Kapitoly z neurofyziologie smyslů Neurofyziologie Bouřlivý rozvoj: Molekulární neurovědy Neurofarmakologie Zobrazovací metody Přednostně řešené problémy: Paměť Závislosti Deprese Nobel prices related to neuroscience 1901 Wilhelm Conrad Röntgen (Germany) "in recognition of the extraordinary services he has rendered by the discovery of the remarkable rays subsequently named after him" 1904 Ivan Petrovich Pavlov (Russia) "in recognition of his work on the physiology of digestion, through which knowledge on vital aspects of the subject has been transformed and enlarged" 1906 Camillo Golgi (Italy) and Santiago Ramön y Cajal (Spain) "in recognition of their work on the structure of the nervous system" 1909 Emil Theodor Kocher (Switzerland) "for his work on the physiology, pathology and surgery of the thyroid gland" 1914 Robert Bäräny (Vienna) "for his work on the physiology and pathology of the vestibular apparatus" 1920 Chemistry: Walther Hermann Nernst (Germany) "in recognition of his work in thermochemistry" 1932 Sir Charles Scott Sherrington (Great Britain) and Edgar Douglas Adrian (Great Britain) "for their discoveries regarding the functions of neurons" 1935 Hans Spemann (Germany) "for his discovery of the organizer effect in embryonic development" 1936 Sir Henry Hallett Dale (Great Britain) and Otto Loewi (Great Britain) "for their discoveries relating to chemical transmission of nerve impulses" 1944 Joseph Erlanger (USA) Herbert Spencer Gasser (USA) "for their discoveries relating to the highly differentiated functions of single nerve fibres" 1949 Walter Rudolf Hess "for his discovery of the functional organization of the interbrain as a coordinator of the activities of the internal organs" 1949 Antonio Caetano de Abreu Freire Egas Moniz "for his discovery of the therapeutic value of leucotomy in certain psychoses" 1952 Physics: Felix Bloch (USA) and Edward Mills Purcell (USA) "for their development of new methods for nuclear magnetic precision measurements and discoveries in connection therewith" 1961 Gewg von Bekesy (USA/Hungary)"for his discoveries of the physical mechanism of stimulation within the cochlea" 1962 Francis Harry Compton Crick (Great Britain), James Dewey Watson (USA) and Maurice Hugh Frederick Wilkins (Great Britain) "for their discoveries concerning the molecular structure of nucleic acids and its significance for information transfer in living material" 1963 Sir John Carew Eccles (Australia), Alan Lloyd Hodgkin and Andrew Fielding Huxley (Great Britain) "for their discoveries concerning the ionic mechanisms involved in excitation and inhibition in the peripheral and central portions of the nerve cell membrane" 1967 Ragnar Granit (Sweden/Finland), Haldan Keffer Hartline (USA) and George Wald (USA) "for their discoveries concerning the primary physiological and chemical visual processes in the eye" Robert W. Holley (USA), Har Gobind Khorana (USA) and Marshall W. Nirenberg (USA) "for their interpretation of the genetic code and its function in proteiiHynthesis 1970 Sir Bernard Katz (Great Britain), Ulf von Euler (Sweden) and Julius Axelrod (USA) "for their discoveries concerning the humoral transmittors in the nerve terminals and the mechanism for their storage, release and inactivation" 1972 Physics: John Bardeen (USA), Leon Neil Cooper (USA) and John Robert Schrieffer (USA)"for their jointly developed theory of superconductivity, usually called the BCS-theory" [Professor Cooper was Director of Brown University's Center for Neural Science.] 1973 Karl von Frisch (Germany), Konrad Lorenz (Austria) and Nikolaas Tinbergen (Great Britain) "for their discoveries concerning organization and elicitation of individual and social behaviour patterns" 1973 Physics: Brian David Josephson (Great Britain) "for his theoretical predictions of theproperties of a supercurrent through a barrier, in particular those phenomena which are generally known as the Josephson effects" 1976 Baruch S. Blumberg (USA) and D. Carleton Gajdusek (USA) "for their discoveries concerning new mechanisms for the origin and dissemination of infectious diseases" 1977 Roger Guillemin and Andrew Serially for their discoveries concerning "the peptide hormone production of the brain" 1977 Rosalyn Yalow for "the development of radioimmunoassays of peptid 1979 Allan M Cormack and Godfrey Newbold Hounsfield for the "development of computer assisted tomography" 1981 Roger W. Sperry, for his discoveries concerning "the functional specialization of the cerebral hemispheres" 1981 David H. Hubel and Torsten N. Wiesel, for their discoveries concerning "visual system". 