Optimalizace ICP
a vývoj analytické metody
Viktor Kanický
6. Kurs ICP 2011
Spektroskopická společnost Jana Marka Marci
Přírodovědecká fakulta Masarykovy univerzity
1
Analytické vlastnosti ICP-OES
• Stanovení 73 prvků včetně P, S, Cl, Br, I
• Simultánní a rychlé sekvenční stanovení
• Vysoká selektivita (rozlišení spektrometru)
• Nízké meze detekce (0.1-10 ng/ml)
• Lineární dynamický rozsah 5-6 řádů
• Minimální interference osnovy (< ± 10 % rel.)
• Přesnost (0.5 - 2 % rel.)
• Správnost ( 1 % rel.)
• Vnášení kapalných, plynných a pevných vzorků
• Běžné průtoky (ml/min) i mikrovzorky (l/min)
• Rychlost stanovení 102 - 103 /hod.
• Automatizace provozu
2
Pracovní parametry zdroje ICP
 Frekvence generátoru f
 Příkon do plazmatu P
 Průtoky plynů F:
 vnější plazmový Fp
 střední plazmový Fa
 nosný aerosolu Fc
 Průtok roztoku vzorku v
 Výška pozorování h
 Integrační doba ti
3
Vliv výšky pozorování a průtoku nosného plynu na
emisi „tvrdé“ čáry a molekulového pásu
4
Vliv průtoku nosného plynu a výšky pozorování na emisi
čáry a pozadí a jejich poměr
0.4 0.8 1.2
Fc (L/min)
Intenzita emise
čáry
Intenzita emise pozadí
Poměr signál/pozadí (S/B)
5 10 15 20
Výška pozorování (mm)
Intenzita emise čáry
Intenzita emise pozadí
S/B
5
Vliv příkonu a výšky pozorování na emisi atomové a
iontové čáry
10 20 30
Výška pozorování (mm)
Ca II 393.4 nm
P(kW)
1.0
1.3
1.5
Výška pozorování (mm)
P(kW)
1.0
1.3
1.5
10 20 30
Ca I 422.7 nm
6
Závislost relativní
směrodatné odchylky
sr celkové intenzity
emise IL+B čáry Nd II
430,358 nm na
koncentraci Nd pro
různé délky
integračních časů
Integrační doba
1 ~1 s
2 ~ 3 s
3 ~ 5 s
4 ~10 s
5 ~15 s
6 ~ 20 s
7 ~ 30 s
Vliv integrační doby na RSD emise
7
Analytické parametry
Mez detekce
 Mez detekce je důležitý parametr, který umožňuje
charakterizaci metody a srovnání různých analytických
technik.
 Mez detekce je definována jako nejmenší možná
koncentrace cL , kterou lze s předem stanovenou
pravděpodobností odlišit od náhodných fluktuací pozadí.
 Ve spektroskopii neměříme přímo koncentraci, ale signál.
Vztah mezi signálem a koncentrací je určen kalibrací.
 Za předpokladu, že fluktuace pozadí mají Gaussovské
rozdělení, je šum vyjádřen jako standardní odchylka
rozdělení σ.
8
Analytické parametry
Mez detekce
Mezi detekce odpovídá nejmenší hrubý signál XL, který lze
statisticky odlišit od spektrálního pozadí
XL = B + ksB
kde B je průměrná hodnota měření pozadí, sB je odhad
standardní odchylky měření pozadí B a k je konstanta
závislá na hladině spolehlivosti. IUPAC doporučuje k = 3
Čistý signál SL odpovídající mezi detekce cL je vyjádřen jako:
SL = XL - B = ksB
Hrubý signál je lineárně vázán na koncentraci c
9
X = b0 + b1 . c XL = B + ksB = b0 + b1.cL cL = k.sB/b1
b1 = (X-B)/c = S/c cL = k sB. c /S cL = k.c.RSDb/SBR
Analytické parametry
10
X
c
Nulová linie
Pozadí
Spektrální
čára
BEC = 1/(S/B)
cL = 3RSDB  BEC
IL S = IL/cA
Koncentrace ekvivalentní pozadí a mez detekce
RSDL
Δλ
RSDB
B (= IB)
11
Optimalizační kritéria
 Signál S při jednotkové koncentrací = citlivost
 Poměr signálu k pozadí S/B, SBR
 Poměr signálu k šumu S/N, SNR
 Relativní standardní odchylka pozadí RSDB
 Přesnost (opakovatelnost) RSDS= (S/N)-1
 Mez detekce cL
SBR
RSD
S
B
B
s
B
B
S
s
c B
BB
L
1
33
3

B
s
RSD B
B 
SBRS
B 1

12
Závislost standardní odchylky celkové intenzity čáry a pozadí
sL+B a relativní (sL+B)r na koncentraci analytu.
