH2 2 ■ methyl-4-merkaptobutyr- O S ] + CH3OH imidát (Trautův reagent) 1 1 ^000-- 2-iminothiolan cykl. na 2-iminothiolan (imidothioester) + NH2 2 R— NH2 NH x___^SH ■ v mírně alk. podmínkách reaguje s primárními aminy ■ alternativní methyl-3-merkaptopropionimidát poskytne kratší můstkovou část -NH2 na -SH pomocí SATA ■ N-sukcinimidyl-S-acetylthioacetát (SATA) působí konverzi aminoskupiny na thioskupinu ■ odštěpí se N-hydroxysukcinimid, produkt obsahuje chráněnou sulfhydrylovou skupinu (lze uchovávat) ■ deprotekce nadbytkem hydroxylaminu o r— nh —^\ O n— o s—\ —^ /fr-^ ch o o 2 N— oh o h /o R- n ,s x - ch3 o 2 1 HO—N H h r— n sh o CH není třeba redukce - neovlivní se tedy nativní -SH skupiny analog N-sukcinimidyl-S-acetylthiopropionát (SATP) poskytne delší můstek -NH2 na -SH: citiolon a SAMSA ■ citiolon, N-acetylhomocysteinthiolakton resp. 2-acetamido- 4-merkaptobutyrát reaguje jako Trautův reagent, reakci urychluje Ag+ reaktivní cyklický anhydrid - anhydrid S-acetylmerkapto-jantarové kyseliny (SAMSA) uvolnění -SH skupiny deprotekcí s hydroxylaminem >C=0 na -SH ■ konverze oxoskupiny (aldehyd / keton) je možná hydrazidem 2-acetamido-4-merkaptomáselné kyseliny (AMBH) ■ např. pro jodistanem oxidované sacharidy či glykoproteiny o -C00H nebo -0-P032- na -SH ■ cystamin v přítomnosti karbodiimidu (EDC) ■ vznikne amidová resp. fosfamidová vazba ■ vnesené -S-S- disulfidové uzkupení je možné přímo spojit s molekulou obsahující volnou -SH skupinu (uvolní se cysteamin) ■ nebo lze získat volnou -SH skupinu redukcí, např. DTT ■ cysteamin = 2-aminoethanethiol / 2-merkaptoethylamin / dekarboxycystein / thioethanolamin ■ cystein ■ cystin -S-S- na -SH speciální případ, k rozštěpení dojde redukcí, činidel je celá řada, např. s volnou -SH skupinou: - dithiothreitol (DTT, Clelandovo činidlo), 2-merkaptoethanol, 2-merkaptoethylamin imobilizované formy činidel - není třeba provádět separaci nadbytečného činidla odobný výsledek poskytuje i TCEP, tris(karboxyethyl)fosfin nejjednodušší redukce pomocí borohydridu NaBH4 má význam i pro štěpení nativních S-S můstků v bílkovinách Karboxyskupina místo -NH2 ■ užívají se cyklické anhydridy dikarboxylových kyselin ■ reagují s volnou aminoskupinou - otevírá se kruh a vzniká amid ■ může reagovat i hydroxyl serinu a threoninu, fenolátový anion dává nestabilní produkt ■ dočasné blokování aminoskupiny - anhydrid kyseliny citrakonové - poskytuje amidovou vazbu při pH 8, snadno hydrolyzuje při pH 3 až 4 za opětovného uvolnění aminoskupiny ■ možnosti: a sukcinanhydrid, b glutaranhydrid, c maleinanhydrid, d anhydrid kyseliny citrakonové ■ změna aminosku-piny za karboxy-skupinu mění náboj a pI dané biomolekuly ,o O J/ ,o o o a-i b \ O O O T\ o ) H3C o o O r— NH2 + r o o O O Halogenoctové kyseliny ■ kyselina jodoctová: - může reagovat s aminoskupinami lyzinu nebo imidazolového kruhu histidinu, se sulfhydrylovou skupinou cysteinu i s methylthioskupinou methioninu - reakce závisí na pH prostředí ■ další a-halogenoctové kyseliny - podobně - reaktivita derivátů klesá v řadě I > Br > Cl > F - z druhé strany v řadě sulfhydryl > imidazolyl > thioether > amin - za ekvimolárních poměrů a v mírně alkalickém prostředí jodacetát reaguje exkluzivně s cysteinovým zbytkem ■ kyselina chloroctová slouží k derivatizaci hydroxylových skupin v polysacharidových matricích (dextran) - reakce probíhá v alkalickém pH: R-OH + Cl M O -HCl R O Vnesení aminoskupiny nejběžněji konverze karboxylu pomocí diaminů v přítomnosti karbodiimidu (EDC) - vzniká amidová vazba a druhá koncová aminoskupina zůstává volně k dispozici NH2 ethylendiamin (krátký můstek) H2 hexamethylendiamin (1,6-diaminohexan) NH2 3,3'-iminobis(propylamin) -O- ^O^^NH2 Jeffamin EDR-148 (hydrofilní) H2N H2N H2N H2N ■ konverze karboxyskupiny na aminoskupiny výrazně ovlivní celkový náboj biomolekuly a také její pI hodnotu - často je to zamýšleným účelem modifikace -SH na -NH2 ■ lze pomocí aminoethyl-8,N-(jodoethyl)trifluoracetamidu: R— SH ÓH - deblokace v druhém kroku je spontánní ■ ethylenimin v alkalickém prostředí - reakce převážně pouze s Cys - činidlo může vznikat přímo v alk. směsi cyklizací z 2-bromoethylaminu h Aldehyd na -NH2 ■ redukční aminace pomocí amoniaku nebo diaminu v přítomnosti kyanoborohydridu sodného NaCNBH3 - vzniká Schiffova báze, pak stabilizována redukcí - lze takto připravit např. aminovaný dextran po předcházející oxidaci jodistanem - nedochází k redukci aldehydické skupiny -NH2z tyrosinu ■ nitrace pomocí tetranitromethanu ■ nitroskupina se zredukuje na aminoskupinu ■ lze výhodně aktivovat kyselinou dusitou na diazoniovou sůl pro kopulační reakce no2 nh2 Aminoskupina na aldehyd ■ sukcinimidyl-p-formylbenzoová kyselina (SFB) ■ sukcinimidyl-p-formyl-fenoxyoctová kyselina (SFPA) - při reakci vzniká amidová vazba, v případě proteinů výrazně narůstá jejich hydrofobicita Glutaraldehyd Schiffova báze -C=N-je redukována stabilnější formu (A) reagují i oligomerní adukty glutaraldehydu (E), probíhá adice aminoskupiny n dvojnou vazbu (B) o. kondenzace na cykl pak reakce s lyzinovým zbytky - zesítění tvorba smíšených konjugá málo definované a čas vysokomolekulární H E produkt (C), cyklická hemiacetalová forma se vyskytuje zejména v kyselém prostředí, může dále polymerovat (D) a,p nenasycený aldehydový polymer (E) vzniká při zásaditém pH H H GA Jí^ NaCNBH3 ^.. H O ■ O HOO OH C HH kyanoborohydrid neredukuje aldehydy, borohydrid ano! J H HO H H O O D 2 O Biokonjugační reakce ■ spojení dvou biomolekul - vyžaduje činidla, která dokáží spojit přímo dvě různé nebo shodné povrchové skupiny na obou různých molekulách ■ přímé spojení biomolekul bez přítomnosti nějaké můstkové spojovací struktury - zero length crosslinkers karbodiimidy, karbonyldiimidazol, aldehyd + aminoskupina ■ včlení se spojovací můstek požadované definované délky tzv. linker- bifunkční činidla Homobifunkční síťující činidla ■ symetrická činidla, co mají dvě shodné reaktivní skupiny ■ činidlo se spojí jedním koncem s biomolekuly A ■ druhý konec se spojí s biomolekulou B ■ vznikne A-B konjugát (to je žádaný produkt) - nežádoucí produkty: A-A, B-B, oligomerní AxBy, prokřížení skupin v rámci jedné molekuly A (nebo B) ■ průběh je málo definovaný ■ provádění reakce - jednokrokově - vše se smíchá dohromady - pak vznikají často oligomerní, případně i precipitující produkty - nejprve biomolekulu A smíchat s konjugačním činidlem a nechat proběhnout její modifikaci, odstranit nadbytek činidla (např. dialýzou) a pak přidat druhou biomolekulu B ■ komplikace - nestabilita reaktivních skupin ve vodném prostředí - mimo konjugaci probíhá i hydrolýza ■ přes uváděné nedostatky se běžně a úspěšně využívají Homobifunkční NHS estery karboxylové skupiny aktivované N-hydroxysukcinimidovou skupinou (NHS) (nebo sulfo-NHS) - velmi reaktivní vůči nukleofilním -NH2 obecná struktura NHS-z-NHS, z značí střední část = spojovací můstek: O O O O O z O O O R'— NH2 R— NH2 -v-v- NHS NHS OO XX. RX XX XX N z N H H dithiobis(sukcinimidylpropionát) (DSP nebo DTSP), Lomantovo činidlo, z = 1,2 nm, disulfidové uskupení může být rozštěpeno pomocí DTT nebo merkaptoethanolu - sulfonovaná varianta: 3,3'-dithiobis(sulfo-sukcinimidyl -propionát) (DTSSP) - rozpustný ve vodě ■ DSP a vznikající produkt: R-z-R' SR' O R S S O Další NHS bifunkční činidla • disukcinimidylsuberát (DSS), C8 alifatický můstek, z = 1,14 nm - existuje sulfovarianta bis(sulfosukcinimidyl)suberát (BS3) - hydrofilní BS3 je výhodný k prokřížení (bílkovinných) komplexů na povrchu buněk - činidlo neprochází buněčnou membránou - kratší C5 můstek, z = 0,77 nm, poskytuje disukcinimidylglutarát (DSG) disukcinimidyltartrát (DST) vytváří kratší můstek o délce 0,64 nm - přítomnost dvou hydroxylů uprostřed můstku umožňuje rozštěpit spojení použitím mírné oxidace jodistanem nejkratší spojení vytvoří N,N'-disukcinimidylkarbonátu (DSC) - spojením vzniká substituovaný derivát močoviny, vůči nukleofilůmje extrémně reaktivní - nelze použít ve vodném prostředí, hydrolýzou vzniká CO2 a 2 NHS - pro derivatizaci polyethylenglykolů - spojí hydroxy a aminoskupinu za vzniku karbamátového uskupení - napřed se v nevodném prostředí aktivuje PEG, ten pak může ve vodném prostředí reagovat s proteiny (pegylace) Homobifunkční imidoestery imidoesterová (jinak imidátová) skupina ve vodném prostředí reaguje s aminoskupinou za vzniku imidoamidu (amidinu) - činidlo i produkt jsou ve vodném prostředí protonovány na imidovém dusíku, tedy dobře rozpustné NH NH NH NH R'— NH2 R— NH2 II II 2 I 2 R'\ yR H3CV /J-1^ ^CH3 -^-^-> N z N O z O * * H H CH3OH CH3OH amidinová vazba je stabilní v mírně kyselém prostředí, při vyšším pH může hydrolyzovat činidla jsou na bázi imidoderivátů dikarboxylových kyselin: - dimethyl adipimidát (DMA, C6 z = 0,86 nm) - dimethyl pimelimidát (DMP, C7 z = 0,92 nm) - dimethyl suberimidát (DMS, C8 z = 1,1 nm) DMP stabilizuje komplexy protilátek s proteinem A dimethyl-3,3'-dithiobispropionimidát (DTBP) obsahuje uprostřed disulfidové spojení (z = 1,19 nm) - může být případně rozštěpen DTT Homobifunkční činidla spojující -SH skupiny ■ dvě skupiny podle stability vznikajícího spojení: - disulfidová vazba - spojení lze snadno rozrušit pomocí oxidačních činidel - thioetherová vazba - spojení trvanlivé ■ 1,4 di-[3'-(2-pyridyldithio)-propionamido] butan (DPDPB) - reverzibilní spojení biomolekul, z = 1,6 nm, 14 atom. řetězec - odštěpovaný pyridin-2-thion lze sledovat při 343 nm - pro vytváření konjugátů redukovaných molekul protilátek s enzymy O Thioetherové spojení ■ bis(maleimido)hexan (BMH) reaguje v neutrálním prostředí za vzniku stabilního spojení (z = 1,6 nm) ■ dochází k adici sulfhydrylových skupin na dvojné vazby v cyklu a vznikají tak stabilní thioetherové vazby - mechanismus vychází z použití N-ethylmaleimidu (NEM) jako inhibitoru cíleného na SH skupinu Homobifunkční aldehydy ■ dříve zmíněný glutaraldehyd ■ formaldehyd - nejkratší spojovací můstek, reaguje prostřednictvím ■ Mannichových kondenzací (A) - spojuje sloučeniny s aktivovanými vodíky (např. na jádře fenolu v ortho a para polohách) s formaldehydem a dále s aminoskupinou ■ přes imoniový kationt s aminoskupinou (B) - spontánně vznikne reaktivní imoniový kation, který zreaguje s další aminoskupinou a dojde ke spojení přes C1 můstek R R A + Jl^ + R' NH2 H H "R' OH OH O A. H I H + + R—NH2 —^ » R—NH2—CH—OH—h o* R—NH=CH2 B R'—NH2 H H R' R Bis-epoxidové sloučeniny ■ jsou schopné spojovat biomolekuly obsahující nukleofilní skupiny včetně aminů, hydroxylů a sulfhydrylů ■ dochází k otevření tříčlenného epoxidového kruhu (A) ■ reakce probíhají v mírně alkalickém prostředí ■ k aktivaci matric nesoucích hydroxylové skupiny (polysacharidy) ■ nejznámějším činidlem je 1,4-butandiol diglycidylether (B) Fotoreaktivní crosslinkery ■ bis[P-(4-azidosalicylamido)ethyl]disulfid (BASED) je aktivován ozářením UV světlem (270 nm) ■ uvolní se molekula dusíku a vznikne velmi reaktivní a nestálý arylnitren - rychle se přemění za rozšíření aromatického kruhu na dehydroazepin, ten následně reaguje s aminoskupinou biomolekuly ■ derivát vzniklý po konjugaci obsahuje na 7-členném kruhu fenolický hydroxyl, který ho aktivuje např. pro elektrofilní značení radioaktivním jodem další možnosti... ■ aktivované vodíky na aromatickém jádře - diazoniové deriváty ■ úspěšné spojení se projeví oranžovým nebo ještě tmavším zbarvením vzniklých konjugátů -charakteristické pro diazosloučeniny ■ diazoniové sloučeniny se obvykle generují z příslušných diaminů -o-tolidin a benzidin (p-diaminodifenyl) - reakcí s NaNO2 v slabě kyselém prostředí v chlazené reakční směsi ■ vzniklá diazoniová sůl reaguje ochotně se zbytky tyrosinu a histidinu ■ ■ difluorbenzenové deriváty - atomy fluoru na vhodně aktivovaném aromatickém jádře (např. pomocí nitroskupin) reagují substitučně s aminoskupinami - mohou ale reagovat i jiné nukleofily ■ dostupná činidla jsou 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenzen (DFDNB) nebo 4,4'-difluoro-3,3'-dinitrodifenylsulfon (DFDNPS) Heterobifunkční konjugační činidla ■ obsahují dvě různé reaktivní skupiny - spojí se s různými funkčními skupinami konjugovaných biomolekul ■ použití obvykle probíhá ve dvou nebo třech krocích - výrazně se omezuje množství oligomerních nebo polymerních produktů - činidlo je smícháno s první biomolekulou, kterou derivatizuje svou reaktivnější skupinou - nadbytek činidla je odstraněn (dialýza, gelová filtrace) - druhá reaktivní skupina je obvykle stabilnější a následně reaguje s druhou biomolekulou ■ variabilita reaktivních skupin - lze lépe vybrat cílové místo - menší narušení důležitých aktivních míst (epitop antigenu, vazebné místo protilátky, aktivní místo enzymu ...) ■ důležitá je i spojovací můstková část - linker - může být samozřejmě pasivní - může být cílem dalších reakcí, zejména se jedná o rozštěpení - význam pro zachování bioaktivity konjugátu má délka a polarita linkeru Spojení -SH a -NH2 ■ nejčastější vzhledem k běžné dostupnosti cílových skupin v bílkovinách ■ pro aminoskupinu je v činidle nejčastěji přítomna NHS skupina v kombinaci s několika možnostmi pro SH skupiny ■ N-sukcinimidyl-3-(2-pyridylditio)propionát (SPDP) poskytuje amidovou vazbu s biomolekulou nesoucí -NH2 a disulfidovou vazbu s biomolekulou nesoucí -SH: p N—O N I. OO SPDP R—NH2 1 S N: S-A A R s—v» /) N pro SPDP je z = 0,68 nm s delším řetězcem (z = 1,12 nm) pod názvem LC-SPDP (long-chain) rozpustnější se sulfonovanou NHS skupinou - Sulfo-LC-SPDP R — SH RN S O S S—R NHS sukcinimidyloxykarbonyl-a-methyl-a-(2-pyridyldithio)toluen (SMPT) - můstek tvořený benzenovým jádrem a methylovou skupinou chránící disulfidovou skupinu (sterická zábrana ataku) zlepšuje trvanlivost konjugátů - analog Sulfo-LC-SMPT - spojení biomolekul lze rozebrat vmístě -S-S- vazby redukcí (např. DTT) „nerozebíratelné" spoje používají pro SH skupinu maleimidovou nebo jodacetátovou reaktivní část - sukcinimidyl-4-(N-maleiimidomethyl)cyklohexan-karboxylát (SMCC) z = 1,16 nm) další alternativní činidla: m-maleimidobenzoyl-N-hydroxysukcinimidoester (MBS, 0,99 nm), sukcinimidyl-4-(p-maleimidofenyl)butyrát (SMPB, 1,45 nm) a N-(Y-maleimidobutyryloxy)-sukcinimidester (GMBS, 1,02 nm) N-sukcinimidyl(4-jodoacetyl)-aminobenzoátem (SIAB, 1,06 nm) alternativní činidla - sukcinimidyl-6-[(jodoacetyl)-amino]hexanoát (SIAX) - jeho varianta s můstkem prodlouženým o aminohexanovou kyselinu, tj. sukcinimidyl-6-[6-(((jodoacetyl)amino)-hexanoyl)amino]hexanoát (SIAXX) - sukcinimidyl-4-(((jodoacetyl)amino)methyl)cyklohexan-1-karboxylát (SIAC) s analogem SIACX mají objemnějšíspojovacímůstek p-nitrofenyljodo-acetát (NPIA) vůči -NH2 reaguje podobně jako NHS, vzniká také amidová vazba - výhodou může být krátké spojení mezi biomolekulami Spojení >C=0 a -NH2 ■ pro konjugaci zejména sacharidů (a glykoproteinů) - oxoskupina se snadno generuje mírnou oxidací jodistanem - reaguje s ní zejména hydrazidová skupina - z druhé strany se účastní skupiny popsané již dříve ■ hydrazid kyseliny 4-(4-N-maleimidofenyl)-máselné (MPBH), z = 1,79 nm - je vhodné provést reakci nejprve s SH skupinou, purifikovat produkt a následně připojit aldehydovou skupinu. ■ rozebíratelné spojení se získá 3-(2-pyridyldithio)-propionylhydrazidem (PDPH) Amino- a fotoreaktivní konjugační činidla ■ jedna část činidel je aktivována světlem - arylazidy, fluorované aryl azidy, benzofenony, některé diazosloučeniny a diazirinové deriváty - první konjugační reakce napojí činidlo na biomolekulu (pracovat ve tmě) - odstraní se nadbytek činidla a navázaná fotoreaktivní skupina pak po osvětlení reaguje s partnerskou biomolekulou ■ N-hydroxysukcinimidyl-4-azidosalicylát (NHS-ASA, 0,80 nm) - derivatizuje aminoskupiny obvyklým způsobem - vznik amidové vazby - k dispozici jsou i varianty Sulfo-NHS-ASA a Sulfo-NHS-LC-ASA (1,8 nm) ■ fenolický hydroxyl aktivuje benzenové jádro pro značení