Úloha č. 3 plynová rozdělovací chromatografie (GLC) Seznámení s metodou, stanovení acetonu v rozpouštědle CÍLE ÚLOHY * kvantitativně stanovit obsah acetonu v rozpouštědle pomocí plynové rozdělovací chromatografie. Důležité pokyny (čtěte prosím pozorně!!!): * otevírání plynů zleva! * dávat si pozor na červenou kontrolku Ready! * metoda nástřiku - vymývat stříkačku destilovanou vodou, nasát požadované množství vzorku + ještě asi 2 µl vzduchu - nástřik provést co nejrychleji (hrot směřuje mírně k přednímu panelu)! * stříkačka jde zasunout do přístroje hůře, proto nepoužívat násilí, ale šikovnost! * uzavírání plynů zprava! * plynový chromatograf můžete vypnout až teploty detektoru (DET 1) a nástřikového prostoru (INJ 1) klesnou pod 100 °C!!! ÚKOLY: 3.1. Seznámení s metodou GC 3.2. Příprava vzorků k měření 3.3. Stanovení jednotlivých vzorků 3.4. Ukončení a vhodnocení analýzy 3.1. SEZNÁMENÍ S METODOU GLC PRINCIP: Plynová chromatografie (GC) je vysoce účinná metoda pro separaci a stanovení plynných látek nebo látek, které lze zplynit. Hnací silou je proud inertního plynu (mobilní fáze). V tomto cvičení budete provádět analýzu rozpouštědla a stanovovat množství acetonu ve vzorku. * kvalitativní charakteristikou látky je retenční čas t[r], popř. redukovaný retenční čas t[r]´ * kvantitativní charakteristikou látky je výška píku h[max], popř. plocha píku A * počet efektivních teoretických pater N[ef ]je mírou účinnosti kolony: kde: t[0] je mrtvý čas w je příslušná délka základny píku (trojúhelníku), (t[r] - t[0]) je redukovaný retenční čas t[r]´ * rozlišení R[s] je mírou separace dvou píků. Při R[s] = 1,5 považujeme píky za kvantitativně odseparované: Pracovní podmínky: * plynový chromatograf YL 6100 GC NASTAVENÍ podmínEK PRO METODU 3: * metoda 3 - rozpouštědla: · detektor - plamenově ionizační (FID): - teplota detektoru: 240 °C - průtok: H[2] 30 ml, vzduch 300 ml, Makeup 20 ml · kolona: - typ: CARBOWAX, délka 30 m, vnitřní průměr 0,25 mm, tloušťka sorbentu 0,25 µm - tepelný program kolony: 40 °C (4 minuty), 40 °C/min, 180 °C (0 minut) ≈ 7,5 minut + 6 minut chlazení; celkový čas cyklu ≈ 13,5 minut - průtok nosného plynu přes kolonu: 1ml/min - rozdělovací poměr nástřiku: 1/70 · nástřikový prostor: - teplota nástřikového prostoru: 200 °C 3.2. PŘÍPRAVA VZORKŮ K MĚŘENÍ Popis vzorků a roztoků: 1. Vzorek rozpouštědla: · vzorek zředíte 100x - do odměrné baňky na 10 ml napipetujete 100 µl neznámého vzorku a doplníte destilovanou vodou po rysku; vzorky je vždy nutné ultrazvučit 2. Kalibrační roztoky: · obsah acetonu: 0,02 ; 0,04 ; 0,06 ; 0,08 ; 0,10 % (v/v) - do 100 ml odměrné baňky napipetujete postupně 20, 40, 60, 80 a 100 µl acetonu a doplníte destilovanou vodou po rysku 3. Roztok pro stanovení acetonu v rozpouštědle metodou přídavku standardu: · do odměrné baňky na 10 ml napipetujete 100 µl neznámého vzorku, přidáte 20 µl acetonu a doplníte destilovanou vodou 3.3. MĚŘENÍ 3.3.1. základy plynové chromatografie: 1. Za dohledu vyučujícího si prohlédnete součásti plynového chromatografu (kolonový prostor, detektor, nástřikový prostor, atd) 3.3.2. Stanovení množství acetonu ve vzorku, URČENÍ MRTVÉHO času: metoda kalibrační křivky: a) určení MRTVÉHO ČASU: 1. Pomocí hlavních ventilů otevřete postupně všechny plyny (! POZOR: první otevřete dusík – první tlaková láhev vlevo!) 