Chromatografické metody II. Aplikační rozsah chromatografie Chromatografie Kapalinová chromatografie rozdělení uNízkotlaká (atmosferický tlak) – LPC u uStřednětlaká (4 Mpa) – FPLC u uVysokotlaká (40 Mpa) – HPLC u uUltravysokotlaká (100 Mpa) – UPLC u Kapalinová chromatografie využití uLPC – preparativní u uFPLC – semipreparativní a analytická u uHPLC – analytická u uUPLC – analytická u u Kapalinová chromatografie doba trvání uLPC – hodiny u uFPLC – desítky minut u uHPLC – minuty u uUPLC - sekundy Zařízení pro LPC Zařízení pro LPC Zařízení pro LPC Zařízení pro LPC Instrumentace pro LPC uPumpa – peristaltická nebo gravitace uGradient – mísič gradientu uDávkování – přímo pumpou na u kolonu uKolony – skleněné uDetekce – spektrofotometrická 254, u 280 nm uVyhodnocování – zapisovač uSběrač frakcí – programovatelný LPC Instrumentace pro FPLC a HPLC Zařízení pro FPLC a HPLC system Zařízení pro FPLC Zařízení pro HPLC Zařízení pro UPLC UPLC x HPLC •kratší doba analýzy = vyšší průchodnost vzorků (vyšší produktivita) •snížení nákladů = menší spotřeba HPLC rozpouštědel (ekologie) •zvýšení separační účinnosti • •snížení meze detekce – zvýšení citlivosti • ••více kvalitativních informací UPLC x HPLC UPLC x HPLC Příprava mobilní fáze Příprava mobilní fáze •filtrace • • Odplynění mobilní fáze •přechod varem za nízkého tlaku • •ozvučení ultrazvukem • •vakuová filtrace • •in-line membránové odplynění • •probublávání inertním plynem Pumpy Pumpy pracující za konstantního tlaku Tlaková pumpa Pumpy pracující za konstantního průtoku Lineární dávkovače Pumpa jednopístová Pumpa dvoupístová pmp_2p2v Pumpa dvoupístová dpist_pm Pumpa dvoupístová pmp_2p3v Tlumení pulsů flow_prf Tlumení pulsů dampher Gradient nízkotlaký grad_for Gradient vysokotlaký hp_grad Dávkování – septum Dávkování – dávkovací ventil j_valve Dávkování – dávkovací ventil j_valve Dávkovací ventil – „Load“ inj_load Dávkovací ventil – „Inject“ inj_inj Kolony pro FPLC Kolona 1. kovový plášť 2. Porézní kovová frita 3. Stacionární fáze 4. Převlečný ochranný kroužek 5. Koncová hlavice 6. vstup pro kapiláru se šroubem Předkolona Kolony pro HPLC a UPLC Kolony pro nano- a kapilární HPLC Částicový sorbent tvar: sférický (bez povrchových vad) rozměr pro kolony: analytické 1 – 8 μm preparativní > 10 μm povrchové rozrůznění póry polymerní částice Monolitický sorbent makropóry: ~1500 nm; mezopóry: < 50 nm, mikropóry < 2 nm pórovitost monolitické stacionární fáze až 85 %; oproti částicové s pórovitostí max 60 % vysoké průtoky za nízkých tlaků; velká efektivní plocha Þ rychlá separace: vysoké rozlišení a vysoká kapacita ML-SF na bázi siliky tetramethoxysilan (TMOS) tetraethoxysilan (TEOS) + kyselina octová + polyethylenglykol (PEG) ML-SF na bázi organických materiálů styren-divinylbenzen (S-DVB) izooktan metakryláty tetrahydrofuran vinyl-deriváty (vinylpyrrolidon, vinylacetát) dekanol monomer + polymerační činidlo + porogen monolith_shapes provedení: disk, trubička, plněná kapilára nevýhoda: obtížná výroba Perfúzní chromatografie uVyužívá médií - POROS média, jejichž částice (10, 20,50 mm) mají velké příčné póry - 600 - 800 nm. Molekuly biopolymerů unášené konvektivním prouděním mobilní fáze se těmito póry lehce dostávají do nitra částic. Příčné póry jsou navíc vzájemně propojeny krátkými “difuzními” póry - 50 – 150 nm. Vytváří se tak síťová struktura s rozsáhlým vnitřním prostorem pro interakci nosiče s biopolymerem. u Perfúzní chromatografie - princip u Průtokem mobilní fáze vytváří napříč každou částicí média rozdíl