radioaktivním jodem, to lze provést před fotoreakcí - k dispozici jsou varianty bez hydroxylu na benzenovém jádře: ■ N-hydroxysukcinimidyl-4-azidobenzoát (HSAB, 0,90 nm) ■ případně s nitroskupinou N-5-azido-2-nitrobenzoyloxysukcinimid (ANB-NOS, 0,77 nm) ■ štěpitelné konjugáty poskytuje sulfosukcinimidyl-2-(p-azidosalicylamido)ethyl-1,3'-dithiopropionát (SASD, 1,89 nm) ■ linker může být alifatický řetězec u N-sukcinimidyl-6-(4'-azido-2'-nitrofenylamino)hexanoátu (SANPAH, 1,82 nm) - nitroskupina podporuje fotoaktivaci již nad 320 nm ■ sulfosukcinimidyl-2-(7-azido-4-methylkumarin-3-acetamid)ethyl-1,3'-dithiopropionát (SAED, 2,25 nm) - vzniklý konjugát obsahuje fluoreskující uskupení - derivát kumarinu - lze tak pohodlně sledovat pohyb konjugátu - fluorescence se přitom iniciuje až po fotolytické reakci ■ podobně se chová sulfosukcinimidyl-7-azido-4-methylkumarin-3-acetát (Sulfo-SAMCA, 1,28 nm) R— H ■ alternativní fotolytickou skupinou je diazopyruvátové uskupení - poskytuje reaktivní karbenové uskupení, které se přemění Wolfovým přesmykem (W) na ketenové uspořádání - pak aduje nukleofilní skupinu - p-nitrofenyldiazopyruvát (pNPDP) ■ podobným mechanismem reaguje i p-nitrofenyl-2-diazo-3,3,3-trifluoropropionát (PNP-DPT) Sulfhydrylová a fotoreaktivní konjugační činidla ■ kombinací předchozích skupin je l-(p-azidosalicylamido)-4-(jodacetamido)butan (ASIB) a N-[4-(p-azidosalicylamido)butyl]-3'-(2'-pyridyldithio) propionamid (APDP) ■ jinou fotoaktivní část obsahuje benzofenon-4-jodacetamid - výhoda benzofenonu - možnost opakovaného průběhu fotoaktivace i po nekonjugační zpětné rekombinaci volných elektronů - vyšší výtěžky konjugace - alternativní SH-reaktivní část má benzofenon-4-maleimid Další fotokonjugace ■ s guanidinovou skupinou argininu může reagovat p-azidofenyigiyoxa! (APG) pro napojení fotoaktivní části na aldehydovou skupinu je použitelný p-azidobenzoylhydrazid (ABH) karboxyskupina může být fotoaktivována pomocí 4-(p-azidosalicylamido) butylaminu (ASBA) - jeho volná aminoskupina se spojí s karboxylem v přítomnosti karbodiimidu, kdy vznikne amidová vazba Fluorescenční metody ■ široké použití v oblasti výzkumu i praktické aplikace ■ bioanaiytické metody - klinická chemie (fiuorogenní substráty při stanovení enzymů) - imunochemické metody (ELISA, FIA fiuoresceční imunoanaiýza) - genetické anaiýzy a DNA biočipy - monitorování prostředí (fiuorecenční proby) ■ biomedicína - identifikaci a separace buněkv průtokové cytometrii - zobrazení buněčných komponent ve fiuorescenční mikroskopii a anaiýze obrazu - konformace a dynamika buněčných systémů Fluorescence intenzita \0 zdroj světla fluorescence (kolmo na excitační paprsek) detektor fluorescence = fotoluminiscence, \f emise světelného kvanta při návratu l0 >> \f \ elektronu z vyšší energetické hladiny, kam byl vybuzen fotoexcitací fluorescence F se udává při určité vlnové délce - emisní x excitační spektra - relativní vyjádření, alternativně jako intenzita světelného toku na jednotkovou plochu ("count") další charakteristiky: kvantový výtěžek 0, střední doba života t, polarizace P (směr kmitání el. vektoru emg. vlny) fluorescence prakticky ihned (10-8 s) po skončení excitace ustane fosforescence trvá delší dobu, při excitaci vzniká metastabilní stav energetické přechody - Jablonského diagram: (vznik a zánik excitovaných stavů) If = k®£cl Fluorescence absorbce vnitřn přechod absorbce kolize --^ přechod mezi systémy vnější přechod So, S1P... energetické h|adiny fluorescence fosforescence t = 1015s 108s 10-3-1 s neradiační přechody ý vibrační hladiny ■ Kashovo pravidlo: - před emisí dochází k relaxaci vibrační energie a vnitřní konverzi, takže fluorescenční přechod nastává z nejnižší vibrační hladiny prvního excitovaného stavu S1 ■ Vavilovův zákon: - kvantový výtěžek a doba trvání excitovaného stavu složitých molekul v roztoku nezávisí na vlnové délce budícího záření - obecná vlastnost fluorescence: emisní spektra jsou nezávislá na vlnové délce excitace ■ Zcadlová symetrie mezi absorpčním a fluorescenčním pásem: - absorpce i emise z odpovídajících si vibračních hladin mají stejnou relativní pravděpodobnost. Většina absorbujících i emitujících molekul se nachází v rovnovážném vibračním stavu, přičemž vibrační struktura základního i excitovaného stavu mají stejnou strukturu - po absorpci přechází elektron z rovnovážné vibrační hladiny stavu S0 na vyšší vibrační hladinu stavu S1, poté dochází k rychlé relaxaci na stavu S1 (v čase 10-12-10-13 s) a teprve poté následuje zářivý přechod na vyšší vibrační hladinu stavu S0 a další vibrační relaxace na rovnovážnou vibrační hladinu stavu S0 - výjimky jsou důsledkem rozdílného geometrického uspořádání atomových jader v excitovaném a základním stavu ■ Stokesův posuv - rozdíl v energiích mezi maximy absorpčního a emisního pásu Sledování a měření fluorescence ■ spektrofluorimetry - měří střední signál celého vzorku v kyvetě nebo v jamce mikrodestičky ■ fluorescenční mikroskopy - umožňují pozorovat fluorescenci dvoj-nebo trojrozměrných mikroskopických objektů ■ fluorescenční skenery (i "čtečky" mikrodestiček) - měří fluorescenci 2D makroskopických objektů (elektroforetické gely, bloty, chromatogramy) ■ průtokové cytometry - měří fluorescenci velkého množství jednotlivých buněk a umožňují identifikaci a separaci jejich subpopulací ■ měření relaxačních časů (pulzní, nebo fázový posun - frekvenčně modulované světlo) ■ fluorescenční korelační spektroskopie (FCS) - fluktuace intenzity F v mikroobjemu (10-151) určeném fokusovaným laserovým excitačním paprskem - rychle difundující fluorofory - fluktuace fluorescence (nedochází ke zprůměrování), její časová závislost se analyzuje pomocí autokorelační funkce (informace o kinetice, difúzi, koncentraci molekul ve vzorku) Rozdělení fluoroforů ■ vlastní (vnitřní, intrinsic) - přirozený výskyt - proteiny (Trp, Tyr, Phe), NADH, FAD, FMN, chorofyl - fykobiliproteiny, green fluorescent protein (GFP) ■ nevlastní (vnější, extrinsic) - přidávají se ke vzorkům, které samy nemají fluorescenční vlastnosti ■ fluoresceční značky (váží se kovalentně) ■ fluoresceční sondy (váží se nekovalentně) - fluorofory, jejichž kvantový výtěžek, případně i spektrální vlastnosti se výrazně mění po navázání na bílkoviny, nukleové kyseliny, membrány aj. - studium změn konformace, membránového potenciálu, polarity a viskozity prostředí ■ fluorescenční indikátory (chemické sondy) - spektrální vlastnosti nebo intenzita fluorescence jsou citlivé na přítomnost dalších látek - zjištění koncentrace Fluoresceční značky ■ klasické: organická barviva, fluorescentní bílkoviny, cheláty lanthanidů - dobře rozpustné ve vodě, snadné použití, mnoho existujících protokolů a aktivovaných forem - ale široké spektrální pásy, náchylné na fotorozklad ■ moderní - polovodičové kvantové tečky, anorganické nanočástice dopované lanthanidy, nanočástice latexu a křemičitanů s navázanými fluorofory - díky pokroku v oblasti materiálových věd Fluorescein - nejčastěji používaný fluorofor - výhody: vysoká absorbce, velké 0, nízká cena - exc. lze při 488 nm Ar laserem (kofokál. mikrosk., cytometrie) ■ fluorescein-5-isothiokyanát - FITC, 494 / 520, s -NH2 skupinou dává thiomočovinové uskupení j výhodnější je NHS-fluorescein - reaguje rychleji, stabilnější produkt na -SH skupiny: 5-jodoacetamidofluorescein (5-IAF) a fluorescein-5-maleimid ■ na aldehydové či oxoskupiny: - fluorescein-5-thiosemikarbazid, dá hydrazonovou vazbu - použitelný např. pro značení cytosinůvDNA či RNA po jejich aktivaci hydrogensiřičitanem na sacharidové zbytky: NHS-fluorescein - fluorescein-dichlorotriazin (DTAF), i na jiné biomolekul s volnými alifatickými hydroxyly, také na tubulin Problémy s fluoresceinem ■ náchylný na fotorozklad - signál vydrží pouze pár minut ■ pH závislost fluorescence - výrazně klesá signál pro pH pod 7 ■ existence isomerů - může komplikovat geometrii vazby k proteinům, následně eluční časy v chromatografii, migraci v gelech ■ méně vhodný pro "ultracitlivé" aplikace Rhodaminy 1 r O 0 sulforhodamin 101 1 II (Texas Red) SO -j]l o- \* tetramethylrhodamin (TMR) rhodamin B S03- + O NH2 1 1 + O O I i U O k \^ 0" rhodamin 6G rhodamin 110 TRITC ,^,N S strukturně podobné fluoresceinu, který doplňují - místo atomů kyslíku jsou na postranní cykly vázány dusíkové atomy - mohou nést různé substituenty a tím je dostupná široká škála variant emise probíhá při delších vlnových délkách ve srovnání s fluoresceinem - použitelné pro techniky s dvojím značením - vyšší fotostabilita a dobrá excitovatelnost světlem rtuťových výbojek ■ sulforhodamin B, jinak Lissamin rhodamin B - obsahuje na dolním aromatickém jádře dvě sulfoskupiny v polohách 3 (vpravo nahoře) a 5 (dole) (Imperial Chemical Industries) ■ sulforhodamin 101, Texas Red (Molecular Probes) - emitující nad 600 nm ■ tetramethylrhodamin-5-isothiokyanát (TRITC) resp. (TMR) - od tetramethylrhodaminu, nejběžnější značkovací činidlo z této skupiny, (544 / 570), £544 = 105 M cm-1 - reakce s aminoskupinou probíhá analogicky jako u FITC - karboxytetramethylrhodamin (TAMRA) další alternativa ■ NHS-rhodamin (5-karboxymethylrhodamin sukcinimidylester) (544 / 576) • karboxy-X-rhodamin (ROX) - značení oligonukleotidů, sekvenování ■ Lissamin Rhodamin B sulfonylchlorid (556 / 576) - má v 5-pozici reaktivní skupinu -SO2Cl - s -NH2 vzniká sulfonamid - podobně existuje sulfonylchlorid i od Texas Red derivátu ■ na derivatizaci SH: tetramethylrhodamin-5-jodacetamid (540 / 567) ■ pro reakci s aldehydy Lissamin rhodamin B sulfonylhydrazin - má v 5 poloze skupinu -SO2-NH-NH2) (560 / 585) - sulfonylhydrazin Texas Red emituje při delší vlnové délce (580 / 604) Rhodaminy - zhodnocení ■ fiuorescence v červené obiasti ■ vyšší stabiiita než fiuorescein ■ excitovat (při 520 nm) ize rtuťovou výbojkou Alexa Fluor rhodaminový nebo kumarinový skeiet dopiněný o suifoskupiny vyšší rozpustnost ceiá odstupňovaná řadu sioučenin s posunujícími se exc. a emis. maximy napojení na značené biomoiekuiy probíhá v doiní části moiekuiy přes karboxyi v poioze 5 aktivovaný např. NHS skupinou - jsou přítomny i isomery se skupinou posunutou do poiohy 6 Ifl AlMBFIunr7Sn- Značení AlexaFluor imunolokalizace ribulosabisfosfát karboxylasy v 2.0 um řezu listu kukuřice (C4, separovány fotosynt. složky mezi mezofil a svazky cévní) - anti rubisco Ab, Alexa Fluor 488 kozí Ab anti králičílgG - autofluorescence chlorofylu (červeně, v mezofylových plastidech) - lignin (matně zelený) v xylemu svazků - kutin (jasně zelený) v kutikule vně epidermis periferní neurosystém embrya Drosophily: - mAb 22c10 anti mikrotubuly, Alexa Fluor 488 králičí Ab anti-myší IgG - dělící se buňky - Ab anti histon-H3, Alexa Fluor 594 kozí Ab anti králičí IgG - jádra DAPI (modrá fluorescence) Kumariny 4-methyl -7-hydroxykumarin excitace^ f\ emise kumarin = 2H-1-benzopyran-2-on je přírodní látka 7-amino-4-methylkumarinové deriváty, zejména 7-amino-4-methylkumarin-3-octová kyselina (AMCA) (345 / 450) - pro -NH2 AMCA-NHS - pro -SH AMCA-HPDP - pro aldehydy AMCA-hydrazid 7-diethylamino-3-[(4'-(jodacetyl)amino)-fenyl]--4-methylkumarin (DCIA) - velmi intenzívní fluorescence (382 / 472) - na světle nestabilní »0 350 400 460 500 550 (nm)x BODIPY ■ 4,4-difluoro-4-bor-3a,4a-diaza-s-indacen - nemá ionizovatelné skupiny - málo ovlivněn pH - vysoké absorbance a vysoké kvantové výtěžky fluorescence - menší komplikací jsou malé Stokesovy posuny pod 20 nm ■ modifikace v krajních polohách postranních cyklopentadienů - deriváty s posunutými spektrálními charakteristikami - pro -NH2 existuje BODIPY FL C3 SE s postranní NHS skupinou (502 / 510) - komplikací je vzájemné zhášení, pokud je stupeň substituce vyšší - dostupné deriváty s jodacetamidovou a hydrazidovou skupinou ■ deriváty BODIPY 530/550 C3-X - maxima k vyšším vlnovým délkám - přítomnosti objemných aromatických postranních substituentů - reaktivní skupinou X může být NHS nebo hydrazid ■ bromderivát Br BODIPYpro substituce sulfhydrylových skupin Cascade blue ■ od sulfonovaného pyranu - vlastnostmi vhodně doplňuje fluorescein při multiznačení - výborná rozpustnost ve vodě - dobré kvantové výtěžky (kolem 50%) - malá úroveň vzájemného zhášení při vyšších substitučních poměrech - mateřská sloučenina má na horním jádře vpravo pouze methoxyskupinu. ■ pro značení aminoskupin - acetylazidový derivát (375+400 / 410) - při vyšších teplotách - kolem 80 °C v DMF probíhá přesmyk azidového uskupení na isokyanátovou formu a odštěpí se molekula dusíku - isokyanát reaguje s volnými hydroxyly, vzniká urethanové uskupení - další formy mají v postranní části hydrazinový, ethylendiaminový nebo kadaverinový (pentamethylendiaminový) zbytek Lucifer yellow z z = f ^NH2 L HN HN O ,Xs \ HN O ■ základní sloučeninu z = H XX ■ deriváty 4-aminonaftalimid- SO3H ^ J SO3H -3,6 disulfonátu NH2 í ■ napojení se realizuje přes horní imidový atom dusíku - jodacetamidový derivát (na -SH) - hydrazidová skupina (Lucifer Yellow CH, na aldehydy) - optické parametry (427 / 530) ■ především v cytochemii Cyaninové fluorofory ■ velmi populární zejména v oblasti DNA biočipů využívajících cDNA fragmenty jako imobilizované próby ■ základem je indokarbocyaninový skelet - je sulfonován, obě aromatické části jsou spojeny uhlíkatým můstkem s konjugovaným systémem dvojných vazeb (methin) ■ je k dispozici odstupňovaná řada fluoroforů (Amersham Biosci.) -SO3H ř pc H2SJ '-■ 7-^*$ překryvový signál (oba kanály) vzorek - Cy5 kontrola Cy3 Cyaniny - zhodnocení ■ délka polyenového spojovacího řetězce - monomethinové sloučeniny - thiazol orange (TO), oxazolle yellow (YO) nebo jejich dimery (TOTO, YOYO) -fluoreskují po vazbě na nukleové kyseliny (fluorescenční sondy) - polymethinové sloučeniny - Cy3, Cy5, ... - délka spoj. řetězce, resp. počet vinylenových -CH=CH- skupin působí bathochromní posun o cca 100 nm -fluorofory emitující až v NIR oblasti výhody NIR fluorescence - není zde už autofluorescence biologických složek - vyšší citlivosti - méně nákladná instrumentace, excitace při delších vlnových délkách problémy - úzké excitační pásy, fotorozklad, menší intenzita v NIR Fluorogenní substráty hydrolas OH OH O=P_O^-^íí O Oh O OH FDP ' O R—O deriváty resorufinu deriváty fluoresceinu, např. fluoresceindifosfát pro ALP O O N h h z-r—n\^ř\ v. M—r-z ' o BZAR rhodamin 110, bis-(A/-CBZ-L-argininamid) (BZAR), pro serinové proteinasy, (496 / 520) cca 100x citlivější než sloučeniny založené na AMC jiný příklad - rhodamin 110, bis-(AA-CBZ-L-fenylalanyl-L-arginin amid) (Z-FR-R110) pro cysteinové proteinasy katepsin B a L Fluorogenní enzymové substráty o ho—p— Oh ľ h2o ho XJ - h3po4 XJ MUP 1 ch3 T ch3 4-methylumbelliferylfosfát (MUP), po hydrolyse fosfatasou vzniká 4-methyl-7-hydroxykumarin (methylumbelliferol), modrá fluorescence, (360 / 450) deriváty 7-amino-4-methylumbelliferolu (Z-X-AMC nebo Z-X-MCA), AMC produkt (342 / 441), např. 7-amino-4-methylkumarin AA-CBZ-L-fenylalanyl-L-argininamid (Z-FR-AMC) pro stanovení serinových proteinas a plasminu, kalikreinu, katepsinu), nebo 7-amino-4-methylkumarin, A-CBZ-L-aspartyl-L-glutamyl-L-valyl-L-asparagylamid (Z-DEVD-AMC) pro kaspasu 3 alternativně deriváty 7-amino-4-trifluoromethylkumarinu, např. Z-DEVD-AFC Z-X-NH W-CBZ-je W-benzyloxykarbonyl- Lanthanidové komplexy Eu3+ a Sm3+ ve formě chelátových komplexů - atraktivní fluorescenční značky vhodné pro časově rozlišenou fluorescenci („time-resolved fluorescence", TRF) pro "přichycení"k biomolekulám slouží N1-(p-isothiokyanatobenzyl)- diethylen-triamin-N1,N2,N3,N3-tetraoctová kyselina (DTTA) která se může vázat na aminoskupiny za vzniku thiomočovinového uskupení. takto připravené komplexotvorné místo pak váže iont lanthanidu a získá se intenzivně fluoreskující značka s relativně dlouhou dobou záření po excitaci - při pulzní excitaci se vyčká, až vymizí či vyhasne nespecifická