2. Spustíte PC a tiskárnu 3. Vzadu zapnete plynový chromatograf a na počítači spustíte program YLClarity 4. Kliknete na ikonu Login pod nápisem Instrument 1, po otevření okna vyberete možnost Student, zadáte heslo Slivovice a kliknete OK Objeví se vám následující okno: 5. Kliknete na File → Open method... → metoda 1 - start.met → OK 6. Poté kliknete na ikonku Control (Přímé řízení GC/LC) → Apply → OK (metoda se tímto způsobem pošle do GC a přístroj začne pracovat) 7. Kliknete na File → Open method... → metoda 2 - vyhrivani.met → OK 8. Po rozsvícení červené kontrolky Ready na předním panelu přístroje GC kliknete na ikonku Control (Přímé řízení GC/LC) → Apply → OK 9. Kliknete na File → Open method... → metoda 3 - rozpouštědla.met → OK (! POZOR: před posláním metody do GC a před provedením nástřiku vždy vyčkáte na rozsvícení červené kontrolky Ready!) 10. Po rozsvícení červené kontrolky Ready na předním panelu přístroje GC kliknete na ikonku Control (Přímé řízení GC/LC) → Apply → OK 11. Během čekání na rozsvícení červené kontrolky Ready si připravte požadované roztoky 12. Kliknete na ikonu Single Analysis (Jednotlivá analýza Start/Stop) a vypíšete informace ke vzorku do kolonek Sample ID (vaše jméno a příjmení), Sample (stručný popis vzorku), Inj. Volume (objem nástřiku) a do pole Counter napíšeme 1 13. Před prvním nástřikem provedete kontrolu funkčnosti detektoru: nad detektor přiložíte sklíčko, pokud se zarosí, vše je v pořádku a pokračujete dále dle návodu, pokud se sklíčko nezarosí, zavoláte na pomoc vyučujícího 14. Provedete nástřik asi 1 µl plynu, který nasajete z ventilu v laboratoři (! POZOR: první nástřik za dohledu vyučujícího!) a na GC stisknete „ihned“ tlačítko Start (na GC se rozsvítí zelená kontrolka Run) 15. Průběh chromatografie můžete sledovat po kliknutí na ikonu Data Acquisition (Sledování analýzy) - je vhodné nastavit rozsah cca od 0 do 1000 mV (může se lišit) 16. V následném okně chromatogramu kliknete na ikonku a vyřadíte nepotřebné píky ve vybraném intervalu z integrace 17. V horizontální nástrojové liště kliknete na ikonku , potvrdíte tisk a po vytištění chromatogramu zavřete okna chromatogramu a sledování analýzy b) VYTVOŘENÍ KALIBRAČNÍ ZÁVISLOSTI a určení množství acetonu ve vzorku: 1. Kliknete na ikonu Single Analysis (Jednotlivá analýza Start/Stop) a vypíšete informace ke vzorku do kolonek Sample ID, Sample a Inj. Volume 2. Provedete nástřik 1 µl 1. kalibračního vzorku 3. Rozsah cca od 0 do 1000 mV (může se lišit) 4. V nástrojové liště chromatogramu kliknete na ikonku a vyřadíte nepotřebné píky ve vybraném intervalu z integrace (označený zůstane pouze pík acetonu) 5. Zavřete chromatogram (potvrďte případnou otázku programu na změnu chromatogramu) 6. Provedete nástřik 1 µl 2. kalibračního vzorku 7. Rozsah cca od 0 do 1000 mV (může se lišit) 8. V nástrojové liště chromatogramu kliknete na ikonku a vyřadíte nepotřebné píky ve vybraném intervalu z integrace (označený zůstane pouze pík acetonu) 9. Zavřete chromatogram (potvrďte případnou otázku programu na změnu chromatogramu) 10. Stejným způsobem provedete nástřik i 3., 4. a 5. kalibračního roztoku 11. Provedete nástřik 1 µl zředěného (1:100) neznámého vzorku 12. Rozsah cca od 0 do 2000 mV (může se lišit) 13. V nástrojové liště chromatogramu kliknete na ikonku a vyřadíte nepotřebné píky ve vybraném intervalu z integrace (označený zůstane pouze pík acetonu) 14. Zavřete chromatogram (potvrďte případnou otázku programu na změnu chromatogramu) 15. Kliknete na ikonu Calibration Window (Tvorba kalibračních křivek) a v kalibračním okně kliknete na File → New 16. Kliknete na ikonu , ve složce Data si naleznete chromatogram kalibračního roztoku č.1 a kliknete OK 17. V horizontální liště kalibračního okna kliknete na ikonu a levým tlačítkem na myši kliknete na pík acetonu V tabulce se vám objeví přibližně takový popis: 18. Do políčka Compound Name napíšete