cB = koncentrace ekvivalentní pozadí
sL+B =stand. odchylka
sL+B = rel. stand.
odchylka
sL,r= 0,38%
sB.r= 0,60%
Obr.39
13
Závislost směrodatné sL+B a relativní směrodatné
odchylky (sL+B)r intenzity celkové emise čáry a
pozadí IL+B na koncentraci
14
IL+B = IL + IB
sL+B
2 = sL
2 + sB
2
IN = IL+B - IB
sN
2 =sL+B
2 + sB
2=
sL
2 + 2sB
2
Závislost standardní a
relativní standardní
odchylky čisté intenzity
emise čáry IL a
korigovaní intenzity
emise čáry IN na
koncentraci
15
Závislost standardní a relativní standardní odchylky čisté
intenzity emise čáry IL a korigovaní intenzity emise čáry IN na
koncentraci
16
Analytické parametry
Vliv rozlišení na mez detekce
Efektivní šířka spektrální čáry ovlivňuje:
Intenzitu emise čáry
Intenzitu spojitého záření pozadí
SBR RSDb
 Efektivní šířka čáry Dleff zahrnuje příspěvek fyzikální šířky,
DlL a instrumentální šířky čáry Δλins
 Poměr signál/pozadí je nepřímo úměrný efektivní šířce
spektrální čáry Δλeff, poněvadž intenzita emise čáry roste
lineárně s šířkou štěrbiny, kdežto intenzita emise pozadí
vzrůstá s druhou mocninou šířky štěrbiny.
Dleff = ( DlL
2 + Dlins
2)1/2
17
• Přes veškeré pozitivní vlastnosti, kterými se budicí zdroj ICP
odlišuje od řady dalších, v něm existují nespektrální
interference (interference osnovy vzorku) Nespektrální
interference se často vyjadřuje jako poměr
• kde IL je čistá, tj. na pozadí korigovaná intenzita čáry analytu
naměřená s čistým roztokem a IL
M je čistá intenzita naměřená
za přítomnosti interferentu o určité koncentraci. Běžné je také
vyjádření rozdílu (zvýšení, snížení) v %:
Nespektrální interference
L
M
L
I
I
X 
1001 






L
M
L
I
I
X
18
Nespektrální interference
• Podle místa vzniku:
– Zmlžovací systém,
– Plazmová hlavice.
• Podle interferentu:
– Snadno ionizovatelné prvky
– Kyseliny, rozpouštědla
• Podle mechanismu:
– Excitační
– Ionizační
– Zmlžovací a transportní (povrch. napětí, viskozita,
hustota, elektrostatický náboj, změna rozdělení obsahu
látek v závislosti na velikosti částic, frakcionace)
19
Nespektrální interference
Axiální rozdělení nespektrální
interference – vliv průtoku
nosného plynu
Axiální rozdělení nespektrální
interference (matrix efektu) X na
čáře Nd II 430,358 nm
v přítomnosti 0,1 mol/l NaNO3
v závislosti na průtoku nosného
plynu Fc; křivka č. – Fc (l/min): 1 -
0,79; 2 –0,92; 3 – 1,06; 4 – 1,19; 5
– 1,32; 6 – 1,45; 7 – 1,58; 8 – 1,72;
9 – 1,85; P = 1,1 kW, průtoky plynů
(l/min Ar) Fc = 1,06; Fa = 0,43; Fp
=18,3; 16 mg/l Nd v 1,4 mol/l HNO3
20
Nespektrální interference
Radiální rozdělení nespektrální
interference
Laterální rozdělení
nespektrální interference
(matrix efektu) X na čarách Y
II 371,030 nm (1) a Y I
410,238 nm (2); Polohy
maxim laterálních rozdělení
emise čar Y II – a, Y I – b
(rozdělení zde nejsou
uvedena); P = 1,1 kW; Fc =
1,06; Fa = 0,43; Fp =18,3; 0,1
mol/l NaNO3 v 1,4 mol/l
HNO3
21
Nespektrální interference
1
2
3
4
102 103 104
Na (mg/L)
1,3
X
1,1
1,0
0,9
0,8
Axiální rozdělení
nespektrální interference
(matrix efektu) X na čáře
Nd II 430,358 nm v16
mg/l Nd v 1,4 mol/l
HNO3 závislosti na
koncentraci Na (100 –
10000 mg/l Na) pro různé
výšky pozorování; křivka
č. – h (mm): 1 – 8; 2 – 16;
3 – 20; 4 – 24; P = 1,1
kW; Fc = 1,06; Fa = 0,43;
Fp =18,3; ; měřítko na
obou osách je
logaritmické
22