fluorescence pozadí, případně rozptýlené záření, a až pak se po krátké prodlevě změří fluorescence značky - lze použít i další lanthanidy, např. terbium a dysprosium - proces pod názvem DELFIA zavedla finská firma Wallac Oy Další chelátové struktury ■ kryptát terpyridin chelát s anténou Kvantové tečky > moderní fluoreskující polovodičové nanokrystaly > QD, "quantum dots" jsou menší než 10 nm a svým kvantovým chováním se nachází mezi polovodiči a izolovanými atomy > polovodiče - valenční a vodivostní energ. hladiny odděleny o £g - excitace - elektron přejde do vodivostní hladiny a zanechá za sebou kladně nabitou díru ve valenční hladině - prostorová separace tohoto páru ("exciton") odpovídá Bohrovu průměru a je typicky 1 až 10 nm 1 QD mají obdobnou velikost - excitony jsou v nich ohraničeny podobně jako chování částice v uzavřeném prostoru - energetické hladiny připomínají atomy či molekuly - optické vlastnosti závisí na velikosti Fotoluminiscence u QD ■ vzniká radiační rekombinací excitonů, spektráiní viastnosti jsou „iaditeiné" změnou veiikosti částic - např. u CdSe nanokrystaiů ize emisi nastavit od 450 do 650 nm - menší QD jsou „modřejší" (hypsochromní efekt) ■ výhody nanoteček oproti kiasickým fiuoroforům zahrnují - vysoký jas (20x vyšší proti jiným typům, daný veikým kvantovým výtěžkem a vysokým extinkčním koeficientem) - úzké emisní pásy pod 30 nm, veiké Stokesovy posuny - částice obsahujících různě barevné QD v různých poměrech, čímž vzniká chemický „čárový kód" umožňující identifikaci v kompiexních směsích - veimi stabiiní a nepodiéhají fotodegradaci (často se chrání proti fotooxidaci piáštěm z poiymerů nebo jiných poiovodičů (např. CdSe poviečený ZnS nebo siiikátem) - široké absorbční pásy - různě barevné QD ize excitovat stejným zdrojem světia a jednoduše tak vyhodnocovat současně různé značení odiišnými barvami při muitipiexních stanoveních ■ pro konjugaci s biomoiekuiami se nanáší reaktivní vrstvy jako tri-n-oktyifosfinoxid (TOPO) nebo hexadecyiamin Kvantové tečky (QD) unikátní fiuorescenční viastnosti - stabiiita vůči fotorozkiadu, veiké Stokesovy posuny CdTe jádro obalené CdS, rozpustnost díky vazbě thiogiykoiové kys. (TGA) prekurzory - Te, CdCi2, TGA a NaBH4 - NaHTe připraven redukcí Te pomocí NaHB4 - nástřik roztoku NaHTe do směsi CdCi2 a TGA v inertní atmosféře - refiuxace na vzduchu (minuty až hodiny) při zahřívání roste průměr QD, emisní maximum se posouvá k deiším vin. déikám větší QD mají iepší stabiiitu Nanočástice s fluorofory optické kódování na základě multiplexování vln. délek 1 polymer, uvnitř směsi různě fluoreskujících QD - charakt. spektrum 1 možnost identifikace cílových biomolekul ve směsích při užití kombinatorických postupů A OOO A e e B 1 c □ Wavelength Fykobiliproteiny ■ intenzivně fluoreskující proteiny z fotosyntetického aparátu eukaryot, modrozelených a červených sinic, řas a cyanobakterií ■ nativní nefluoreskují, ale excitační energii předávají na chlorofyly ■ purifikované fluoreskují s výtěžky kolem 100% - obsahují několik bilinových chromoforů (např. B-fykoerithrin 34) - to v souhrnu poskytuje vysoké extinkční koeficienty pro celou molekulu - fluorescenční výtěžky se blíží 30 fluoresceinům nebo 100 rhodaminům - fluorescence není externě zhášená - dostupnost mnoha konjugačních míst - v prodeji jako konjugáty se streptavidinem nebo biotinem Název Zdroj Složení Mr Počet E (106 M1 (kDa) bilinů (nm) cm-1) B-fykoerythrin Porphyridium cruentum (ap)6v 240 34 546 / 575 2,4 R-fykoerythrin Gastroclonium coulteri (ap)6v 240 34 566 / 574 2,0 C-fykocyanin Anabaeba variabilis (Op)2 72 4 614 / 643 0,58 allofykocyanin Anabaeba variabilis (Op)3 110 6 650 / 660 0,70 CryptoFluor Crimson cryptomonad algae 40,2 585 / 658 CryptoFluor Gold cryptomonad algae 30,8 566 / 600 Zelený fluoresceční protein ■ "green fluorescent protein", GFP - z bioluminiscentní medúzky (Aequrea victoria, jellyfish), 26 kDa ■ chromofor - p-hydroxybenzyliden-imidazolidinon, vniká cyklizací a oxidací aa zbytků Ser-Tyr-Gly: ■ mutagenezí získány vylepšené varianty - široké použití pro značení - divoký typ, směs fenolu a fenolátu - fenolátový anion - fenol - fenolátový anion s přidruženým pí-elektronovým systémem - indol (Trp místo Tyr) - imidazol (His místo Tyr) - fenyl (Phe místo Tyr) Použití GFP ■ biologická značka pro sledování a kvantifikaci exprimovaných bílkovin ■ studium protein-protein interakcí ■ interní buněčný "biosensor" pro sledování signálů ■ rekombinantní techniky - spojení GFP se sekvencí jiné bílkoviny - chiméry - sledování lokalizace a pohybu bílkovin v buňkách Fluorescenční polarizace (FP) založena na velikosti rotačního pohybu molekul v protikladu jsou doba života rfl a rychlost pohybu 0rot fluoroforu excitace se provádí polarizovaným světlem, tj. excitují se pouze fluorofory vhodně orientované vůči rovině světla pokud bude životnost exc. stavu mnohem kratší, než rotace, tak si excitované mole T(i«erot Tf,»9rot kuly zachovají orientaci a bude emitováno polarizované zářen pokud bude životnost exc. stavu dlouhá, poruší se orientace molekul a nastane depolarizace \ polarizované depolarizované emitované záření FP a mobilita molekul FP v nepřítomnosti rotační difuse f 1 1 ^ ' 1 1 ^ fl+11 v P 3, _ v P 3 J kT RT ' alternativní vyjádření rotace pomocí viskosity a molekulárního objemu V, lze dále zavést molekulovou hmotnost spec. objem bílkoviny v a hydrataci h (typ. 0.2 g vody na 1 g proteinu) v praxi jsou díky hydrataci a nesférickému tvaru korelační časy d as 2x větší než odvozené pro kouli v suchém stavu (např. HSA, M= 65 kDa, Ai=1,9 vychází d kolem 50 ns) Polarizátor ■ světlo po průchodu polarizátorem osciluje pouze v jedné rovině ■ dichroické systémy - adsorbují jednu z obou rovin polarizace (film z orientovaného PVA dopovaná jódem), málo efektivní v UV oblasti ■ krystaly kalcitu vykazující dvojitou refrakci - rozptylují různě obě roviny polarizace (Nicol a Glan polarizátory, Wollastonův hranol) Měření FP zdroj světla ■ změří se horizontální a vertikální složky emitovaného záření ■ polarizace se vypočte podle vztahu: bývá od -0.25 po 0.5 ■ alternativně se používá anisotropie r: ■ obě veličiny jsou zaměnitelné (vnitřně souvisí): P 2r 2 + r jako tracer fungují konjugáty malých molekul (peptidy, léčiva, pesticidy, ...), které jsou pomocí vhodného můstku (linker) spojeny s fluoroforem (fluorescein, rhodamin) FRET Förster energy resonance transfer ■ přenos energie zářivými nebo nezářivými mechanismy mezi dvěma chromofory - zářivý (triviální) přenos - excitovaná molekula donoru emituje záření, které je absorbováno molekulou akceptoru - nezářivý přenos energie (FRET) - ve směsi molekul dochází k absorpci pouze molekulami donoru, avšak konečným výsledkem je excitovaná molekula akceptoru (chromofor, budící záření sám neabsorbuje) - nedochází k emisi světla donorem Efektivita FRET E l T D dána poměrem vzdálenosti r mezi D a A a Forsterova poloměru r0, nebo alternativně poměry doby t nebo intenzity F fluorescence donoru bez (t, F) a v přítomnosti (t' ,F) akceptoru, závisí dále na: - vzdálenosti mezi donorem a akceptorem - speltrální překryv emisního pásu donoru a absobčního pásu akceptoru - vzájemné relativní orientaci dipólů donoru a akceptoru pravděpodobnost rezonančního přenosu energie určuje kDA - určující složkou je dipól-dipólový přenos energie - Fórsterův vzorec (v případě slabé vazby, kdy vzájemné interakce donoru a akceptoru neovlivní optická spektra) k td - doba dohasínání fluorescence donoru, r0 - vzdálenost, ve které je pravděpodobnost přenosu energie rovna pravděpodobnosti vnitřní deaktivace vzbuzeného stavu molekuly, rDA - vzdálenost mezi donorem a akceptorem l r l FRET uspořádání 1% excitace V _ donor - fluorescenční skupina (fluorofor) akceptor - zhášející skupina (quencher) hydrolysa vhodné skupiny ve spojovacím můstku nezářivý přenos energie na blízkou skupinu akceptoru ŽÁDNÁ FLUORESCENCE "molecular beacon" komplementární DNA (target) oddálení - není přenos energie NÁSTUP FLUORESCENCE FRET - vhodné skupiny FISH fluorescence in situ hybridization mRNA large! ■ dual molecular beacon - vyšší specifita - obě proby musí hybridizovat s cílovými místy, technika "adjacent probes" FRET: in vivo interakce biomolekul FRET: in vivo interakce biomolekul interakce ligand a receptor fúze liposomů FRET imaging v mikroskopii Gene-PIN CCGCT T A A G GACGTAGGCGATCTAAT C A -CTGCATCCGCTAGATTAG r G_ C < 8 B^ B s B i i\ B Existující a budoucí možnosti -Combining other f unci ions to Changed binding activities - Novel binding specificities ~Catalyticatly active Streptavidin -More stable a^idin -Faster bi-otin-bi kinetics -Increased affinity towards ^belted biotin -R oo or o o /—o r PE oh ho oh oo PG o o r pi o r h2n r o Cholesterol ■ může tvořit až 50% (mol.) z přítomných lipidů - je v membráně do značné míry rigidní H H a nemá volnost ohybu HO - jeho vzrůstající podíl snižuje fluiditu membrány liposomů a posouvá fázové přechody k vyšším teplotám ■ N1-cholesteryloxykarbonyl-3,7-diazanonan-1,9-diamin (C-DAN) - polyaminový kladně nabitý derivát ■ dále je možné do liposomů včlenit i sfingolipidy na bázi sfingosinu, běžné v přirozených membránách, prakticky to omezuje vysoká cena těchto složek Náboj liposomů ■ neutrální (PC, PE) - náchylné k agregaci a sedimentaci ■ záporně nabité (PG, k. fosfatidová, PS) - dobře vychytávány buňkami, uvolní obsah při cirkulaci ■ kladně nabité (dimethyldioktadecylamonium bromid, DoDAB, stearylamin, C-DAN) - zejména pro přenos nukleových kyselin (genová terapie) Charakterizace vlastností ■ morfologické (velikost, tvar, stabilita, distribuce velikostí -mono/polydisperzní, náboj ■ strukturní organizace (permeabilita a fluidita) ■ funkcionalizace (zachytávací kapacita, stabilita, reaktivita, schopnost fúzování) ■ techniky - elektronová mikroskopie (SEM, cryo-TEM) - rozptyl světla (statický SLS a dynamický DLS) - separace (SEC, FFF, CZE) - kalorimetrie (DSC) - určení teploty přechodu 7"m Funkcionalizace liposomu (Chemická) modifikace liposomů ■ aktivace liposomů je možná předem - modifikací komponent tvořících membránu - biotinylované liposomy - přímé zakotvení lipofilních antigenů (kardiolipiny, glykosfingolipidy) nebo biomolekul modifikovaných lipidy ■ nebo až u hotového liposomu - oxidace PG nebo PI v diolové části pomocí jodistanu - vznikne aldehydová skupina - volné aminoskupiny u fosfatidylethanolaminu a fosfatidylserinu, nebo přidání stearylaminu - karboxyskupina z PS, lze získat začleněním karboxylových kyselin s dostatečně dlouhým alifatickým řetězcem přímo do membrány - hydroxylové skupiny u fosfatidylglycerolu a fosfatidylinositolu Náplň liposomů ■ při přípravě mohou být dovnitř vpraveny různé látky z okolního vodného prostředí - barviva, fluorofory, enzymy, léčiva, ... ■ liposomy pak fungují jako nosiče velkého množství detekovatelných nebo jinak "užitečných" komponent - mohou být s vysokou citlivostí stanoveny po uvolnění do okolního prostředí rozrušením membrány liposomu detergentem -- zesilovací mechanismus - postupně se uvolňují v cílovém prostředí po specifické vazbě liposomu na vhodné determinanty na povrchu buněk, tzv. cílené směrování - "homing" Homogenní imunostanovení ' použití komplementu (skupina sérových bílkovin, ničících cizí buňky) - cizí buňka (resp. liposom) je opsonizována protilátkami, pak se navážou složky komplementu a zlyzují buňku (resp. liposom - přitom se uvolní značka) - CMLIA (complement mediated liposome IA) lyze pomocí mellitinu (cytolysin, 26 AA) - CyMLIA - konjugát mellitinu s antigenem, v imunokomplexu mellitin blokován Heterogenní stanovení ■ LISA, liposome immunosorbent assays varianta s využitím biotinu/avidinu - univerzáiní použití ■ výhoda: vyšší citlivost oproti klasické ELISA Boronátové komplexy kyseiina boritá je schopna vytvářet kompiexy se sioučeninami obsahujícími dioiové uskupení - sacharidy, giykoproteiny možnost využití pro reversibiiní imobiiizaci biomoiekui pomocí kyseiiny m-aminofenyiborité (APBA): nejznámější je možnost měření hiadiny giykosyiovaného hemogiobinu Boronátové komplexy (Versalinx) ■ velmi silnou komplexaci mezi kyselinou fenylboritou (PBA) a salicylhydroxamovou (SHA) využívá firma Prolinx pro generický způsob imobilizace biomolekul či tvorbu biokonjugátů: ■ SHA je obvykle kovalentně navázána na jednom partneru a PBA (nebo diboritá varianta PDBA) je v preaktivované formě pro modifikaci biomolekul: Imunoreagencie ■ pro značení se využívá specifická interakce mezi vazebným místem protilátky a rozpoznávaným místem (epitopem) antigenu - protein, lipopolysacharid, nízkomolekulární hapteny- peptidy, pesticidy, toxiny, léčiva, ... ■ protilátka - prakticky výhradně imunoglobulin G (IgG) - 160 kDa, 2 vazebná místa pro antigen, tvar Y, 1 Fc a 2 Fab fragmenty - polyklonální (pAb), monoklonální (mAb), rekombinantní (rAb) ■ primární protilátky - rozpoznávají cílové místo, ale obvykle nejsou nijak dále označeny - jsou dostupné tisíce prim. Ab a nebylo by ekonomické od každé připravovat různě značené konjugáty - je to ale samozřejmě možné, má význam při dlouhodobém častém používání - zjednoduší se pracovní proces ■ sekundární protilátky - obvykle značené (konjugát s enzymem nebo fluoroforem) - skupinová specifita - rozpoznávají všechny protilátky pocházející z určitého organismu, např. kozí anti myší protilátka rozpozná všechny IgG připravené imunizací myší (nebo vytvořené pomocí DNA pocházející z myši) Sekundární protilátky ■ rozpoznávající (anti) protilátky původem: - myší, králičí, kozí, krysí, ovčí, koňské, lidské ■ specifita vůči: - celý IgG, IgM, Fc, Fab, IgG1 2 , ■ konjugované s: - peroxidasa, alkalická fosfatasa - fluorescein, rhodamin, Texas red, fykoerithrin - biotin, streptavidin Proteiny A, G, L ■ některé kmeny Staphylococcus aureus produkují protein A - skupinový ligand, velmi pevně a specificky váže molekuly imunoglobulinů v oblasti Fc fragmentu (až 4 vazná místa) - 42 kDa, stabilní při pH 1 až 12, snadno renaturuje - KA až 108 l/mol, neváže ale všechny podtřídy IgG ■ skupiny C a G streptokoků - podobný protein G - 23 kDa, nižší afinita k IgG, ale váže širší skupinu IgG - má vazebné místo pro albumin (odstraněno v rekombinantní formě) - produkují i podobné protein H (IgG Fc), protein B (IgA), Arp (IgG a IgA) ■ Peptostreptococcus magnus - protein L - 35.8 kDa, 4 vazná místa - váže některé k (ne však A) řetězce L protilátek, i Fab a scFv fragmenty rekombinantní hybridní varianty (L/G, L/A, ...) Použití proteinů A G L ■ orientovaná imobilizace protilátek - na povrchu sensorů nebo afinitních nosičů - vzniklý komplex lze zpevnit prokřížením pomocí dimethylpimelimidátu ■ purifikace protilátek - po imobilizaci na vhodnou (agarosovou) matrici - Protein A Sepharose ■ obecně použitelné jako detekční činidlo pro imunokomplexy - Protein A značený peroxidasou nebo vhodným fluoroforem - zviditelnění přítomnosti protilátek Porovnání specifity Antibody Protein A Protein G Protein L (*) Bovine ++ ++++ - Cat + - ? Chicken - +/- - Dog +++ + ? Goat - +++ - Guinea pig ++++ ++ ? Horse ++ ++++ ? Human IgG1: IgG2, IgG4 ++++ ++++ ++++ Human IgG3 - ++++ ++++ Human IgM, IgA, IgE - ++++ Human IgD - - ++++ Mouse IgG1 + ++++ ++++ Mouse (others) ++ ++ ++++ Pig +++ +++ ++++ Rabbit ++++ +++ ++ Rat +/- ++ ++++ Sheep +/- ++ - * pouze pokud má kapa řetězec Lektiny ■ buněčné proteoglykany, glykoproteiny a glykolipidy mohou obsahovat širokou škálu oligosacharidových zbytků - vyskytují se obvykle na povrchu buněk jako složky zakotvené do buněčné membrány - pro různé buňky mohou být specifické různé sacharidové sekvence - např. nádorové buňky mohou změnit své povrchové oligosacharidy ■ lektiny - proteiny schopné rozpoznávat a vázat specifické konfigurace sacharidových molekul - aglutinace buněk (aglutininy) - precipitace komplexních oligosacharidů ■ fluorescenčně značené