tlaku, který indukuje konvektivní tok příčnými póry (perfúze). Biomakromolekuly ve vzorku se tak dostávají do kontaktu jak s povrchem částic, tak i s vazebnými místy v jejich nitru. Perfúzní chromatografie u K efektu perfúze dochází jen při určité průtokové rychlosti. Moderní HPLC a FPLC systémy mohou zajistit podmínky perfúze pouze u malých analytických POROS kolon (4.6 x 100 mm, objem 1.7 ml, při průtokové rychlosti kolem 10 ml.min-1). u uVýhody ve srovnání s chromatografií konvenční: nKapacita je vysoká, nezávisí na průtokové rychlosti. nRozlišení je vysoké, nezávisí na průtokové rychlosti. nRychlost separace je obvykle 10 - 100x větší než u konvenčních médií, řádově se pohybuje v minutách. Perfúzní chromatografie - princip UPLC stacionární fáze Waters UPLC stacionární fáze Waters Chipová chromatografie struktury vyleptané do křemíkové (Si) destičky výhody: rychlost analýzy, velikost, malá spotřeba vzorku (< nl !) nevýhody: práce s malými objemy (povr. napětí, elektrostatické interakce) Disk and MALDI target area doprava MF: pumpa, odstředivá síla, el. staticky Chipová chromatografie Agilent Detektory Detektory Refraktometrický detektor index lomu šum 10-7 dyn. rozsah 104 citlivost 10-7 g/ml Refraktometrický detektor ri_def Refraktometrický detektor Refraktometrický detektor „Light scattering“ detektor Rozptyl šum 10-8 dyn. rozsah 104 citlivost 10-9 g/ml „Light scattering“ detektor light_sc UV – VIS detektor detekční cela Absorbance šum 10-4 dyn. rozsah 104 citlivost 10-10 g/ml UV – VIS detektor detekční cela cell UV – VIS detektor s fixní vlnovou délkou uv_fix UV – VIS detektor s proměnlivou vlnovou délkou uv_var UV – VIS detektor s diodovým polem uv_darr Fluorescenční detektor Fluorescence citlivost 10-9 g/ml Fluorescenční detektor det_fluo Elektrochemický detektor elektrický proud citlivost 10-9 g/ml Elektrochemický detektor electr_d Konduktometrický detektor Vodivost šum 10-3 dyn. rozsah 106 citlivost 10-8 g/ml Konduktometrický detektor conduc_c Aerosolový detektor nabitých částic LC-MS počet iontů citlivost 10-13 g/ml LC-MS „Electrospray“ Ionizace Ion Trap Kvadrupol Šum a drift detektoru u u u u u uMez detekce S/N > 3 uMez stanovitelnosti S/N > 10 u noise > 3 Lineární rozsah detektoru de1_resp Derivatizace uzvýšení citlivosti nebo umožnění detekce vůbec u u zvýšení rozlišení nebo umožnění separace vůbec u uzamezení nežádoucí sorpce látek na koloně Požadavky na deriváty uchemické individuum u ustabilní u ureakce kvantitativní, rychlá, selektivní bez vedlejších produktů za mírných reakčních podmínek (pH, teplota) u učinidlo musí být dobře separovatelné od svých produktů na koloně jiné fyzikálně-chemickévlastnosti Derivatizace u„pre-column“ - před vlastní analýzou u u„post-column“ – za kolonou po analýze Derivatizace Vyhodnocení uZapisovače u uIntegratory u uIntegrační software + PC Zjištění plochy píků u zapisovačů vážením Zjištění plochy píků u zapisovačů planimetrem Zjištění plochy píků u zapisovačů výpočtem plocha = základna x výška Integrator Provedení uAnalytické u uPreparativní u Analýza kvalitativní uSrovnání retenčních časů (objemů) píků u vzorku a standardů u u„spiking“ – přidání standardu do vzoru ® nárůst výšky píků u uSpecifická detekce – UV-VIS, fluorescence, elektrochemická u uMS Analýza kvantitativní u¯ uPlocha (výška) píku u u Analýza kvantitativní uMetoda externího standardu u Analýza kvantitativní uMetoda vnitřního standardu u Analýza kvantitativní uMetoda standardního přídavku u Problémy při LC analýze LC analýza