Nespektrální interference
• Závislost nespektrální interference
(matrix efektu) X na koncentraci
kyseliny chlorovodíkové pro Nd II
430,358 nm; 16 mg/l Nd;
podmínky: křivka č. 1: h = 16 mm,
Fc = 1,06 l/min, křivka č. 2: h = 20
mm, Fc = 1,45 l/min; P = 1,1 kW;
Fa = 0,43 a Fp =18,3 l/min Ar
23
RSD: dlouhodobá opakovatelnost, reálné
vzorky silikátů
24
RSD: dlouhodobá opakovatelnost, reálné
vzorky silikátů, drift přístroje, diagnostika
25
Přesnost a správnost
• Podmínky měření
– Maximální citlivost (směrnice kalibrační
přímky)
– Maximální poměr signál/šum
– Minimální matriční efekt
• Vlivné parametry
– Průtok nosného plynu
– Příkon do plazmatu
– Výška pozorování
26
Přesnost a správnost
• Hlavní složka vzorku (SiO2 , Fe)
– Normalizace – korekce na sumu (100 %)
– Celkový rozptyl součtu všech výsledků
(σc)2 = součet rozptylů jednotlivých výsledků
– rozdíl součtu výsledků od 100 % lze brát
jako statisticky významný na dané hladině
významnosti jen tehdy, leží-li vně intervalu
3
100
3
100
1 A
c
m
j
j
A
c
n
x
n

 
27
Přesnost a správnost
• Použití porovnávacího prvku:
– zlepšení přesnosti měření (kompenzace
šumu vyšších frekvencí)
– zlepšení správnosti měření (kompenzace
driftu (nízkofrekvenčního šumu)
– zlepšení správnosti měření kompenzací
vlivu matrice (nespektrální interference)
28
Přesnost a správnost
• Podmínky správné funkce porovnávacího prvku
1. signály analytu a porovnávacího prvku musí
korelovat v závislosti na malé změně pracovních
podmínek ICP zdroje (simulace driftu), přičemž
korelační koeficient musí být blízký jedničce;
2. poměr relativních směrodatných odchylek b=σP,r/σA,r
signálů IP a IA porovnávacího prvku a analytu musí
být blízký jedničce;
3. pokud není hodnota pozadí zanedbatelná vzhledem k
signálům IP a IA, je nutno provést před výpočtem
poměru IA /IP korekci pozadí;
4. šum detekčního systému musí být zanedbatelnývůči
šumu zdroje ICP. Zlepšení RP dosažené použitím
porovnávacího prvku je definováno vztahem
29
Přesnost a správnost
),/(
,
rPA
rA
PR



kde σA,r a σ(A/P),r jsou relativní směrodatná odchylka
signálu analytu IA a relativní směrodatná odchylka podílu
I(A/P)= IA/IP. Je-li splněna podmínka 1) a současně
b=σP,r/σA,r ≠ 1 , lze vypočítat RP podle vztahu
1

b
b
RP
30
Přesnost a správnost
Pro platnost podmínky 2) a r <1 je zlepšení přesnosti
dáno vztahem
)1(2
1
r
RP


31
Přesnost a správnost
Porovnávací prvek musí splňovat následující podmínky:
a) přirozený obsah porovnávacího prvku ve vzorcích musí
být nižší než jeho mez detekce metody ICP-AES;
b) preparát porovnávacího prvku musí být dostatečně čistý,
aby jeho přídavek nezvyšoval slepý pokus pro analyty;
c) spektrum porovnávacího prvku nesmí obsahovat příliš
mnoho spektrálních čar, aby nedocházelo ke
spektrálnímu rušení čar analytů;
d) porovnávací čára prvku musí být přiměřeně citlivá, aby
koncentrace vnitřního standardu mohla být co nejnižší;
e) porovnávací prvek musí být v roztoku stálý, tj. nesmí
těkat, tvořit nerozpustné hydrolytické produkty nebo tvořit
sraženiny s ionty analytů či se složkami osnovy vzorku.32
Analytické spektrální čáry, korekce
interferencí
Výběr analytických čar pro stanovení v konkrétní
osnově vzorku se provádí
i) s ohledem na obsah stanovované složky;
ii) s uvážením možných spektrálních interferencí.