Aceton a do políčka Amount zadáte hodnotu 0,02 19. Kliknete na ikonu , ve složce Data si naleznete chromatogram kalibračního roztoku č. 2 a kliknete OK 20. V horizontální liště kalibračního okna kliknete na ikonu a levým tlačítkem na myši kliknete na pík acetonu 21. Do políčka Amount nyní zadáte hodnotu 0,04 22. Stejným způsobem postupujete i s kalibračními roztoky č. 3, 4 a 5 23. V horizontální nástrojové liště kliknete na ikonku Calibration Options a v následném okně zadáte do políčka Compound %: 24. Kliknete na ikonu , ve složce Data si naleznete chromatogram 100x zředěného vzorku rozpouštědla a kliknete OK 25. V horizontální liště kalibračního okna kliknete na ikonu a levým tlačítkem na myši kliknete na pík acetonu 26. V levém dolním rohu kliknete na podokno s názvem Aceton Objeví se vám následující okno: 27. U vzorku rozpouštědla (prvních pět řádků patří standardům) odškrtnete políčko ve sloupci Used (na obrázku je to řádek 4) a pomocí vhodně zadaného přibližného množství do sloupce Amount graficky určíte polohu vzorku (v grafu se vám vzorek zobrazí jako kolečko - viz předchozí obrázek) 28. Kalibrační okno vytisknete a přesnou polohu vzorku určíte z rovnice 29. Kalibrační okno zavřete a změny neukládáte!!! metoda přídavku standardu: * metoda předpokládá linearitu kalibrační závislosti a) určení množství ACETONU ve vzorku: 1. Kliknete na ikonu Single Analysis (Jednotlivá analýza Start/Stop) a vypíšete informace ke vzorku do kolonek Sample ID, Sample a Inj. Volume 2. Provedete nástřik 1 µl zředěného (1:100) vzorku rozpouštědla 3. Rozsah cca od 0 do 2000 mV (může se lišit) 4. V nástrojové liště chromatogramu kliknete na ikonku a vyřadíte nepotřebné píky ve vybraném intervalu z integrace (označený zůstane pouze pík acetonu) 5. Takto upravený chromatogram vytisknete 6. Kliknete na ikonu Single Analysis (Jednotlivá analýza Start/Stop) a vypíšete informace ke vzorku do kolonek Sample ID, Sample a Inj. Volume 7. Provedete nástřik 1 µl zředěného vzorku rozpouštědla s přídavkem standardu 8. Rozsah cca od 0 do 2000 mV (může se lišit) 9. V nástrojové liště chromatogramu kliknete na ikonku a vyřadíte nepotřebné píky ve vybraném intervalu z integrace (označený zůstane pouze pík acetonu) 10. Takto upravený chromatogram vytisknete 11. Podle následujícího vzorce vypočítáte koncentraci neznámého vzorku: kde: c[1] ... koncentrace neznámého analytu c[s] ... koncentrace standardu V[1] ... objem vzorku V[s] ... objem roztoku standardu A[1] ...plocha píku analytu o neznámé koncentraci c[1] A[2] ... plocha píku analytu o neznámé koncentraci c[1 ]po přídavku standardu o známé koncentraci c[s] 3.3.4. UKONČENÍ ANALÝZY 1. Požádejte vyučujícího o kontrolu vaší práce 2. Kliknete na File → Open method... → metoda 4 - ukonceni.met → OK 3. poté kliknete na ikonku Control (Přímé řízení GC/LC) → Apply → OK 4. na ploše počítače kliknete na Počítač → Systém (C:) → YLClarity → Koralka → Data 5. Vytvoříte si složku se svým jménem a přesunete do ní všechny vaše chromatogramy!!! 6. Než se přístroj ochladí, vypnete PC, tiskárnu a uklidíte pracovní stůl 7. ! POZOR: Před vypnutím GC zavoláte vyučujícího! 8. ! POZOR: Uzavřete postupně ventily všech plynů - zprava! 3.4. VYHODNOCENí: Do protokolu uvedete tyto výpočty: 1. Pro aceton určete počet teoretických pater 2. Stanovíte rozlišení mezi plynem z ventilu a acetonem 3. Zjistíte procentuální množství acetonu ve vzorku rozpouštědla pomocí metody kalibrační křivky a metody přídavku standardu 4. Porovnejte mezi sebou obě metody a zdůvodněte možné rozdíly ve stanovení acetonu. 5. Odpovězte na otázky k diskuzi dle zadání vyučujícího