lektiny se uplatňují při: - detekce povrchových buněčných struktur a intracelulárních glykoproteinů v mikroskopii - detekční postupy v histochemii a cytometrii - lokalizace glykoproteinů na gelech a v blotech - precipitace glykoproteinů - aglutinace specifických buněk Concanavalin A ■ z bobu Canavalia ensiformis (Fabaceae, "jack bean", "pig bean") ■ první známý lektin, 237 aa, Mr 26,5 kDa, dvě místa pro ionty kovu (Ca2+, Mn2+) ■ vytváří dimery a z nich pak tetramer - 4 dostatečně vzdálená vazebná místa - výhodné pro tvorbu agregátů, (např. z erythrocytů) ■ má afinitu ke glukose a k manose - nejlépe váže methyl-3,6-di-O-(-D-manopyranosyl)-a-D-manopyranosid ■ podjednotka Con A Lektiny Izolován z Vlastnosti Vazebná specifita Con A brazilské boby, CanavaIia ensiformis 4-mer, 104 kDa ionty Ca2* a Mn2* a-Glc, a-Man WGA obilní klíčky, Triticum vulgaris dimer, 36 kDa (GlcNAc)2, NeuNAc GS- .. IA4, IA3B, IA2B2, IAB3, IB4 africké boby, Griffonia simplifolia isolektiny, 4-mery, 114 kDa A: term. a-GalNAc, B: term. a-Gal GS-II -" - 4-mer 113 kDa term. nereduk. GlcNAc PHA-L fazol, PhaseoIus vuIgaris 4-mer, 126 kDa GlcNAc(1-2)Man PNA arašídy Arachis hypoglea 4-mer, 110 kDa term. ß-Gal HPA hlemýždi, HeIix pomatia 6-mer, 70 kDa, váže A-eryhtrocyt GalNAc SBA soja, GIycine max 4-mer, 120 kDa, isolektiny term. GalNAc a Gal ABA žampion, Agaricus bisporus Monomer, 59 kDa ß-Gal(1-3)GalNAc PSA hrách, Pisum sativum 49 kDa, 4-mer a-Man RCA Castorbean, Ricinus comunis 120 kDa, 4-mer ß-Gal B-podjednotka z choleratoxinu Vibrio choIerae Gal, gangliosid G pomoci JaJíijjjů apoptické lidské keratinocyty značené ConA-fluoresceinem (okraje membránových puchýřků) '. a propidium jodidem fixované a permeabilizované osteosarkomové buňky - ConA-AlexaFluor-488 - žlutozeleně, glukopyranosyl - WGA-AlexaFluor-594 - oranžově, GIcNac - Hoechst 33342 - modře, nukleové kyseliny kapilární endothely a mikroglie z kryořezu mozku - GS-IB4-AlexaFluor 488 (žlutozeleně) - neurony - NeuroTrace 530/615 (červeně) - jádra - DAPI (modře) to V* His-tag ■ purifikace geneticky modifikovaných rekombinantních proteinů exprimovaných v E. coli nebo jiných mikroorganismech ■ jinak "polyhistidine-tag" nebo "hexahistidine-tag" je úsek histidinových zbytků na N- nebo C-konci - volí se ten méně důležitý nebo dostupnější ■ slouží k rychlé izolaci pomocí metaloafinitní chromatografie s Ni2+ nebo Co2+ ionty - eluce snížením pH (protonace His) nebo komplexotvorným činidlem (imidazol, EDTA) - další formáty - magn. nosiče, jednoúčelové kolony, ... ■ po purifikaci se tento koncový úsek odstraní - pomocí exopeptidasy z N-konce - na základě další krátké cílové sekvence endoproteinasy ■ vhodné i pro denaturované proteiny (důležitá je sekvence) ■ vadí peptidylprolylisomerasa (25 kDa, SlyD) - lépe použít SlyD-deficientní E. coli ■ vynalezeno u Roche (licence, akademická zdarma), vhodné vektory distribuje Qiagen Vnesení His-tagu vnesení DNA úseku kodujícího cílový protein do vektoru, kde je His-tag sekvence přítomna na C-konci použití primeru s His-tag sekvencí ke spojen s cílovou DNA v průběhu PCR primery s repetitivními His sekvencemi (CAC nebo CAT) Protein specific Protein specific sequence sequence 5' ATGcat Galeae cat caccacNNN NNNMN.- 3* 5' „N NNN NNN catcatcaccatcaccacTAG 3' Ť HE-TAG HIS-TAG START STOP codon codon Metaloafinitní interakce ■ komplexotvorná reakce nitrilotrioctové kyseliny (NTA) s vhodným iotem kovu (Ni2+, Cu2+) a imidazolovým kruhem histidinových GST-tag ■ glutathion-S-transferasa (26 kDa) - má silnou afinitu k nosičům s imobilizovaným glutathionem ■ GST reprezentuje skupinu multifunkčních cytosolických proteinů u eukaryot ■ nevyskytují se u prokaryot - není tedy žádná kompetice s glutathionovou matricí ■ připraví se fúzí konjugát cílového proteinů s GST - exprese se provede v bakteriích - GST část může zlepšit rozpustnost eukaryotických bílkovin v prokarytickém prostředí - purifikace na glutathionové matrici - odstranění GST části štěpením proteasou glutathion, y-Glu-Cys-GLy Další "tágy" ■ tyto cizorodé sekvence se vkládají pomocí rekombinantních technik do cílových genů ■ kódují krátké peptidy, které vytváří antigenní determinanty (epitopy), které rozpoznávají specifické protilátky ■ výsledkem je "označení" exprimovaného proteinu daným úsekem ("tagged protein") ■ běžně komerčně dostupné protilátky proti tag sekvencím zjednodušují identifikaci, imunoprecipitaci nebo imunoafinitní purifikaci označených bílkovin ■ tyto fúzní proteiny se vzhledem ke krátké značce neliší od nativních bílkovin co se týká bioaktivity nebo biodistribuce ■ příklady "tagů": - HIS HHHHHH - c-MYC EQKLISEEDL - HA YPYDVPDYA - VSVG YTDIEMNRLGK - HSV QPELAPEDPED V5 GKPIPNPLLGLDST - FLAG DYKDDDDK Značení glykoproteinů mapování glykomu - metabolické značení pomocí acetylovaných derivátů: - N-azidoacetylgalaktosamin (GalNAz) - N-azidoacetylglukosamin (GlcNAz) - N-azidoacetylmanosamim (ManNAz) v metabolismu buňky se vestaví do glykoproteinů chemicky se označí Staudingerovou ligací pomocí FLAG-fosfinového derivátu vhodné pro proteomickou analýzu postranslačních modifikací FLAG se „zviditelní" pomocí značené anti FLAG protilátky Metabolic labeling glycoprotein Nanočástice ■ techniky značení biomolekul pomocí různých částic se používají již několik desetiletí, „immunogold" - částice zlata potažené protilátkou se zmiňují už kolem roku 1970 - rutinně se používají např. v elektronové mikroskopii ■ značná popularita se zvedla v posledních letech se všeobecným trendem nanotechnologií, kam řada tradičních značek „rozměrově" samozřejmě zapadá Koloidní zlato ■ stabilní suspenze dispergovaných částic kovu vel. 5 až asi 150 nm - v roztoku se jeví jako intenzívně zbarvené (červeně, dle velikosti částic -při koagulaci - zvětšování velikosti - se barva posouvá do modra) - Casiův purpur - již od středověku k barvení skla či hedvábí ■ příprava konjugátů s proteiny - řada způsobů podle toho - který typ interakce bude zodpovědný za vazbu proteinu na povrch částice; ta nese obvykle záporný náboj - mohou se uplatnit i hydrofobní vazby - velmi často se používá pevné adsorbce thiosloučenin na zlato (SAM, „self assembled monolayers") - v roztoku se záporně nabité částice odpuzují, ale existují mezi nimi a jinými molekulami i přitažlivé síly, v závislosti na iontové síle prostředí ■ adsorbované bílkoviny stabilizují sol zlata a brání koagulaci, kterou lze jinak vyvolat např. přídavkem NaCl - vazba bílkovin by měla probíhat v blízkosti jejich izoelektrického bodu, ale proces samozřejmě ovlivní i další faktory - sledovat se adsorbce dá při 580 nm. Příprava ■ prakticky je výhodné používat monodisperzní částice ■ redukce kyseliny chlorozlatité HAuCl4 pomocí různých činidel ■ obecně větší „redukční síla" poskytuje menší částice - redukce citrátem sodným poskytuje částice 15 až 150 nm velké dle použitých koncentračních poměrů - střední částice 6 až 15 nm se získají nejlépe pomocí askorbátu sodného - nejmenší lze připravit redukcí bílým fosforem (pod 5 nm) - nebo pomocí borohydridu sodného (2 nm) ■ struktura koloidní částice - Au obalené záporně nabitými [AuCl2]-- neshlukují se, přitahují kationty Adsorbce bílkovin ■ inkubace s proteinem, zcentrifugování částic, rozsuspendují ■ částice s proteinem A (G, L) - univerzální zviditelnění imunokomplexů - adsorbce při pH 6,9 v přítomnosti polyethylenglykolu (PEG 20 kDa, 0,025%) jako stabilizačního činidla - produkt se uchovává v 10 mM fosfátovém pufru pH 7,4 s 1% PEG ■ adsorbce protilátek - pH 8 až 9, PEG lze nahradit albuminem (0,25%) ■ další často používané kombinace - lektiny - detekce sacharidových struktur na povrchu buněk - avidin / streptavidin - široké univerzální použit. ■ rychlé vizuálně vyhodnocované imunotesty - červená barva snadno a citlivě detekovatelná - výhodou je stabilita nanočástic - nepodléhají degradaci na rozdíl od biomolekul - nulová toxicita Depozice stříbra ■ zlepšení citlivosti detekce - zvětšením velikosti nanočástic vprůběhu stanovení - specificky zachycené částice fungují jako nukleační místa pro růst krystalů vpřítomnosti Ag+ solí nebo HAuCl4 Nanočástice zlata • nanokiastry ziata jsou viastně koordinační kompiexem • centráiní atomy Au jsou v dané konfiguraci, na povrchu jsou koordinačně vázány s vhodným iigandem, takže ziato je vaienčně saturováno a tím stabiiizováno - Undecagoid a Nanogoid - tris (aryi) fosfin - haiidové anionty • menší kiastry Hexagoid (6 Au) a Octagoid (8 Au) mohou nést náboj Au nanočástice v mikroskopii svazek mikrotubuiů - anti-tubuiinová Ab, kozí Ab anti myší IgG značená koioidním ziatem (vievo) nebo nanočásticemi NANOGOLD (vpravo) - zvětšení 1300x adenokarcinomy prostaty - Ab anti cytokeratin antibody, konjugát Aiexa Fiuor488 FiuoroNanogoid s Fab' fragmentem kozí Ab anti myší IgG - vievo, fiuorescence - vpravo, iokaiizace Au po zesíiení Ag+ Magnetické pole permanentní magnet má dva póly, které vytváří magnetický dipól (často reprezentován šipkou, směr od S do N), mezi póly se šíří magnetické pole magn. dipól m v magn. poli o hustotě toku B je natáčen torzní silou do směru rovnoběžného se siločarami pole: r - mBsin.(0) magnetické materiály mají volný magnetický moment, vykazují magnetizaci M, která závisí na: - hustotě magn. dipólů na jednotkový objem materiálu - velikosti a vzájemné orientaci dipólů - je důsledkem nespárovaných spinů elektronů, v malé míře i pohybem elektronu v rámci orbitalu magn. pole může vyvolat i elektromagnet - elektrický proud procházející vodivou smyčkou (solenoid) vytváříuvnitř homogenní pole hustota toku B je dána intenzitou H a permea-bilitou vakua u0: B = //„( H + M) Magnetizace magnetizace M se mění v závislosti na intenzitě pole H - konstantou úměrnosti je magnetická susceptibilita x - velikost změny závisí na typu materiálu, teplotě a někdy i na historii předcházejícího magn. pole (hystereze) zahřívání zmagnetizovaného materiálu snižuje jeho magnetizaci, při zahřátí nad 7c (Curieova teplota) pak M zcela vymizí M H < T4Compound ii + AH0 Compound ii + A.h2->HHP +AH 2ah-»Oxidised product ■ peroxidasa ze sojových bobů (40 kDa) je termostabilní (do 90 °C) a aktivní v širokém rozsahu pH 2 až 10 Konjugace peroxidasy ■ při tvorbě konjugátů se peroxidasa může jednoduše sledovat a stanovovat na základě absorbance při 403 nm (typické pro hemoproteiny) ■ poměr absorbancí při 403 a 275 nm charakterizuje čistotu enzymu - toto jednoduché stanovení komplikuje existence několika isoenzymů - velmi kvalitní preparáty mají tuto hodnotu (R.Z., reinheitzahl) mezi 3 až 3.4, nemá to ale vazbu na aktivitu ■ reakce mohou využít e-aminoskupiny zbytků lyzinu - ty jsou ale pouze 2, což je velmi málo ■ využívají se sacharidové postranní řetězce - snadno se aktivují pomocí oxidace jodistanem a tak se získají aldehydové skupiny Chromogenní substráty HRP ■ DH2 + H2O2 D + 2 H2O bezbarvý barevný ... obecná reakce ■ ABTS, 2,2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazolin-6-sulfonová kyselina) TMB 3,3',5,5'-tetramethylbenzidin CH, CH, CH HgN CH «3, ,CI CH, X„,-295nm 1-- CH, CH. CHj, .1/2 CH, ^ťCHä HíN"0~WNHi CH> ^CH, ^^3>=\ /K>r/CHj HN-(3=ŕ^)=NH CH5W WCH3 *-<.. "370,652 nm CH3 HN ■0-0- CH, CH Xin«'450 nm NH +- 2h + měří se při 620 až 650 nm v průběhu reakce, nebo po zastavení kyselinou sírovou při 450 nm) + H1 Luminogenní substráty HRP ' pro citlivou detekci HRP se používá luminol - 5-amino-2,3-dihydroftalazin-1,4-dion ' v nadbytku H2O2je intensita světla (425 nm) úměrná množství HRP NH +I~b02 +OH NH HRP N~2 O COO N2 COO NH2 -N2 hv + 3-aminoftalát nh2 zlepšení luminiscence (vyšší výtěžek) - přítomnost "enhancers" sloučenin - p-jodofenol, p-fenylfenol - nejde již o záblesk, ale o stabilnější světelný tok - výsledek silně závisí na podmínkách reakce - raději použít komerčně namíchané směsi vyšší výtěžek dává 7-dimethylaminonaftalen-1,2-dikarboxyhydrazid nh nh o Akridanové luminogeny ■ alternativní substráty pro HRP ■ emise při 435 nm Alkalická fosfatasa j katalyzuje štěpení ortho-esterů kyseliny fosforečné v zásadité oblasti pH (AP, EC 3.1.3.1) j řada isoenzymů, používá se enzym izolovaný z mukosy telecích střev - CIAP, 140 kDa dimer, 2 Zn2+ na podjednotku, vysoké číslo přeměny 3500 s-1 při reakci kolem pH 9,8 (pH optimum je 8 až 10) - aktivována aminoalkoholy (diethanolamin, Tris) uchovává se lyofilizovaná nebo v 3 M NaCl - nesnáší kyselé prostředí - poškozuje ji opakované zmrazování / rozmrazování relativně dobře snáší vyšší teploty - např. v průběhu hybridizace - značka při detekci nukleových kyselin Konjugace ALP 1 příprava konjugátů není snadná a často dochází ke ztrátám aktivity pomocí glutaraldehydu nebo lépe ' heterobifunkčními činidly SMCC a SPDP - je dobré provádět konjugaci ve fosfátovém pufru, který chrání aktivní místo jako reverzibilní inhibitor 1 komerčně dostupná je ALP s maleimidem (EZ-link od Pierce): ■ protilátky se redukují merkaptoethanolem a po dialyse lze provést konjugaci ■ pro zavedení -SH slouží SATA Měření aktivity ■ p-nitrofenylfosfát: (PNPP, 405 nm), hydrolýzou vzniká nitrofenol - intenzivně žlutý v alkalickém prostředí od fluoresceinu - fluoresceindifosfát 1 4-MUP (methylumbelliferylfosfát) luminogenní substrát - Lumigen PPD - chloro-4-methoxy-4-(3-fosfátophenyl)spiro[1,2-dioxetan-3,2'-adamantan]) - patří do skupiny dioxetanových luminogenů - substibuce halegenem v adamantanovém skeletu zlepšuje citlivost detekce (už 600 molekul ALP, zeptomoly) - 477 až (dle enhanceru) 620 nm OH OH O=p—Ov.,.;;: í;;..^^-P=O Oh OH O ' O O—O O-CH, + H2O OH O—P=O OH O OK .O—CH Cl + P, + hv OH 5-bromo-4-chloro-indolylfosfát (BCIP) ■ hydrolytickou reakcí vzniká indoxyl, který po oxidaci (např. tetrazolium) přechází na modré nerozpustné indigo Galaktosidasa ■ p-galaktosidasa (PGal, EC 3.2.1.23) je velký enzym (540 kDa, 4 podjednotky po 135 kDa) a je tedy snadno inaktivován ■ katalyzuje hydrolýzu galaktosidů, pI 4,6, pH optimum má 7 až 7,5 (enzym z Escherichia coli) ■ má dostatek sulfhydrylových skupin pro konjugační reakce, takže lze jednoduše spojit s protilátkami aktivovanými předem SMCC Gal jako reporter genové exprese ■ enzym může být rozdělen na dva peptidy LacZa a LacZQ - samy o sobě nemají aktivitu - ale spontánně se spojí do funkčního enzymu ■ využívá se v mnoha klonovacích vektorech pro dosažení a-komplementace u speciálních lab. kmenů E. coli - malý LacZa peptid je kodován v plasmidu - velký LacZQ je kodován bakteriálním chromosomem - když se DNA fragment vpraví do vektoru a produkce LacZa se přeruší, ztratí se p-galaktosidasová aktivita - základem pro modro/bílý screening rekombinantních klonů Glukosa oxidasa ■ (ß-D-glukosa:O2-1-oxidoreduktasa, EC 1.1.3.4, GOD) ■ dostupná z plísní Aspergillus niger nebo Penicillinum notatum ■ 160 kDa, dimer se dvěma FAD kovalentně vázanými na podjednotky ■ obsahuje asi 16% glykosylových zbytků ■ specifická aktivita preparátů přesahuje 200 lU/mg ■ velmi stabilní ■ v imunostanoveních často "spolupracuje" s HRP, pro kterou generuje peroxid vodíku oxidací glukosy - tunelovací stanovení, imunosensory Ureasa ■ substrátem je močovina - změna pH vyvolaná hydrolysou, měříse - pomocí indikátoru bromkresolová modř při 588 nm - potenciometricky (light addressable potenciometric sensor, na bázi pH ISFETu) - pro imunosensory Lakasa ■ z choroše Coriolus hirsutus, Cu-dependentní 1,4-benzendiol oxidasa (EC 1.10.3.2) ■ oxiduje fenolické substráty pomocí kyslíku - alternativa k peroxidase - menší problémy s dlouhodobou stabilitou substrátové směsi Acetylcholinesterasa ■ vysoké číslo přeměny (105s-1) ■ z elektrického úhoře ■ vysoká citlivost stanovení ■ substrát acetylthiocholin a DTNB - dithiobis(nitrobenzoová kyselina), Ellmanovo činidlo - poskytuje žluté zbarvení Luciferasy ■ patří mezi oxygenasy, štěpí substrát luciferin za účasti ATP - meziproduktem je luciferyladenylát, ten je poté oxidován - luciferin-4-monooxygenasa, 