Spektrální interference lze klasifikovat takto:
i) přímá koincidence spektrálních čar nerozlišitelná ve
spektrálním přístroji;
ii) překryv čar závislý na propouštěném spektrálním
intervalu spektrometru;
iii) překryv křídlem rozšířené čáry;
iv) interference vyvolaná strukturním pozadím;
v) rozptýlené záření.
Většina prvků má alespoň jednu citlivou analytickou čáru,
která není spektrálně rušena.
33
Korekce spektrálních interferencí
• Korekce spektrální interference je obvykle kombinací
korekce pozadí a korekce překryvu čarou. Při korekci
pomocí korekčních faktorů se od nekorigované
koncentrace j-tého analytu cxj vypočtené z kalibrační
přímky odečítá zdánlivá koncentrace analytu vyjádřená
jako součin korekčního faktoru aij a koncentrace ci i-tého
rušícího prvku, stanovené na jeho analytické čáře. Pro n
interferentů se vypočte korigovaná koncentrace j-tého
analytu cj podle vztahu
1


n
i
ijixjj accc
34
Vývoj metody
1. Na základě známého složení typu vzorku se zvolí
vhodné spektrální čáry. Kritériem jsou požadované
meze detekce, citlivost čar a případné spektrální
interference.
2. Pro očekávané koncentrace a koncentrační poměry
jednotlivých složek se měřením jednoprvkových
roztoků interferentů ověří předpokládané spektrální
interference a zvolí se body pro korekci pozadí.
35
Vývoj metody
3. Optimalizují se parametry ICP: příkon do plazmatu,
průtok nosného plynu, rychlost čerpání roztoku do
zmlžovače v případě radiálního ICP výška
pozorování, v případě axiálního ICP centrování
kanálu vůči optické ose. Optimalizace se provede s
čistými roztoky s cílem dosáhnout obvykle
maximálního poměru signál/pozadí a minimálního
poměru signál/šum. Čistým roztokem se rozumí
roztok obsahující analyt v prostředí pouze zředěné
kyseliny (k zabránění hydrolýze) a odpovídající
slepý roztok. Měření se provádí s vypnutou korekcí
pozadí, aby se neztratily informace o změnách
pozadí, měřeného on-peak při zmlžování slepého
roztoku.
36
Vývoj metody
4. Za optimalizovaných podmínek se ověří vliv kyselin
a tavidel používaných k rozkladu vzorku na
směrnice kalibračních závislostí. Změří se velikost
matriční interference (obvykle deprese signálu ve
srovnání s čistými roztoky) a závislost této
nespektrální interference na koncentraci tavidel a
kyselin v přiměřeném rozmezí. Vyhodnotí se
kompenzace matričního efektu porovnávacími prvky.
Vyvodí se závěry pro přípravu kalibračních roztoků z
hlediska obsahu tavidel a kyselin, zejména rozmezí
obsahů těchto reagencií, při nichž není pozorována
změna analytických signálů.
37
Vývoj metody
5. Jestliže byly zjištěny podle bodu 2 spektrální
interference, které nelze korigovat měřením a
odečtem pozadí, změří se hodnoty korekčních
faktorů v přítomnosti tavidel a kyselin používaných
k rozkladu. Korekční faktory takto zjištěné mají
obvykle mírně odlišné hodnoty ve srovnání s
hodnotami naměřenými s čistými roztoky. Určí se
meze detekce v přítomnosti matrice.
38
Vývoj metody
6. Řízenou změnou parametrů ICP v definovaném
malém rozmezí (průtoky, příkon, výška pozorování)
se změří trendy signálů jednotlivých analytů v úplné
matrici (včetně tavidla a kyselin) a zjistí se, zda jsou
tyto trendy kompenzovány porovnávacími prvky.
Tyto trendy lze pak předpokládat v případě driftu
přístroje.