61 kDa, 550 aa - dochází k emisi světla při 560 nm (žlutozelené světlo), výtěžek asi 0.88 ! ■ zdrojem světluška (firefly, Photinus pyralis), (EC 1.13.12.7) Reakce luciferasy kroky I a II jsou enzymové (ligace a oxygenace) (D-luciferin) (Luciferyl-adenylate) (II) -oXX^J -°J (Luciferyl-adenylate) (Peroxy-luciferin) (I") -O-^Ag^gj (Peroxy-luciferin) (oxyluciferin) (IV) [-o-OÍ^-í ] — (oxyluciferin) (oxyluciferin) Luciferasa z Renilla ■ mořská sasanka ("sea pansy", Renilla reniformis) svítí při dráždění ■ emituje modré světlo 480 nm, přenosem na GFP vzniká zelené záření ■ 36 kDa monomer ■ luciferinem je coelenterazin Luciferasa z brouků > zdrojem je "click-beetle", Pyrophorus plagiophthalamus 1 různé enzymy emitující od 544 do 593 nm (zeleně až oranžově) - byly geneticky upraveny pro emisi při 611 nm a 544 nm - lucRD červená emise ("Chroma-Glo""), lucGR zelená emise (nebo CBRluc, CBGluc) Luciferasa z bakterií ■ mořské bakterie - luciferasa (EC 1.14.14.3) oxiduje aldehydy (>C8, dekanal, tetradekanal) - Vibrio fischeri, Vibrio harveyi, Photobacterium phosphoreum ■ nemají význam pro použití v eukaryotických buňkách, pouze u prokaryot NAD(P)H + FMN + H+ - NA DH ox idoreduktasa - NAD(P)+ + FMNH2 Luciferasa FMNH2 + R-CHO + O2 -> FMN + R-COOH + H2O + hv Geneticky upravené luciferasy ■ světlušky: - luc nativní varianta, luc+ "enhanced", zvýšená luminiscence (vyšší svítivost) - vyžadují zlyzování buněk před přidáním substrátů - hluc+ optimalizované kodony pro expresi v savčích buňkách, svítí déle, poločas přes 5 hod, "Steady-Glo", hlucP+ zkrácená stabilita uvnitř buňky, poločas 30 min, "Bright-Glo", hlucCP+ velmi krátká živostnost - svítí přímo v buněčné kultuře, vhodné pro mikrodestičkový formát - nahrazení C-terminální sekvence Ser-Lys-Leu cílové pro peroxisomy za Ile-Ala-Val ■ u Renilla obdobné: Rluc, hRluc, hRlucP, hRlucCP, nemá C-term. cílovou sekvenci ■ "Dual-Luciferase" - použijí se oba typy luciferas, lyze buněk, dva substráty, postupné měření emise - "Dual-Glo" - stejné, ale přímo v buněčné kultuře ■ optimalizace kodonů pro dobrou expresi v savčích buňkách ■ odstranění skrytých ("cryptic") regulačních a potenciálních sestřihových sekvencí ■ www.promega.com Reportery genové exprese molekul luciferasy je pro zobrazení potřeba mnohem méně než např. GFP (musí mít silnější promotor, je velmi stabilní) - rychlejší metabolismus (začlenění sekvence pro degradaci - PEST, Pro-Glu-Ser-Thr) - lepší pro zobrazení dynamiky exprese - efektorová specifita, uniformní a optimální exprese v hostitelských buňkách zobrazení žádané buněčné linie po úspěšné transfekc - hledání a studium účinku nových léčiv - efekty cizorodých látek na buněčné procesy identifikace interagujících proteinů - společně spustí přepis reporterového genu interakce a vzdálenosti biomolekul - BRET - fúze studovaného proteinu s luciferasou (Rluc) a druhého partnera s vhodným fluoroforem (GFP) Luciferasový reportérovy vektor pGL4 ■ pro přenos reporterového genu do hostitelských buněk, obsahuje: - promotorové sekvence (HSV-TK, SV-40, CMV) - savčí selekční sekvence (Hygr - resistence k hygromycinu) - poly(A) úseky Firefly (tuc2) ■ Rapid Response™ (-R -CP) Renilla {hRluc) • Rapid Response™ (-R -CP) Přehled dostupných vektorů Vector Reporter Gene Multiple Cloning Region Protein Degradation Sequence Gene Promoter Mammalian Selectable Marker pGL4.10 Yes No No No pGL4.ll lu&P Ven hPEST No No pGL4.12 luclCP Ves CLl-hPEST No No pGL4.13 htd No No SV40 No pGL4.L4 luc2 Yes No No Hyg' pGL4.15 \uc2P Yes hPEST No Hygi pGL4.16 luclCP Yes CĽl-hFE5T No Hyg. pGL4.70 ::R!-i:c Yes No No No pGL4.71 klMucP Yes hPEST No No pGL4.72 hRlucCP Yes CLl-hPEST No No pGL4.73 hRluí No No 5V40 No pGL4.74 JiRIi.c No No HSV-TK No pGL4.75 liRluc No No CMV No pGL4.76 ::RiiíC Yes No No Hvgi pGL4.77 hRlucP Yes hPEST No Hygi pGL4.78 hRlvcCP Yes No No Hvg' BRET ■ bioluminiscence resonance energy transfer - neradiační přenos energie z luminiscentního donoru na fluorescentní akceptor - vyskytuje se také in vivo (rod Renilla obsahuje luciferasu emitující modré světlo, BRET přenosem na GFP se ale mění na zelené - účinnost BRET se stanovuje jako poměr intenzit emise akceptoru a emise donoru - eliminují se tak vlivy techniky měření, počtu buněk, prostředí ■ aplikace in vivo - studium interagujících biomolekul - jeden z partnerů se na úrovni DNA sfúzuje s genem luciferasy (rluc), druhý partner pak s genem GFP ■ výhody - není problém s fotorozkladem - lze studovat buňky citlivé na světlo, případně buňky s vysokou přirozenou autofluorescencí ■ při sterických problémech lze použít velmi malou luciferasu z rodu Gaussia (20 kDa) Bioluminiscence vs. fluorescence ■ F - vysoký jas, excitované stavy mohou vznikat rychle díky masívnímu excitačnímu záření (napumpování energie) - ale zvyšuje se i signál pozadí, rozhoduje poměr signál/šum - detektory nerozliší excitační a emitované fotony (geometrická diskriminace ani filtry nejsou 100% účinné) - emitují i nežádoucí fluorofory přítomné v komplexním biomateriálu - uplatní se při zobrazování detailů - rozhraní, kdy S/N nemá takový vliv - mikroskopie, cytometrie, kdy stejně optická konstrukce limituje citlivost detektoru ■ BL - nižší intenzita světla, ale současně prakticky nulové pozadí - uplatní se při "větších" vzorcích, kdy je pouze jednoduchá optika (žádné filtry) a detekce fotonů je tedy efektivnější (detektor blíže vzorku) - stanovení ve zkumavkách, v mikrodestičkách, detaily u větších organismů (myši, .) - široká lineární oblast (6 až 8 koncentračních řádů) - při bioanalytických stanoveních dosahuje 10 až 1000x vyšší citlivosti a limity detekce (10-20 mol, cca 104 molekul/vzorek, několik molekul v buňce) - luminofor je chráněn při emisi uvnitř bílkovinného obalu Acetátkinasa jako značka pro vysoce citlivá imunostanovení - generuje ATP z acetylfosfátu a ADP - vzniklé ATP se pak použije pro vyvolání bioluminiscence luciferinu s luciferasou - citlivost až 10-22 mol Imobilizace biomolekul v afinitní chromatografii ■ separační postupy využívající vysokou specifitu bioafinitních interakcí - afinitní chromatografie ■ možnost opakovaného použití biomolekul - snížení pracovních nákladů - imobilizované enzymové reaktory Afinitní chromatografie separace biomolekul na základě reversibilní interakce s ligandem imobilizovaným na vhodném nosiči ekvilibrace matrice ve vazebném pufru nanesení vzorku za podmínek, které jsou vhodné pro vznik afinitního komplexu, vymytí nenavázaných složek vzorku ■ uvolnění biomolekuly změnou podmínek - přidání volného kompetujícího ligandu - změna pH, iontové síly, polarity, . - biomolekula se získá v čisté podobě a v zakoncentrovaném stavu ■ reekvilibrace nosiče s vazebným pufrem Průběh afinitní separace Nosiče (bio)ligandů ■ ve vodě nerozpustné materiály obvykle sférického tvaru - kuličky "beads" - gelové materiály - membránové separační techniky - monolitické materiály - magnetické nosiče ■ v zásadě lze připravit vlastní materiály, je vhodnější používat komerčně dostupné matrice - výrobci poskytují materiály dostatečně reprodukovatelné - charakterizující informace, bohatá firemní literatura - doporučené postupy imobilizace ■ povrchové reaktivní nebo derivatizovatelné skupiny - obvykle nejčastěji hydroxyly - dobře se aktivují, vykazují nízkou nespecifickou adsorbci - aminy, karboxyskupiny - snadná vazba biomolekul, ale vyšší podíl nespecifických interakcí (mohou nést náboj) Mechanické parametry nosičů ■ mechanická a chemická stabilita nosiče může být aktivačními reakcemi negativně ovlivněna ■ mechanické parametry - ovlivňují možnost použití vysokých tlaků a rychlých průtoků - rigidní nosiče na bázi skla a silikátůči zesíťovaných polymerů - měkké gelovité nosiče jsou málo odolné a nemusí snášet ani míchání při derivatizaci ■ chemická odolnost - vhodná pro použití různých typů solventů - možnost pracovat v širším rozsahu pH mezi 3 až 11 ■ odolnost vůči mikroorganismům - uchovávání v chladu, přidání konzervační bakteriocidních činidel (azid) Průtočné vlastnosti ■ dobrý průtok přes daný nosič závisí na průměru použitých částic - pro běžné účely v laboratoři vyhovuje asi 100 |jm - přesná definice průměru není pro afinitní techniky až tak kritická jako pro jiné druhy chromatografických separací - typický rozsah pro Sepharosu CL-6B je 45 až 160 - pohyb kapaliny přes sloupec mohou komplikovat jemné fragmenty vznikající mechanickým poškozením částic např. při intenzívním míchání ■ velikost částic společně s porozitou samozřejmě ovlivňují kapacitu připraveného sloupce - vzrůstá pro menší částice Vazebná kapacita nosiče ■ udává množství cílové molekuly navázané na jednotku nosiče ■ teoretická vs. praktická - vhodnější je vztahovat tento údaj na nosič při reálném použití, tedy ne v suchém, ale v nabobtnalém stavu - často se může výsledná kapacita např. pro protein výrazně odlišovat od udávaného množství reaktivních skupin pro imobilizaci ligandu (výrobci počítají s malou molekulou ...) - dostupnost molekul ligandu na povrchu a uvnitř v pórech matrice - roli hraje také vzdálenost mezi povrchem matrice a ligandem - spojovací můstková část ("spacer" nebo "linker"), jeho délka může výrazně ovlivnit probíhající afinitní interakci Nespecifické interakce ■ nespecifická vazba balastních molekul v separovaném roztoku probíhají na bázi iontových nebo hydrofobních vazeb ■ proces lze ovlivnit - složením pracovních pufrů - promývacími kroky - také volbou teploty ■ obvykle nelze zcela vyloučit oba typy rušivých vazeb ■ různé typy matric vždy vykazují zbytkové interakce Volba nosiče ■ kombinace výše zmíněných parametrů ■ cena a dostupnost daného materiálu ■ předchozí zkušenosti Postup modifikace ■ nosič ■ nosič s aktivními skupinami ■ imobilizace bioligandu ■ blokování zbylých aktivních míst - glycin, ethanolamin, glycerol - hydrolysa při zvýšeném pH ■ volba pracovního uspořádání - naplnění do kolony, ... Způsob vazby ligandu ■ vliv vzdálenosti ligandu od povrchu nosiče - ovlivní se délkou spojovacího můstku - "linker", "spacer arm" - je potřebný pro ligandy menší než asi 1 kDa - příliš krátký - biomolekula ligand neváže efektivně, sterické zábrany vzniku pevného biokomplexu - příliš dlouhý - balastní biomolekuly s ním mohou reagovat nespecificky 0 5 10 15 20 25 0 5 10 15 20 Silikagel ■ "silica", SiO2 x H2O, voda chemicky vázaná v nestechiometrickém poměru, obsahuje vazby - siloxanové (Si-O-Si) - silanolové (Si-OH) ■ amorfní struktura, výborná mechanická stabilita - vysoké tlaky ■ omezená pH stabilita (mezi 2 a 8) ■ náchylný na nespecifické interakce ■ povrchové silanolové skupiny (Si-OH) se musí aktivovat, např. silanizací Poresní sklo ■ CPG, "controlled pore glass" stejně jako obdobné anorganické silikáty, alumina a zeolity vynikají především výbornými mechanickými vlastnostmi - pro techniky pracující s vysokými tlaky - poměrně křehké, při aktivacích raději jemně třepat a nemíchat - při výměně roztoků je dobré používat vakuum, aby se odstranily bublinky zachycené v pórech ■ příprava - borosilikátové sklo se zahřeje - dojde k separaci borátové a silikátové fáze, boráty se odstraní vylouhováním, vzniknou uniformní póry ■ chemická stabilita - toleruje dobře kyselé pH - v alkalické oblasti nad pH 8 se rychle degraduje ■ pro modifikace se využívá silanizace ■ komerčně dostupné jsou aminované CPG i jiné deriváty ■ nízká nespecifická adsorpce biomolekul CPG Silanizace ■ aktivace inertních povrchů pokrytých vrstvou oxidu (sklo, silikáty, slída, oxidy kovů) - v hydratovaném stavu obsahuje hydroxylové skupiny, např. Si-OH, silanolový zbytek ■ reakcí se silany vzniká spontánně uspořádaná vrstva - obvykle několik vrstev, ne monovrstva - nepoužívají se organické halogenované silany (jsou příliš reaktivní a žádná další skupina už by nezbyla), ale méně reaktivní alkoxyderiváty ■ silanizací se na povrch modifikovaného nosiče zavedou vhodné reaktivní skupiny X OR 1 O RO—Si—X |-OH OR | — O—Si—X -v | O |-OH \ |—o—Si—X i ROH O aminosilany - APTES (CH3CH2O)3Si-(CH2)3-NH2 Silanizační činidla (3-aminopropyl)-triethoxysilan APDEMS (3-aminopropyl)-diethoxy-methylsilan APMES (3-aminopropyl)-dimethyl-ethoxysilan, monofunkční - vede ke vzniku monovrstvy OCH2CH3 H3C— Si — (C H2)3-N H2 OCH2CH3 H (CH3O)3Si—C-C H glycidoxysilany - GOPS glycidoxypropyl-trimethoxysilan - GPMES (3-glycidoxypropyl)-dimethyl-ethoxysilan merkaptosilany - MPTS \/ O CH CH3CH2O—Si—(CH2)3-NH2 CH3 (CH3O)3Si-(CH2)3-SH CH3 I H CH3CH2O—Si-C-C 3 2 Ľ. H - CH3 \/ O CH2 (3-merkaptopropyl)-trimethoxysilan MPDMS (3-merkaptopropyl)-methyl-dimethoxysilan OCH2CH3 H3C—Si — (CH2)3-SH OCH2CH3 další činidla - MPS (3-trimethoxysilylpropyl)methakrylát O (CH3CH2O)3Si-(CH2)3-O— :CH. CH3 Silanizační reakce ■ lze provádět z organické fáze - 10% roztok silanu v toluenu, v něm se daný povrch refluxuje 12 až 24 hod, po promytí toluenem či acetonem a vysušení se dále zahřívá 2 až 4 hod při 110 oC ■ z vodné fáze se dosáhne menší vazebná kapacita, ale vrstva je stabilnější při použití ve vodném prostředí - povrch se hydratuje 30 min povařením ve vodě - zahřívá 3 až 4 hod při 75 oC v 10% vodném roztoku silanu, pH 4 - po usušení se zahřívá přes noc při 110 oC ■ odpařovací nanesení je nejjednodušší - povrch se inkubuje 1 hod v 1% roztoku silanu v acetonu - po opláchnutí acetonem a vysušení se zahřívá 1 hod při 110 oC ■ nanášení silanu z vodné fáze nebo z polárních rozpouštědel vede ke tvorbě složitějších struktur (4 až 5 vrstev silanu) OH OO OH OH Agarosa (Sepharosa) polysacharid tvořen z D-galaktosy 3-anhydrogalaktosy poly-{P-1,3-D-galaktosa-a-1,4-(3,6-anhydro)--L-galaktosa} sekundární a primární struktura je komplexní, vláknitá s přítomnými póry přirozená je mechanicky labilní (zahřátím nad 40 °C se rozpouští) - modifikuje se zesíťováním pomoci epichlorhydrinu nebo divinylsulfonu - ztratí se tím část využitelných hydroxylových skupin - zesítěná je relativně stabilní (rozpouštědla mísitelná s vodou, pH 3 až 14), - neměla by se nechat vyschnout Sepharosa ■ nejběžnější je Sepharosa CL-6B - zavedená firmou Pharmacia (Amersham Biosciences, dnes GE Healthcare) - CL = „crosslinked", 6B = 6% „beaded" agarose - póry dostatečné pro biomolekuly do 1 MDa, varianty 2B a 4B do 10 MDa - nosič dodávají i firmy BioRad jako Bio-Gel A a IBF jako Ultrogel ■ pro aktivaci vhodné metody zaměřené na hydroxylové skupiny Sepharose Forma (částice vesměs 90 |jm) High Performance 6% highly cross-linked agarose (34 |m) 6 Fast Flow 6% highly cross-linked agarose 4 Fast Flow 4% highly cross-linked agarose CL-6B 6% cross-linked agarose CL-4B 4% cross-linked agarose 6B 6% agarose 4B 4% agarose Preaktivované Sepharosy NHS-activated Sepharose High Performance 12-atom. hydrofil. můstek, přes -NH2 NHS-activated Sepharose 4 Fast Flow viz výše CNBr-activated Sepharose 4 Fast Flow vazba primárních -NH2 skupin EAH Sepharose 4B 10-atom. můstek, přes -NH2 ECH Sepharose 4B 9-atom. můstek, přes -COOH Epoxy-activated Sepharose 6B 12-atom. hydrofil. můstek, přes -OH, -NH2 nebo -SH skupiny Activated Thiol Sepharose 4B 10-atom. můstek pro reversibilní vazbu přes volné thioskupiny Thiopropyl Sepharose 6B 4-atom. hydrofilní pro reversibilní vazbu proteinů a thiolovaných ligandů. Reaguje i s těžkými kovy, alkyl- a arylhalogenidy a dává adiční reakce s C=O, C=C a N=N vazbami Preaktivované Sepharosy Chemical group Length of Structure cf spacer arm Product on ligand spacer arm Proteins, peptides, amino acids amino 10-atom HiTrap NHS-activated HP NHS-activated Sepharose 4 Fast Flow None CNBr-activated Sepharose 4B CNBr-activated Sepharose 4 Fast Flow 10-atom OH ECH Sepharose 4E carboxyl 11-atom OH OH EAH Sepharose 4B thiol 4-atom O^OH Thiopropy Sepharose 6B 10-atom Activated Thiol Sepharose 4B 12-atom 01 Epoxy-activated Sepharose 6B Aktivace -OH v sacharidových matricích ■ epoxyskupiny (bisoxiran, epichlorhydrin) ■ bromkyanová metoda ■ divinylsulfon sulfonylchloridy - tosylchlorid = p-toluensulfonylchlorid - tresylchlorid = 2,2,2-trifluorethansulfonylchlorid Ci-so^—^ ň—ch3 tosylchlorid ci-so2-ch2cf3 tresylchlorid r-nh2 ho-so2-ch2cf3 I-OH I-0-S02-ch2cf3 I-nh-r Srovnání reakčních parametrů Aktivní skupina Reagující skupiny Ugandu Reakční podmínky epoxy - NH2 -OH -SH -COOH pH 5-12 doba 4 - 72 hod teplota 4 - 60° C bromkyan - NH2 pH 7-10, doba 1 -12 hod, teplota 4 - 25° C divinylsulfon - NH2 -OH -SH pH 6-11, doba 2 - 24 hod teplota 4 - 25° C tresyl -NH2 pH 7-9, doba 2-16 hod, teplota 4 - 25° C Množství navazovaného ligandu -kolik ho použít? ■ když ho máme dostatek - 10 až 100x molární přebytek vůči přítomným reaktivním skupinám ■ malé biomolekuly - 1 až 20 umol na 1 ml media (2 umol typicky) ■ proteinové ligandy - 5 až 10 mg na 1 ml media ■ protilátky - 5 mg proteinu na 1 ml media ■ velmi slabě interagující systemy - co nejvyšší koncentrace ligandu - vyšší koncentrace vede k vyšší vazbě Dextranové nosiče materiály Sephadex, Superdex 1 glukosové jednotky spojené 1,6 vazbou, větvení i přes 1,2 / 1,3 a 1,4 spoje mechanicky málo stabilní náchylné na bakteriální degradaci glykosidické vazby nestabilní při nízkém pH Celulosa j použití není tak běžné, spíše v průmyslové oblasti j velmi často se objevuje ve formě membrán 1 lineární polymer z 1,4-p-D-glukosových jednotek ■ nativní polymer je ve formě vláken bez poresní struktury, reinformovaná celulosa je ve formě kuliček j snáší pH 3 až 10, stabilnější je při kyselé oblasti pH, při pH 7 může být autoklávována vláknitá celulosa se dodává jako suchý prášek - Whatman, BioRad, Schleicher & Schuell - v roztoku je náchylná na mechanické poškození (NE magn. míchání) • aktivace - karbonyldiimidazol a divinylsulfon chloroformiát -OH -OH Cl-CO-O-CH2CH3 ■ HCl, CH3CH2OH R-NH2 —O—^ O OH N—R H ■ celulosové částice, průměr kolem 450 um O Polyakrylamidové nosiče ■ v biochemické oblasti velmi oblíbené ■ připravují se kopolymerací akrylamidu a N,N'-methylen-bis(akrylamidu), probíhá radikálovým mechanismem v přítomnosti tetramethylendiaminu (TEMED) a peroxodvojsíranu amonného jako iniciátoru ■ Bio-Gel P dodává materiál firma BioRad - póry poskytují vylučovací limity od 2 do 400 kDa - nízké nespecifické vazby - dobrá pH stabilita (2 - 10) ■ nevýhodou je malá mechanická stabilita - variabilita matrice při změně složení pufrů - nízké průtočné rychlosti ■ aktivace se nejsnáz provádí částečnou hydrazinolýzou při 50 °C - dostupné jsou i preaktivované materiály (Enzacryl) ■ glutaraldehydem - uplatní se adice amidové skupiny na dvojné vazby přítomné v polymerní formě glutaraldehydu. Trisacryl kopolymerace dodáváIBF N-akryloyl-2 amino-2 hydroxymethyl-1,3 propandiol h2^=^—co—n—c(ch2oh)3 h h hh h2c—c—n—co-c—c-co—n—c—ch2 h h oh oh h h N,N'-diallyltartradiamid nh-c(ch2oh)3 nh-c(ch2oh)3 Co Co -ch -ch-ch -ch-ch -ch- 2 2 T 2 nh trisacryl co Ch-oh Ch-oh Co nh-c(ch2oh)3 nh co -ch2-ch-ch2-ch- ■ tris(hydroxymethylové) uskupení poskytuje materiálu výborné hydrofilní vlastnosti ■ zesíťovaný charakter přináší zlepšení mechanických vlastností oproti polyakrylamidu ■ tolerance pH je od 1 do 11 ■ snáší zmražení, teploty do 120 °C a organická rozpouštědla ■ aktivace je možná pomocí - karbonyldiimidazolu - bromkyanu - divinylsulfonu + Sephacryl ■ na bázi dextranového gelu s vnesenými allylovými postranními skupinami zesíťovanými pomocí N,N'-methylen-bis(akrylamidu) ■ obsahuje tedy lineární glukosové řetězce spojené přes molekuly bis(akrylamidu) a také lineární části polymerního bis(akrylamidu) ■ vyrábí Pharmacia ■ Sephacryl S-300 a S-400 - vylučovací limity 1,5 a 8 MDa ■ gely HR řady - vylepšené průtočné vlastnosti ■ materiál je dostatečně chemicky i mechanicky odolný ■ aktivace - přes sekundární hydroxylové skupiny Methakrylátové matrice o ch,oh o 1 2 m h2c=c—c—0-ch2-c-ch2-0—u_c=ch2 ch3 ch2oh ch3 | + h—mo—c—c-\— oh h h 2 2 ii + o o h2c=c—c—c—c—ch2 ch3 2 III ■ TSK-Gel Toyopearl (vyr. Tosoh, distribuce Merck jako Fractogel TSK) - kopolymerace glycidylmethakrylátu, pentaerythritol dimethakrylátu a polyethylenglykolu - velký počet hydroxylů a etherových vazeb ■ částečně hydrofilní, výborné mech. vlastnosti, tolerancí pH 2 až 12 ■ velikosti S („superfine", 20 až 40 um), F („fine", 30 až 60 um) a C („coarse", 50 až 100 um) ■ střední typ rozsah 50 kDa až 5 MDa - nejvhodnější pro afin. separace ch3 o oh o—c—c—c—F—o—c—c—-I—o h h h u u ch2 Ch2 o hc—oh h2 TSK hh I pentaerythritol dimethakrylát II polyethylenglykol III glycidylmethakrylátu h3c o o h2c=c—c—o-ch2-ch2-oh Ch3 Ch2o o Ch2 HEMA h3c -o—c—c—o- ch3 o o h2c=c—c—o-ch2-ch2-o—c—c=ch o ch2 ho-ch2-ch2-o ch3 ch ch3 ch2 Ho-ch2-ch2-oh ch2 -o—cc—o- ch3 ch20 o poprvé připraven v Československu - distribuován pod názvy Separon a Spheron - vzniká kopolymerací 2-hydroxyethylmethakrylátu se síťujícím ethylendimethakrylátem - zesíťovaná struktura vytváří makro i mikropóry, které poskytují vysokou odolnost vůči tlaku chemická odolnost je pro pH 2 až 12 - krátké promytí je možné i 2 M NaOH či 2 M HCl tepelná odolnost až do 170 °C dodávané velikosti částic jsou 5, 10 a 60 um - v tuzemsku nyní vyrábí firma Tessek - k dispozici i předaktivované matrice s různými reaktivními skupinami hh 2 2 + o h3c h3c o o -C—C—NH-CK-NH-C—C—CH2 CH, CH3 o /\ H2C—c—C Eupergit o =C~C- Ch3 h nh2 o—c—ch h2 h2 i 2 2 Ch2o h,c—c—c-n—c-3 ' h h o 2 h2n—c—c—ch, hc—c—nh2 o CH =c-c- H H2 /\ o—c—C—CH2 H H 2 2 CH2 HC C i h CH2 o /\ - kopolymerací methakrylamidu, N,N'-methylen-bis(methakrylamidu) a složky s oxiranovou skupinou, glycidylmethakrylátu nebo allylglycidyletheru (na obr. dole) - Rohm Pharma, v USA jako Spectra/Cryl porézní částice 30, 150 a 250 um, neporézní 1 um - mechanická stabilita výborná imobilizace probíhá adicí na oxiranové uskupení - reagovat mohou primární aminy, sulfhydrylové skupiny či hydroxyly - doporučována přítomnost fosfátového pufru, urychlí se tím reakce a může probíhat blízko neutrálního pH H2C + H2C C o + H2C Polyamidové nosiče ■ polykondenzační reakce - Nylon 66 z 1,6-diaminohexanu a hexan-1,6-dikarboxylové kyseliny - tuzemský Silon vzniká kondenzací c-kaprolaktamu - ve formě membrán, sítěk, kuliček a trubiček pro imobilizaci enzymů ■ přirozený materiál má pro imobilizaci málo volných konc. skupin - je nutné jeho strukturu částečně narušit opatrnou hydrolýzou - asi 3 M HCl, doba působení závisí na formě materiálu, 10 sec až 1 hod ■ aktivační postupy, které amidovou vazbu nepřerušují - O-alkylace peptidové vazby oxoniovou solí (triethyloxonium tetrafluoroboritan) - dimethylsulfátem - vzniklý imidoester reaguje v slabě alkalickém prostředí s aminoskupinou (lyzin, 1,6-diaminohexan) za vzniku amidinu - kladný náboj zvyšuje polaritu polymeru - získá se větší povrchová hustota využitelných karboxy nebo aminoskupin - na trhu dostupná řada aktivovaných membrán /C_NH_ (CH3)2S04_C=NH_ R-NH2 _C=NH~ 0 r och3 - ch,oh NH_R Aktivace polyamidu dimethylsulfátem Skupinově specifické ligandy ■ interaguje s třídou podobných biomolekul - skupinová separace NAD+, NADP+, Blue B dehydrogenasy 5'-AMP, Blue F3G-A NAD+-dependentní enzymy 2',5'-ADP, Red HE-3B NADP+-dependentní enzymy kalmodulin, Blue B kinasy glutathion glutathion-S-transferasa (fúzní proteiny) chitin chitin vážící protein (fúzní proteiny) amylosa maltosu vážící protein (fúzní proteiny) Green A CoA proteiny, HSA benzamidin serinové proteinasy heparin lipoproteiny, hormony, DNA, RNA polymyxin endotoxiny konkanavalin A gluko- a manopyranosylové zbytky poly U, oligo-dT poly(A)+mRNA Cibacron blue F3G-A O NH Y SO3H SO3H příklad racionálního návrhu skupinově specifického ligandu původně textilní barvivo váže se pevně do aktiv. místa dehydrogenas namísto přirozeného substrátu NAD+ - antrachinonová část - odpovídá adeninové kapse - diaminobenzensulfonát - interaguje s guanidinovou skupinou Arg zbytku - triazinový cyklus - atom chloru se váže v pyrofosfátovém místě substituenty X a Y pak jemně dolaďují afinitu ligandu - nejvyšší afinitu má derivát s -COOH v meta poloze (Y) - vliv na velikost disociační konstanty a tím pevnost vazby na afinitní nosič další aplikace - odstranění albuminu vazba na nosič - substituce v místě chloru triazinového cyklu, např. Blue Sepharose ■ polycyklické barvivo vykazující jistou strukturní podobnost k NADP+ ■ dále interagují albumin, lipoproteiny, interferon, koagulační faktory - méně specifické - elektrostatické a hydrofobní interakce Polystyren ■ zejména požíván jako materiál pro mikrodestičky ■ nejjednodušší imobilizace - adsorpce proteinů na povrch na základě hydrofobních interakcí ("coating" protilátek) - třeba vysytit zbývající vazená místa vhodnou inertní bílkovinou (albumin, kasein, želatina, sušené mléko bez tuku, ...) ■ imobilizace malých molekul - třeba kovalentní vazby ■ modifikace PS - nitrace a redukce poskytnou povrchové aminoskupiny ■ komerčně dostupné (Nunc) i modifikované mikrodestičky - "vážící aminosloučeniny" - se streptavidinem Monolitické kolony > poresní chromatografické sorbenty ve formě vyplňující celý separační prostor - Hjerten 1989 - PAG - "continuous bed" - Švec a Frechet 1992 - "monolith" na bázi makroporesního org. polymeru > polymerace uvnitř kolony (i kapilární) - polyakrylamid a methylenbis(akrylamid) nebo piperazindiakrylamid - styren a jeho deriváty, síťovadlo divynylbenzen - deriváty methakrylát - butylmetakrylát, methakrylová kyselina, glycidylmethakrylát, zesíťujíse ethylendimethakrylátem (Bioseparations) modifikované silikagely, spečené chemicky modifikované silikagelové částice (Chromolith, Merck) kombinace malých ("mesopores", vhodné pro imobilizace ligandů, nm rozměry, difuse) a velkých ("through pores", zajišťují tok kapaliny, um rozměry, konvekce) É é ^ Monolitické materiály ■ porogenní rozpouštědla: A MeOH, B 75% EtOH, C 75% PrOH, D 75% dodekanol CIMs j "convective interaction media" - separační monolitický materiál ve formě disků - výborné průtočné vlastnosti díky převažující konvekci - celý tok media jde přes separační oblast, u časticových nosičů dochází k neefektivnímu obtékání částic - průtočné rychlosti až o řád vyšší bez vlivu na separační vlastnosti a vazebnou kapacitu materiálu - kombinovatelnost různých materiálů v jednom "sloupci" - seriové spojení různých disků Kombinace AC / IEC Selektivní frakcionace quantification of impurities in IgGs Transferrin and albumin are often present in IgG concentrates and are considered impurities. It is important to determine their concentration in order to obtain a well-characterized biological product. Two CIM® Protein G disks and one CIM® quaternary amine (OA) monolithic disk were placed consecutively into one housing forming a CLC monolithic column allowing a complete separation of all three proteins in less than 5 minutes. Underthe applied binding conditions, the IgGs were captured on the Protein G disks while transferrin and albumin were bound to the OA disk. Subsequently, transferrin and albumin were eluted separately by a stepwise gradient using sodium chloride, whereas the IgGs were released from the Protein G ligands by applying a low pH. This validated method permits the quantification of albumin and transferrin in IgG concentrates. From:Brsnovi(etsl. jOctapharms), J. Immunol. Meth, 2002, 271, 47-53 Peak 1: Jmslemn Peak 2: Albumin Peak 3: /fffii Tim. (mln) -Hiisimu* —Oaic UaCi -PH 0.25 ml (amount of IgG sample was Bmg) 20mMTris-HCI(pH7.0) 20mM Tris-HCI + 1 M NaCI |pH 7.0) 0.1 M Glycire-HCI (pH2.6) Row rata -nil/min column 2 CIM* Protein G disks +1 CIM* OA disk Imobilizace enzymů ■ enzymy - průmyslové použití - biokatalytické konverse - bioanalytické aplikace, enzymové sensory ■ ekonomický aspekt - snížení výrobních nákladů enzymových procesů díky opakovanému použití ■ dlouhodobá stabilizace enzymové aktivity ■ snadná separace výsledného produktu - dvoufázový systém, enzym zachycen na heterogenní fázi - substrát, produkt volně v roztoku - realizace kontinuálně pracujících procesů (enzymové reaktory) ■ nevhodné, pokud je i enzymový substrát nerozpustný Ideální nosič enzymu ■ levný, inertní, mechanicky pevný, chemicky stabilní ■ zachovává nebo zvyšuje specifitu enzymu (dána poměrem /fcat/Km) ■ snižuje inhibici enzymu produktem ■ posunuje pH optimum enzymu žádaným směrem ■ zabraňuje mikrobiální kontaminaci ■ omezuje nespecifickou adsorpci Způsoby imobilizace ■ a adsorbce ■ b kovalentní vazba ■ c zachycení v polymeru, "entrapment" ■ d zachycení v membránovém váčku, "cofinement" Volba nosiče ■ nízká cena (po zničení enzymové aktivity se vyhodí) ■ drahé nosiče - při malém rozsahu procesu, případně pokud je lze použít opakovaně (opakovaná imobilizace enzymu) ■ uplatní se forma, tvar, mech. stabilita, hustota, porosita, distribuce velikosti pórů, povrchový náboj (posun pH optima reakce), hustota reaktivních skupin (vazebná kapacita) ■ speciální vlastnosti - magnetismus - rozklad nežádoucích produktů (MnO2 a peroxid vodíku) - povrch s redukčními vlastnostmi (TiO2) Geometrické uspořádání ■ částice („beads") - definovaná velikost a porosita ■ filmové povlaky - tenké vrstvy na vhodném neutrálním nosném materiálu ■ membrány - současně je možné realizovat biokatalytickou reakci a separaci na základě rozdílné velikosti substrátu a produktu ■ vláknité materiály - vysoký podíl povrchu - velká objemová aktivita ■ pěny - zachycení uvnitř (polyurethany) Struktura - mikroporesní 0.1 až 10 nm - mesoporesní 3 až 10 nm - srovnatelné s velikostí enzymů - makroporesní 8 až 1000 nm, povrch 25 až 100 m2/g - neporesní - výborná průtočnost, ale malá kapacita a malý povrch - gelovitá - nemá stálé póry, ty vznikají až při nabobtnání; obdoba neporesního uspořádání Adsorpce enzymů na nosič ■ jednoduchý, široce použitelný postup - velmi mírné podmínky, zachování aktivity - není kovalentní vazba, není narušení konformace ■ reversibilita - jak enzymu (purifikace), tak vlastní matrice - obojí lze regenerovat a použít znovu ■ možnost vysokých obsahů (až 1 g enzymu na 1 g nosiče) ■ ale slabá interakce - enzymy se mohou postupně spontánně uvolňovat z matrice ■ zúčastněné interakce - nespecifické (van der Waalsovy síly, vodíkové můstky, hydrofilní interakce): CPG, silikagely - biospecifické - přes ligand interagující s enzymem (mimo aktivní místo) - interakce s imobilizovanými barvivy nebo ionty kovů - iontové interakce (ionexy) - hydrofobní interakce: PET, HDPE, polyethylentereftalát, latex (polystyren), poly(ST-DVB), amberlit XAD, silikáty, zeolity, talek ■ částečná desolvatace v průběhu vazby na nosič, může docházet ke změnám konformace - stabilizace, změny aktivity a specifity katalyzované reakce Iontové interakce ■ syntetické pryskyřice (SP) - kopolymery akrylamidu a kys. maleinové nebo itakonové, fenolformaldehydové kondenzáty ■ SP s povrchovými skupinami - Dowex, Amberlit, Duolit ■ polysacharidové deriváty - DEAE-celulosa, DEAE-dextran, DEAE-Sephadex, CM-celulosa, CH-Sepharosa, AH-Sepharosa, Q-Sepharosa, S-Sepharosa - DEAE ... diethylaminoethyl, CM ...-O-CH2-COOH, CH ... -NH(CH2)COOH, AH ... NH-(CH2)6-NH2, Q ...-CH2-N+(CH3)3, S ...