7. Vyhodnotí se kompenzace skutečného driftu
porovnávacím prvkem v průběhu měření
modelového nebo vybraného sériového vzorku v
delším časovém úseku. Zvolí se optimální
porovnávací prvek. Odhadne se nutný časový
interval mezi provedením kalibrací (rekalibrací).
39
Vývoj metody
8. Zjistí se opakovatelnost měření a shodnost s
certifikovanými hodnotami referenčních materiálů
případně modelových vzorků, pokud nejsou
referenční materiály k dispozici.
40
Věrohodnost lineární regrese
 Lineární regresní model -metoda nejmenších
čtverců, předpoklady:
 regresní parametry mohou nabývat libovolných
(smysluplných) hodnot
 regresní model je lineární v parametrech
 matice nenáhodných (nastavovaných) hodnot
nezávislých (vysvětlujících) proměnných neobsahuje 2
sloupcové kolineární vektory
 náhodné chyby mají nulovou střední hodnotu
 náhodné chyby mají konstantní a konečný rozptyl
(homoskedasticita)
 náhodné chyby jsou vzájemně nekorelované (cov = 0)
 chyby mají normální rozdělení
41
Lineární regrese
 Celkový součet čtverců = regresní součet čtverců +
reziduální součet čtverců
 Konstrukce intervalů spolehlivosti a testování
významnosti parametrů přímky (F-test: významnost
koeficientu determinace, t-test: významnost regresních
parametrů)
 Test multikolinearity mezi sloupci matice- vysoké
hodnoty korelačních koeficientů mezi nezávisle
proměnným
 Test složených hypotéz
 Test vhodnosti (správnosti) lineárního modelu, střední
kvadratická chyba predikce, Akaikovo informační
kritérium
42
Regresní diagnostika
 Regresní triplet: data, model, metoda odhadu.
 Regresní diagnostika: identifikace
kvality dat pro navržený model
kvality modelu pro daná data
splnění základních předpokladů MNČ (7)
 Regresní diagnostika:
identifikace vlivných bodů
identifikace multikolinearity
 Regresní diagnostika:
ověření předpokladů užitých k odhadu
parametrů
statistická analýza parametrů (kritika modelu)
identifikace vlivných bodů (kritika dat)
43
Regresní diagnostika
 Exploratorní analýza dat umožňuje před vlastní regresní
analýzou identifikovat:
 nevhodnost dat (malé rozmezí, přítomnost vybočujících
bodů)
 nesprávnost navrženého modelu (skryté proměnné)
 multikolinearitu
 nenormalitu v případě, kdy jsou vysvětlující proměnné
(nezávisle proměnné) náhodné veličiny.
 Posouzení kvality dat: výskyt vlivných bodů - 3 skupiny
 hrubé chyby = vybočující pozorování
 body s vysokým vlivem (golden points) - rozšiřují
predikční schopnosti modelu, speciálně vybrané, přesně
změřené body
 zdánlivě vlivné body = důsledek nesprávně navrženého
regresního modelu 44
Regresní diagnostika
 Vlivné body:
 vybočující pozorování (outliers) - výrazná odchylka na
ose y
 extrémy (high leverage points) - liší se v hodnotách na
ose x od ostatních bodů
Nástroje:
 statistická analýza reziduí
 analýza prvků projekční matice
 grafy identifikace vlivných bodů
 Posouzení kvality navrženého regresního modelu:
Nástroje:
 parciální regresní grafy
 parciální reziduální grafy
 znaménkový test vhodnosti modelu
45
Regresní diagnostika
 Posouzení kvality navrženého regresního modelu:
Diagnostika:
 heteroskedsticity (nekonstantnosti rozptylu)
 autokorelace (časové řady, chyby jsou vzájemně
korelované)
 nenormalita chyb
Kalibrační přímka - přesnost kalibrace:
 Kritická úroveň yc - horní mez 100(1-alfa)% -ního intervalu
spolehlivosti predikce signálu z kalibračního modelu pro
koncentraci rovnou nule = slepý pokus
 Limita detekce yD - odpovídá hodnotě koncentrace, pro
kterou je dolní mez 100(1-alfa)% -ního intervalu spolehlivosti
predikce signálu z kalibračního modelu rovna yc
 Limita stanovení ys - je nejmenší hodnota signálu, pro
kterou je relativní směrodatná odchylka predikce z
kalibračního modelu dostatečně malá a rovna číslu C, např.
0,1.
46
Diagnostika spektrometru ICP-AES
QUID
47