-CH2-SO3H - všeobecně velmi hydrofilní materiály, náboj závisí na pH okolního roztoku ■ důležitou roli hrají podmínky, zejména pH, při adsorpci Invertasa Typ nosiče % vazby DEAE-Sephadex (anex) CM-Sephadex (katex) pH 2.5 0 100 pH 4.7 100 75 pH 7.0 100 34 Kovalentní imobilizace enzymů ■ poresní / neporesní nosiče, vzájemná velikost pórů a molekul enzymu ■ povrchová hustota navázaných molekul ■ reaktivní skupiny vhodné pro kovalentní imobilizace ■ a anhydrid, b karbonát, c aldehyd, d epoxid, e azid, f isothiokyanát, g nitrofenylester karboxylové kyseliny, h azlakton ■ typické množství 0.02 g enzymu na 1 g nosiče Relativní užitečnost aa pro imobilizaci AA zbytek Obsah Dostupnost Reaktivita Stabilita spojení Použití Asp + ++ + + + Arg + ++ - ± - Cys - ± - - cystin + - ± ± - Glu + ++ + + + His ± ++ + + + Lys ++ Met - - ± - - Ser ++ + ± + ± Thr ++ ± ± + ± Trp - - - ± - Tyr + - + + + C konec - ++ + + + N konec - ++ + sacharid. zbytek — ++ ++ + + ± Orientace enzymu nesmí dojít (a) ke změně konformace vazebného místa, aby docházelo k optimální vazbě substrátu (b) nevhodné je nepřístupné aktivní místo (c) v důsledku sterické zábrany méně efektivní až nefunkční může být vazebné místo deformované v důsledku distorse (d) oj L I^aTt* cb)_ > -T-*" / // \\ / \ - v* f' 1 <■ i i i í ' Bu" r í Ik pH ? í i 1 0 11 Difúzní vlivy substrát se musí dostat z okolního prostředí do aktivního místa překonává se nemíchaná vrstva na povrchu nosiče - externí difúze poté se pohybuje uvnitř pórů nosiče - interní difúze koncentrační gradienty substrátu a produktu v případě poresního nosiče a pouze reakce a interní difúze b navíc partitice S a P v mikro prostředí nosiče c jako a, navíc externí difúze d kombinace difúzních a parti-tičních efektů partitiční vrstva je cca 1000x tenčí než difúzní vrstva ■ HP] f[s] 1-J f[P] Difúzní kontrola enzymové konverze ■ při imobilizování velkého množství enzymu se jeho aktivita jakoby zdánlivě ztrácí ■ efektivní aktivita enzymu na nosiči je mnohem menší než teoreticky navázaná - důsledek difúzních problémů - omezený pohyb substrátu ■ pozitivní projev - zdánlivá stabilizace imobilizovaného enzymu nalezená aktivita vnesená aktivita čas Enzymové biosensory ■ imobilizace enzymu na povrch fyzikálně-chemického převodníku ■ využívají se postupy imobilizace zmíněné dříve i další speciální metodiky ■ nejčastější jsou enzymové elektrody - kombinace enzymu a elektrochemického převodníku ■ enzymové optody (optrody) - analogie, nosičem je ale obvykle světlovod (optické vlákno) Membrány a biosensory ■ membrány v biosensorech plní několik funkcí: ■ imobilizace enzymových molekul - nosná funkce ■ řízení transportu látek buď prostřednictvím difúzní kontroly nebo ovlivněním selektivity (antiinterferenční) ■ zlepšení mechanické stability ■ biokompatibilita Rozdělení membrán ■ membrána = porézní prostředí, rozdělení: ■ hrubě porézní - póry nad 5 nm (skelná frita), permeabilitu ovlivňuje rozdíl hydrostatického tlaku na obou stranách, osmotický tlak se neuplatňuje (pokud polymer membrány neinteraguje s rozpouštědlem); permselektivita je velmi špatná až žádná (prochází všechny látky) ■ jemně porézní - póry 1 až 5 nm (např. acetylcelulosa), rozpouštědlo prochází konvekcí a difúzí, permeabilita je dána velikostí rozpuštěných látek ■ neporézní (husté) - nevykazují porézní strukturu, rozpouštědlo prochází pouze difúzí Příprava membrán ■ je potřeba pečlivě kontrolovat podmínky (vlhkost, teplota), které silně ovlivňují vlastnosti vznikajících membrán ■ fázová konverze - roztok polymeru ve vhodném rozpouštědle se nalije na pevný povrch a vyčká se odpaření rozpouštědla - polyvinyl chlorid (tetrahydrofuran - THF), acetylcelulosa (aceton), polyethersulonát (dimethylsulfoxid) nebo polyurethan (THF, aceton) - vyšší vlkost a nižší teplota okolí - vznikají větší póry - nalití roztoku polymeru v org. rozpouštědle nemísitelném s vodou na vodní hladinu, zde se na rozhraní utvoří asymetrická membrána ■ polymerace z mono či oligomerů přímo na místě použití (tvorba „in situ") - vhodná k přípravě fragilních gelovitých membrán (polyvinylalkohol, polyakrylamid), které obsahují velký podíl vody ■ dodatečná tvorba pórů - tzv. nukleární membrány (Nucleopore) - vrstva polymeru se „prostřílí" urychlenými nukleony, lokálně narušená struktura polymeru se naleptá a vzniknou póry - velmi dobrá reprodukovatelnost a homogenita pórů o poměrně přesně definovaném průměru - lokální změny lze vyvolat mechanickým natahováním (polyenové membrány, obsahující krystalické a amorfní oblasti, v amorfních pak následně vzniknou póry) Úpravy membrán Nucleopore membrána ■ velikost pórů membrány lze dodatečně změnit: ■ zvětšení průchodnosti se dosáhne naleptáním polymeru membrány, které vede ke zvětšení průměru pórů - alkalická hydrolýza acetylcelulosy nebo polykarbonátů ■ zmenšení průchodnosti a zlepšení permselektivity se dosáhne depozicí vhodných látek uvnitř pórů - např. organosilanů nebo lipidických látek ■ symetrické membrány - obě strany jsou rovnocenné, průchodnost oběma směry je stejná ■ asymetrické membrány - připravují se na rozhraní dvou fází Biokompatibilita ■ při použití biosensorů v živém organismu (in vivo) nebo v klinické praxi při kontaktu zejména s krví (in vitro) ■ při kontaktu povrchu membrán s prostředím dochází k adsorpci proteinů - zejména albuminu a fibrinogenu na povrch ■ pak se vytváří další vrstva krevních destiček (koagulační trombóza) ■ při dlouhodobé implantaci dochází k zarůstání biosensoru tkání ■ postupné snižování citlivosti důsledkem snížené prostupnosti ■ biosensor může vyvolávat rušivé reakce u živého organismu - srážení krve, zánětlivé procesy ■ je potřeba povrch biosensoru povléknout vhodnými polymery - silikon, polytetrafluorethylen a zejména polyurethany ■ modifikovat povrchní obal - hydrofilizace, konverze aminoskupin na hydroxyskupiny ■ do vnější vrstvy vpravit látky omezující rušivé reakce - fosforylcholin, fosfolipidy, heparin Mechanické zachycení enzymu převodník Oo-kroužek 1 1 1 1 dialyzační membrána nejjednodušší - kápne se roztok biokomponenty na povrch převodníku a překryje se dialyzační membránou alternativní metodou je zachycení biomolekul uvnitř vhodného polymeru (inkluze), polymerní vrstva se vytvoří na povrchu podpůrné dialyzační membrány Zachycení v gelu ■ želatina je často používána pro enzymové membrány; 5% roztok se rozpustí při zvýšené teplotě (až 50 oC) a přidá se enzym, promíchá se a naleje na podložku (např. dialyzační membrána) ■ Nafion je polymer rozpuštěný ve směsi alkoholů s vodou - používá se pro tvorbu permselektivních membrán - jako iontoměnič - může zachycovat biomolekuly —[(CF2_CF2)m- — "CF2Jn— O Nafion r CF2 CF3- CF -O-CF2- -CF2—SO3H J p Zachycení v PVA polyvinylalkohol (PVA) je hydrofilní, neutrální a biokompatibilní polymer, ve vodě silně bobtná; dostupný ve formě oligomerů (90 kDa), které po zesíťování vytvoří konečný polymer radiační polymerace využívá ozáření směsi oligomerů a enzymu y-zářením (generuje 60Co) - vzniklé radikály vyvolají další polymeraci a zesíťování - výsledná membrána neobsahuje žádné nežádoucí produkty a současně je sterilizována chemické síťování - triisokyanáty (TIC), spojí postranní hydroxyly UV polymerace - PVA obsahující styrylbipyridiniové skupiny (PVA-SbQ, 1.3%) - vůbec nejšetrnější postup imobilizace pomocí PVA Multifunkční polymery kombinují imobilizaci enzymu s polymerní strukturou nesoucí skupiny mediátorů přenášející elektrony, tzv. redox relays poly-4-vinylpyridin (oligomer kolem 50 kDa) se částečně využije pro tvorbu komplexu s osmiem (mediátor), a částečně se do něj kvarternizací zavedou aminoskupiny směs modifikovaného oligomeru, enzymu a bifunkčního činidla PEGDE (polyethylenglykoldiglycidylether) se nanese na elektrodu -4-CH2-Cr-H— L I J n pare. komplexace (1/6) + Os(bpy)2Cl2 kvarternizaee + 2-bromoethylamin Os(bpy)2Cl N Ch^CH2_NH2 PEGDE H2v> í NH, Dynamické povrchy - světlocitlivé deriváty azobenzenu: cis-trans isomerizace, po osvětlení - UV (366nm) - cis isomer - modré (436nm) - trans isomer změna konfigurace vede ke změně polarity pohyb kapky po povrchu poháněný světlem Dynamické povrchy - redoxní aktivace ■ elektrochemická oxidace na chinon vede k aktivaci povrchu - kondenzace s derivátem stimulujícím adhezi buněk Dynamické povrchy - změny polarity ■ v závislosti na aplikovaném potenciálu elektrody vykazuje její povrch hydrofilní nebo hydrofobní charakter Precursor MHA Hydrophobic ^-Alkyl Chain H yd rol y si © ' © Hydrophobic Monolayer Hydrophilic Carbůxylate © ©~~~-Suľlur •Gold Electrode Dynamické povrchy - biosensing SAM oligonukleotidové proby specificky rozpozná virální NA polymerasa dosyntetizuje druhé vlákno, přitom ho označí redoxní molekulou ferrocenu tím je umožně přenos elektronů z donorového enzymu GOD (I. Willner) (D v ha] nucleic aciri Au electrode Polymerase dCTP.dATP.dGTP +F«Tocene-dUTP (1) «S-HS- (CHaVCCCCCACCTTGTAAAAroACGGCCAGT.S' í 9 Fe = ho-^-o-^- CH=CH-CH2-NI H -fi- Dynamické povrchy - nanowiring • komunikace enzymů s elektrodou prostřednictvím chemického „nanodrátku" - „wired enzymes", rychlost přenosu elektronůřádově vyšší než reakce s kyslíkem *n 0 ^-----XGluconŕc acid 3—ona—cKa—e" *\7* Dynamické povrchy - nanowiring ' komunikace enzymů s elektrodou prostřednictvím uhlíkové „nanotrubky" 1 SWCNT, single-wall carbon nanotube 1 komunikační kanál mezi elektrodou a enzymem 1 kalibrace pro glukosu při různé délce nanotrubičky a 25, b 50, c 100, d 150 nm Cílená lokální imobilizace primitivní postupy - „pin printing" - hrot se namočí v roztoku činidla a mikrokapka se přenese do žádané pozice na čipu velikost spotů je 100-300 um, až 10 tisíc prob na čipu horší reprodukovatelnost, pomalost nízká cena, laboratorní příprava Ink-jet printing ^ piezoelektrický element I j skleněná membrána reagent _ _t. rezervoár , ír ., , , ^ ústí mikrokapka (100 pl) mikropumpa (struktura vyleptána vk řemíku) Ink-jet tisková hlava ■ alternativní metoda přípravy DNA čipů - „tisk" reagencií na podklad - obdoba inkoustových tiskáren ■ základem je struktura rezervoáru vytvořená v křemíku (micromachining), překrytá velmi tenkou skleněnou membránou, na kterou přiléhá piezoelektrický element (aktuátor) ■ rezervoár se naplní reagentem, poté nad ústí pumpy posune žádaná pozice čipu, a na piezoelektrický aktuátor se přivede puls napětí ■ piezoelement se mechanicky deformuje, zatlačí na membránu, čímž dojde k vystříknutí mikrokapky reagentu ■ rychlost „tisku" je 1 až 6 kHz Ink-jet printing • rozptýlení kapky na povrchu brání předcházející modifikace čipu • hydrofilní místa pro imobilizaci prób navzájem oddělené hydrofobními úseky (surface tension wells) • nanášené kapky reagentů se nerozpíjí, povrchové napětí je drží uvnitř dané pozice pohyb pole p řes pumpy DiDiOiD ink-jet pumpy C A G T zásobníky aktivovaných bází Syntéza souboru DNA prób • reakční kroky probíhají naráz na všech pozicích čipu ■ promývání a pomocné reakce se provádí pro celý čip společně • pro 100000 pozic trvá prodloužení o jednu bázi asi 5 minut • syntéza souboru o délce 25 bází zabere 2 hodiny. Subtraktivní techniky ■ vytváření struktur či obrazců pomocí odstranění přebytečných částí ■ leptání ■ FIB (focused ion beam) milling ■ laserové opracování - machining, pulzy různého trvání ■ ultrazvukové vrtání - 25 um amplituda při frekvenci 20-100 kHz - bezstresové opracování křehkých materiálů ■ tradiční technologie - NC frézky, vrtačky, ... Strukturace povrchu ■ surface patterning ■ cílem je imobilizovat danou biomolekulu pouze v určitém geometricky definovaném místě povrchu • využití pro konstrukci různých typů souborů (arrays) detekčních elementů nebo multikanálových biosensorů ■ technika tisku - plastové "razítko" se namočí v modifikačním roztoku a motiv se přenese na povrch Strukturace povrchu ■ surface patterning PDMS razítko 5 mM oktadekanethiol „namočené" razítko (SH-(CH2)17-CH3) 1 mM biotinylovaný alkylthiol ch3ch3 ch-jCH, Au film na Si-waferu i otisk ~ 120 s ssssssss ch3ch3 ch3ch3 s s_s s Charakterizace strukturovaného povrchu SNIM, IR spektrum, topografie (AFM) 1711 cm1, absorpce ureidoskupiny x (Mm) x (Mm) ■ SNIM, scanning near field IR microscopy Litografie ■ tenkovrstvá technologie nejen pro výrobu elektronických součástek, ale i mikroanalytických planárních systémů ■ základním materiálem je křemík („silicon wafer") ■ techniky přenosu kopie výchozího motivu („master pattern") na povrch pevného materiálu Fotorezist modifikovaný materiál se pokryje tenkou vrstvou fotocitlivého materiálu - fotorezist (spin-coating) ten se pak osvětlí přes masku nesoucí žádaný motiv fotorezist - pozitivní nebo negativní křemíkový substrát ' termální oxidace (vznik SiO2) ) nanesení fotorezistní vrstvy v osvit přes masku -definování tvaru vyvolání ■ schéma pracovního postupu Litografie nanesení vrstvy )(kov, izolace, biovrstva, membrána, ■■■) odstranění fotorezistu Fotolitografická maska ■ ukázka masky pro celý wafer (vlevo) ■ vpravo pak výsek pro 20x20 elementů DNA biočipy (DNA microarrays) ■ plátek křemíku (wafer, 5x5 inch, tj. 12.5x12.5 cm) • z něho 49 až 400 jednotlivých sensorů (chips, 1.28x1.28 cm) • na každém čipu až 1.4 milionu pozic (features, 11x11 Lim) • v každé pozici několik milionů kopií stejné oligonukleotidové próby s danou známou sekvencí Modifikace povrchu kombinace chemické reakce a UV ozařování fotolitografie, fotosenzitivní imobilizační procedura Light :.Híľi::c:: ::-: ■ Mast I I I I □ OODt I I I I I 00OD0 I I I OHOHOOO I I I I I TTOOD f Q A T C Q ^-inarj Č Á Ť Á Ť A S C T G TT CCG I I I I TTCCCH SWS w sssss GeneChip* II I . I I I I I TT0H0HO-Í TTÖOO Ulli Výroba DNA čipu silanizovaný povrch sensoru, každý atom Si je zárodkem proby navázání spojovací části „linkeru", ten zakončený fotocitlivou blokovací skupinou ^ ozáření přes masku - odstranění blokujících skupin (deprotekce) navázání prvního nukleotidu (A) '■ I ..... I ■ maska č. 4 zabránění dalšího růstu chybné sekvence - ukončovací báze („capping agent") po každém kroku Výroba (3) 4 i t * T t T i ' : i j ■ r ■ M M > i' . m m-m lbVb ■ ■ ■ iiii ■ další (T), ale výskyt chyby! ■ ■ ■ ■ ■ : T* T* 7« T* T+l-f T* l-o Ti 11 r 411 o t ' -u T-aT-oT-*T*T-oT*T« m í ii l'íil j- Hotovo! ■ konečný stav po odstranění „capping agents" a protekt. skupin, následuje zabalení „packaging" do „cartridge" ■ pro 25-mer potřeba obvykle méně než l0o masek (teor. maximum) • problém: přesahy mezi jednotlivými zónami (odrazy, rozptyl, vnitřní ozáření, ...) 7- V> ,\ V- — — ukázka části oblasti proby po hybridizaci (AFM, šířka obrázku je 2 um) Výsledek použití Nanostrukturace povrchů pomocí SPM skenovací raménko s hrotem slouží k vytváření obrazců na modifikovaném povrchu techniky: STM litografie - aplikuje se proudový puls AFM litografie - škrábání, scratching - "ťukání", dynamic plowing AFM oxidační litografie AFM konstrukční litografie AFM scratching ■ AFM zařízení jako nástroj pro modifikace povrchů ■ vyškrábání motivu v polymerní vrstvě pomocí ostrého hrotu - PTCDA, 3,4,9,10-perylentetrakarboxydianhydrid skenování zápis skenování Fantazii se meze nekladou ... ■ "nanoobrázky", ... j^j Flle | Uteu | EJtt | Topil | Opert*len | i=iP J | HftlH.HDT 6 WD 199B 1MD l,n Srovnání technik pro cílenou imobilizaci Techniky vhodné pro rozlišení pod 100 nm Přímá kovalentní vazba biomolekul Řízený proces v kapalině Různé typy povrchů a modifikačních činidel Nízká cena Vhodné pro rozlišeni až 10 nm Chemomechanical Patterning/Nanograftin g ano ano ano ano ano Dip Pen Nanolithography spíše ne ne ano ano difúzni limitace Microcontact Printing spíše ne ne ano ano asi ne AFM Mechanical Scribing and Nanoindending ne ne ne ano ano c-AFM Oxidation ne ne ano ano ano UHV STM Patterning ne ne ne ne ano E-beam Lithography ne ne ano ne asi ne UV Photolithography ne ne ano ne asi ne Kam to směřuje... představivost a fantazie, definování cíle výběr vhodných detekčních elementů - z čeho budeme stavět (aminokyseliny, nukleotidy, ...) vytvoření knihovny na základě kombinatorických postupů - všechny možné variace z daných stavebních kamenů paralelní testování vlastností molekul z knihovny - nalezení vhodných detekčních zpracování a výroba analytického systému - optimalizace výrobního procesu vysoce paralelní analytický proces - citlivé elementy ve formě 2D pole, oskenování (opticky, elektricky, magneticky, ...), začlenění dat do databáze matematické prohledání a prezentace, rozhodnutí - zpřístupnění výsledku uživateli v pochopitelné formě Příprava imunokonjugátů ■ imunogeny - nosné bílkoviny modifikované nízkomolekulárním antigenem (= hapten, sám o sobě nevyvolá imunitní odpověď) ■ značené protilátky a antigeny - tracery pro imunostanovení Imunogeny ■ imunogenicita - schopnost molekuly stimulovat imunologickou odpověď a následně tvorbu specifických protilátek ■ imunogen - cizorodost pro organismus, nevlastní původ, aby nebyl imunitním systémem ignorován - dostatečná velikost - aspoň 6 kDa, jinak se pouze naváže na receptorové mIgM na membráně B lymfocytu, ale není pohlcen endocytosou - chemická komplexnost - např. velké homopolymery z aminokyselin a jednoduché polysacharidy jsou zřídka imunogenní ■ biomakromolekuly jako imunogeny - sacharidy - jen pokud jsou dostatečně komplexní, nebo jako součást glykoproteinů - proteiny - dostatečně imunogenní; peptidy - příliš malé, je třeba je navázat na nosnou bílkovinu - lipidy, nukleové kyseliny - neimunogenní, musí být navázány na nosnou bílkovinu ■ malé molekuly - hapteny - fungují jako antigeny (epitop, váží je protilátky) - nefungují jako imunogeny, musí být konjugovány s nosičem Nosné bílkoviny ■ volba dle imunogenicity, velikosti a dostupnosti funkčních skupin pro navázání haptenu ■ KLH, keyhole limpet hemocyanin - z přílepky (měkýš) Megathura crenullata, kuproprotein vážící kyslík - mcKLH - z uměle pěstovaného organismu (mariculture) - lepší homogenita preparátu, lepší rozpustnost, v roztoku opalescentně namodralý - velikost 450 kDa až 8 MDa, je agregátem, stupeň agregace závisí na pH, nad pH 8,9 disociován na podjednotky - může být hůře rozpustný, roztoky často se zákalem, NaCl zlepšuje rozpustnost - má k dispozici hodně lyzinových zbytků - fylogeneticky vzdálený savcům ■ OVA, ovalbumin - z vaječného bílku, 45 kDa, dobře rozpustný, i v DMSO - využíván hojně i při screeningu protilátek BSA, bovine sérum albumin - albumin tvoří asi polovinu proteinů plasmy, stabilní a dobře rozpustný - 67 kDa, pI 5.1, jediný polypeptid obsahující 59 lyzinových zbytků, z nichž 30 až 35 je využitelných pro imunokonjugační postupy - pro konjgace je nejlepší frakce V, vysoce přečištěná - využíván nejen jako nosič v imunogenu, ale i při screeningu protilátek a při blokování pracovních povrchů - cBSA, cationized BSA - povrchové karboxyly derivatizovány ethylendiaminem pomocí EDC, zvýšení pI na 11 nh2 0 nh2 0 hooc J-^/C00H nh2(ch2)2nh—'■l 1^ V— nh(ch2)2nh h2n—( BSA )— nh2 nh2(ch2)2nh2 h2N—( BSA)— nh2 . , 2 -_ ,,2.. ,----, h00c I c00h nh2(ch2)2nh—ij T [1—nh(ch2)2nh2 nh2 Ji nh2 ji 2 0 2 0 lepší imunogen než nativní BSA (stačí ho méně), netřeba kompletní Freudovo adjuvans vyšší afinita k záporně nabité membráně antigen-prezentujících buněk pro konjugace lze využívat EDC bez nebezpečí postranních reakcí Konjugace haptenu ■ protilátky jsou produkovány proti navázanému haptenu, ale i proti epitopům nosiče - význam selekční procedury pro nalezení těch správných ■ optimalizace imunogenu - zkusit různé nosné proteiny a různé hustoty navázaného haptenu ■ obvykle se využívá povrchová aminoskupina nosné bílkoviny, ke které se pomocí heterobifunkčního crosslinkeru připojí hapten - inkubace nosiče s crosslinkerem (nadbytek) - odstranění přebytku crosslinkeru - inkubace s molekulou haptenu - jednoznačný průběh reakce ■ pozor při volbě reagující skupiny haptenu ■ mimo oblast epitopu v oblasti epitopu Imunizace ■ imunogen se aplikuje experimentálnímu zvířeti (myš, morče, králík, koza, kůň, ...) injekčné v přítomnosti tzv. adjuvans - přípravek stimulující imunitní odpověď - FCA, Freudovo kompletní adjuvans - emulze vody v oleji plus mrtvé buňky Mycobacteria • emulze zadržuje imunogen v místě aplikace po delší dobu •buňky Mykobacteria přitahují do daného místa makrofágy a další imunitní buňky - FIA, Freudovo inkompletní adjuvans - jako FCA, bez Mykobacteria - ve vodé rozpustné polysacharidy - méné účinné než FCA, méné zatěžující pro organismus - Alum - hydroxidy hlinitý a horečnatý Screening protilátek konjugát haptenu s nosičem vyvolá tvorbu různých druhů protilátek, specifických proti různým částem imunogenu proti nosiči (nežádoucí) proti epitopu haptenu^^^. (požadované) proti spojovacímu úseku (bridge-specific, nežádoucí) - nalezení vhodné protilátky zajistí screening pomocí haptenu imobilizovaného na jiný nosič a jiným způsobem, než v případě imunogenu (opakuje se pouze epitop) protilátky - koncentrace vs. titr - různé pojmy - celková koncentrace molekul protilátky (molární, mg/ml, ...) bez zahrnutí funkčních parametrů (i poškozené či částečné denaturované neaktivní), - titr = zředění dané protilátky vhodné pro daný typ imunostanovení Určení koncentrace protilátky > při 280 nm má roztok čistého IgG 1 mg/ml absorbanci 1,35 > stanovení IgG v komplexních roztocích (sérum, ascitická tekutina, extrakt z tkáňové kultury,...) - použije se latexové precipitační stanovení - latexové částice potažené protilátkou proti měřenému IgG (např. anti myší, ...) - monodisperzní částice volně v roztoku vykazují vysokou absorbanci při 340 nebo 405 nm - v přítomnosti cílové protilátky dochází k agregaci částic a k poklesu absorbance - rychlost - 5 min - vysoká citlivost - rozsah 10 - 300 ng/ml Absrjrbance \ Particle Size 88-83 Fragmentace protilátek ■ pro mnoho účelů nepotřebujeme celou molekulu protilátky, ale stačí nám pouze menší část nesoucí vazné místo - menší molekula - méně nespecifických interakcí - snazší konjugační reakce, menší enzymové konjugáty - fragmenty vznikají štěpením proteinasami, nejlépe imobilizovanými na vhodný nosič ■ fragmenty z molekuly imonoglobulinu G IgG F(ab|, F»b' Fab Fv "rlgG- Fc F(ab% Heavy 2 Fab (110,000 daltons) ^ Chain (50,000daitcnsea.) <^^\>Aj^ Immobilized Ficin <^)Xf'^> Immobilized Ficin 1 cnM cysteine 10 mM cysteine Immobilized Pepsin Immobilized Papain (150.000 data) U J Fc Fragments Fc (50,000 daltons) Fragmentace IgM 1 IgM ... příliš velká molekula náchylná k nespecifickým vazbám, špatná penetrace v histochemických aplikacích - potřeba vytvořit menší vazné molekuly ' poněkud odlišné výsledky pro IgM různých organismů Zlepšení specifity biointerakce ■ blokování pracovního povrchu - cílem vysytit nespecifická vazebná místa (nosiče, sensoru, mikrodestičky, ...) vhodnou inertní látkou - dosáhnout nižšího pozadí signálu - na interakci se účastní řada faktorů, úspěšné blokování je tedy výsledkem empirických pokusů ■ blokovací roztoky - buď v PBS (phosphate buffered saline) nebo v TBS (tris buffered saline; ALP jako značka nemá ráda fosfát) - inertní proteiny: 1% kasein, 1 až 3% albumin (BSA) - komplexní směsi: sušené beztučné mléko (může obsahovat biotin), rybí sérum (steelhead salmon serum, fylogeneticky vzdálené savčím bílkovinám) - detergenty - Tween 20 nebo Tween 80 - adsorbují se na hydrofobní povrchy a tím je učiní hydrofilní ■ promývání afinitních komplexů - roztoky obsahující nízké koncentrace (kolem 0,05%) detergentů - přeruší pouze nespecifické interakce proteinů - Tween 20 a 80, Triton X-100, Nonidet P-40, Brij-35, CHAPS, CHAPSO Charakterizace biokonjugátů a imobilizovaných nosičů ■ separace z reakční směsi ■ určení stupně substituce ■ další charakteristiky ■ uchovávání Izolace biokonjugátů separace od nezreagovaných složek konjugační směsi odstranění nízkomolekulárních komponent - nejjednodušší je dialýza v celulosovém střívku - přes noc, v chladu, vyměnit několikrát dialyzační roztok - rychlejší s centrifugačními či jinými mikrodialyzátory, konjugát málo stabilní, vhodné pro malé objemy - rychlá separace na vhodné odsolovací koloně 0.1 ml 5 M NaCl proti 1 l vody Timfl {MinjOtBSl Zakoncentrování biokonjugátu ■ zahuštění - tlakové ultrafiltrační systémy - dialyzační trubice a vněčinidla odnímající vodu (PEG, Sephadex) - centrifugační evaporátory - šetrné podmínky - lyofilizace - použít zředěný nebo těkavý pufr - vakuová pomůcka na obrázku... ■ konjugáty tvořené dvěma biomakromolekulami - chromatografické přečištění - vhodná afinitní separační technika - isolace protilátkových konjugátů od zbylého enzymu (vadí!) • imobilizovaný antigen • protein A/G/L Stupeň substituce ■ vzniká barevný či fluoreskující produkt - spektrální vlastnosti ■ diferenciální metoda, stanovení: - zbylého nenavázaného ligandu - zbylých neobsazených skupin biomakromolekuly (jen pro "malé" ligandy) ■ stanovení navázaných molekul ligandu vhodnou specifickou reakcí ■ změření změny molekulové hmotnosti konjugátu oproti výchozí biomakromolekule - gelová permeační chromatografie - elektroforesa v PAG v nedenaturujícím uspořádání - hmotnostní spektroskopie ■ hydrolýza a charakterizace vzniklých produktů - proteolytické štěpení, mapování štěpů - úplná hydrolýza, stanovení aa či detekce uvolněného ligandu ■ detekce barevného postranního produktu konjugační reakce - žlutý p-nitrofenol při použití p-nitrofenylkarboxylesteru jako aktivované matrice - pyridin-2-thion (£343 = 8080 M-1 cm-1) při vazbě -SH na pyridyl-2-thioaktivované nosiče Absorbance ■ při výrobě biokonjugátu dojde ke změně spektrální vlastnosti produktu (navázání barviva nebo fluoroforu na nosnou bílkovinu) ■ kvalitu konjugátu lze posoudit na základě změněných spektrálních vlastností ■ některé konjugační reakce poskytují barevné produkty díky vzniklému můstku - diazotační postupy 300 350 400 450 500 550 X (nm) UV-VIS spektra albuminu a konjugátu albuminu s haptenem, připravený diazotační metodou. Měřeno v 50 mM fosfátu pH 7.0, koncentrace bílkovin 1,5 mg/ml. Stanovení aminoskupin j volná aminoskupina s kyselinou 2,4,6- trinitrobenzensulfonovou (TNBS) dává barevný oranžový produkt - měřitelný při 335 nm (v 200 mM HCl s 2% SDS) — změřená absorbance se porovná s kalibrací pro vhodný standard, např. aa R— nh2 so3h . hn | TNBS no2 no2 pro vysoce citlivou fluorescenční detekci volných aminoskupin lze použít o-ftaldialdehyd (OPA) v přítomnosti 2-merkaptoethanolu - produktem je fluoreskující sloučenina (360 / 455 nm) — použije se opět kalibrace na standard o R—nh0 -oh o hs Sulfhydrylové skupiny j Ellmanovo činidlo, 5,5'-dithiobis(2-nitrobenzoová kyselina) - reaguje s volnými SH skupinami za vzniku disulfidu - uvolní se kyselina thionitrobenzoová - intenzívně žlutá barva - £412 = 13600 M-1 cm-1 )OC Ellmanovo činid|o COOH I HOOC COOH I—^ ^-S—S—^—NO2 ——-► O2N-^-S—S—R + -^—NO2 Biotinové zbytky 1 stanovení úrovně biotinylace má význam při hodnocení průběhu konjugace a při kontrole reprodukovatelnosti procesu • využívá se 2-(4'-hydroxyazobenzen)-benzoová kyselina (HABA) - po navázání na avidin vykazuje silnou absorbanci při 500 nm - £ = 3,55-104 M-1 cm-1 (HABA4:avidin) pokud se v prostředí nachází volný nebo vázaný biotin, vytěsní molekulu HABA z vazebného místa a proporcionálně se sníží absorbance 1 principem je rozdíl afinit obou molekul k avidinu, Ka je - 1,3-1015 M-1 pro avidin - 6-106 M-1 pro HABA může být zajímavé porovnat získané hodnoty pro celý nativní biotinylovaný protein a pro stejný konjugát předem hydrolyzovaný např. pronasou na menší fragmenty - lze tak posoudit množství celkového a snadno dostupného biotinu v molekule konjugátu Biotin vážící místa ■ Velmi užitečné může být stanovení vazebných míst pro biotin na imobilizovaných molekulách avidinu nebo streptavidinu ■ derivát biotinu s p-nitrofenolem je bezbarvé činidlo, které se naváže na imobilizovaný avidin ■ po opláchnutí nosiče se v alkalickém prostředí zhydrolyzuje esterová vazba a uvolněný nitrofenol je v tomto prostředí intenzívně žlutý ■ jeho množství odpovídá biotin-vážícím místům, t410 = 18300 M-1 cm-1 O HNANH HN NH biotin-p-nitrofenylester S O2N MALDI ■ matrix assisted laser desorption ionization ■ v přítomnosti pomocné molekuly lze ionizovat i proteinové konjugáty - do asi 100 kDa - z MS spektra se určímol. hmotnost konjugátu - porovnáním s mol.hmotností výchozí bílkoviny se dá určit stupeň substituce ■ naštěpení konjugátu a výchozího proteinu sekvenčně specifickou endoproteasou (trypsin, štěpí na karboxy konci Arg a Lys) - úprava štěpů - redukce a alkylace - MALDI analýza štěpných produktů - "vymizení" určitého peptidu u konjugátu svědčí o modifikaci v jeho aminokyselinách - místo srovnávacího proteinu lze použít "teoretické" štěpení známé sekvence z proteinové databáze Enzymy jako bioligandy ■ mohou být barevné - peroxidasa - červená - flavinovéoxidasy -žluté ■ v imunokonjugátech spolu s protilátkou či antigenem = tracer - vždy změřit enzymovou aktivitu konjugátu (kolik procent z původně přítomné aktivity se zachovalo = vhodnost způsobu konjugace) - stanovit také koncentraci bílkoviny (specifická enzymová aktivita) - v literatuře velmi často údaje typu X-krát zředěný tracer, aniž by se uvedla výchozí koncentrace... Chromatografické nosiče ■ běžné nosiče - schopné vázat volné aminoskupiny ligandů či biomolekul; určení výchozí vazebná kapacity: - derivatizace nosiče diaminem (ethylendiamin, 1,3-diaminopropan) - stanoví se množství získaných aminoskupin pomocí ninhydrinové reakce - slouží obecně pro kvantifikaci aminoskupin, zejména v případě aminokyselin - vzniká růžovofialové zbarvení, £570 = 8750 M-1 cm-1 OH O OH Stanovení imobilizovaných bílkovin j u bílkovin je výhodné použít jejich redukční vlastnosti v alkalickém prostředí vůči iontům Cu2+ - vzniklá jednomocná měď Cu+ se pak stanoví jako barevný komplex pomocí kyseliny bicinchoninové (BCA), Cu+(BCA)2 - reakce není příliš specifická a reagují také jiné redukující látky (aminy, hydrazidy, redukující cukry aj.) - zbarvení se měřípři 560 nm ■ kvalitativní průkaz přítomnosti bílkovin na modifikovaném nosiči lze také provést použitím Coomassie Blue 250 (Bradfordové činidlo), kdy vzniká adsorpční modrý komplex (595 nm) s imobilizovanými proteiny Imobilizace na povrch sensorů ■ pro stanovení množství navázaného ligandu omezeně použitelné i metody zmíněné pro pro biokonjugáty nebo chromatografické nosiče - komplikací je velmi omezená vazebná kapacita poskytující pouze malá množství stanovitelných barevných produktů ■ imobilizace biomolekul na povrch přímých afinitních sensorů se ale velmi často provádí „online": - sleduje se změna specifického signálu v reálném čase - signál odpovídá množství biomolekul vázaných na povrch, je tak přímo výsledek imobilizace „vidět" a je ihned známo, jaké množství bioligandu se imobilizovalo - výhodou je jednoduchá možnost připravit citlivé povrchy s požadovanou hustotou bioligandu ■ tímto způsobem fungují optické sensory na bázi rezonance povrchovým plazmonů (SPR) nebo piezoelektrické sensory (křemenné chemické mikrovážky, QCM) ■ u QCM lze navázaný bioligand pohodlně přímo „zvážit" stanovením rozdílu rezonanční frekvence sensoru v suchém stavu před a po imobilizačním kroku ■ rozdíl je přímo úměrný změně hmotnosti po navázání biomolekul Imobilizace v reálném čase ■ signál sensoru je úměrný množství navázaných biomolekul - záznam imobilizace tedy poskytne přesné informace o navázaném množství ukázka imobilizace protilátky na sensor lAsys (optický systém rezonančního zrcadla) - aktivace glutaraldehydem - vazba protilátky - vysycení zbylých vazeb. míst inertní bílkovinou - rozdíl signálu se bere v přítomnosti pufru, tím se vyloučí skoky signálu dané různým složením imobilizačních roztoků Sensor se silanizovaným povrchem (volné -NH) albumin (deaktivace) R (arc s) glutaraldehyd (aktivace) navázané množství Ab bioligand) t (min) 1000 P 500 0 Zobrazení označeného ligandu ■ imobilizovaný ligand se označí pomocí např. fluorescenčně značené protilátky, obraz povrchu se získá pomocí fluorescečního mikroskopu nebo skeneru (nižší rozlišení) ■ ukázka zviditelnění imobilizovaného proteinu pomocí specifické protilátky značené fluoresceinem, sken intenzity a pseudoobarvení *_ ■ porézní kontrolní porézní porézní kontrolní (elchem. oxidace) (ox. parami HF) povrchy Si Zobrazení modifikovaného povrchu mikroskopie na bázi meziatomoyých sil (AFM) poskytuje 3D „plastický" pohled na povrch - přítomnost imobilizovaných biomolekul lze hodnotit na základě profilometrické analýzy AFM obrazů tapping mod, image xy 500x500 nm histogram pro Z, z osa 0 až 5 nm