1986 Stanley Cohen (USA) Rita Levi-Montalcini (Italy/USA)"for their discoveries of growth factors" 1991 Erwin Neher (Germany) Bert Sakmann (Germany) "for their discoveries concerning the function of single ion channels in cells" 1991 Chemistry: Richard R. Ernst (Switzerland) "for his contributions to the development of the methodology of high resolution nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy" 1994 QAlfreU G. Gilman (USA) Martin Rodbell (USA) "for their discovery of G-proteins and the role of these proteins in signal transduction in cells" 1997 Stanley B. Prusiner, in Physiology or Medicine for his discovery of "prions - a new biological principle of infection" 1997 Chemistry: Paul D. Boyer (USA) and John E. Walker (Great Britain) "for their elucidation of the enzymatic mechanism underlying the synthesis of adenosine triphosphate (ATP)" 1997 Jens C. Skou (Denmark) "for the first discovery of an ion-transporting enzyme, Na+, K+-ATPase" 1998 Robert F. Furchgott (USA)Louis J. Ignarro (USA) and Ferid Murad (USA) "for their discoveries concerning nitric oxide as a signalling molecule in the cardiovascular system" 2000Arvid Carlsson, Paul Greengard and Eric Kandel for their discoveries concerning "signal transduction in the nervous system 2003 Paul C. Lauterbur Sir Peter Mansfield for their discoveries concerning maroic resonance imaging 2004 RicmbtfsAxel, Linda Buck for their discoveries of odorant receptors and the organization of the olfactory system Neurofyziologie Studium nervových a doprovodných buněk, způsobu jak jsou sestaveny do funkčních celků, které vedou, zpracovávají, ukládají informaci a zprostředkují chování. Smyslová neurofyziologie Vrátka do vědomí, kontakt s vnějším světem. Obecné molekulární principy signalizace. Internet a něco z jeho neomezené nabídky: http ://www .DhvsDharm. fmd.uwo. ca/undersrad/medsweb/ httD:// entochem.tamu.edu/index.html httD: //web .neurobio. arizona.edu/ gronenber g/nrsc5 81 / index.html httD://www.biol.sc.edu/~vo2t/courses/neuro/neurobehavior.html httD://instruct 1. cit. Cornell. edu/courses/bionb424/links .htm httD://nelson.beckman.uiuc.edu/courses/neuroethol/ stíttD: //Www. blackwellDublishins.com/matthews/default. html httD://www.hhmi.or2/biointeractive/vlabs/neuroDhvsiolosv/index.html http://www.hhmi.orq/biointeractive/click/index.html Kapitoly z neurofyziologie smyslů - výběr kapitol Fyziologie membrán: - klidový potenciál - akční potenciál - iontové kanály - šíření signálů a synapse Fyziologie smyslů: - obecné principy - čich a chuť - hmat a sluch - zrak a další smysly Psychofyziologie: - zpracování zrakové informace - učení a paměť - chování, neuroetologie Figure 11.2 Glial cells There ; and unmyelinated) in the perif tracytes are metabolic supporl cytes related to cells of the imr Materiály, prezentace. Fyziologie nervových membrán: řeč elektrických potenciálů Stimulus Input 1 Sensory signals Integration Conduction Output {transmitter release) Action potential Action Action potential I potential / v Graded receptor potential I Receptor potential -A2Ľ J u poter pi I Rece Input Graded synaptic potential A 2 Motor signals Integration Conduction Output (transmitter release! Action Action ■/potential I potential Receptor y potential I J. J Action potential Input Graded synaptic potential 3 Muscle signals Integration Conduction Output (behavior} Action Action potential ^potential Receptor potentia Předávání a zpracování informací: elektro - chemická spolupráce Klidový potenciál Gibbs-Donnanova rovnováha lont Koncentrace Gradient Intra/Extra Rovnovážný potenciál Intracelulární Extracelulární Na+ 12 mmol/l 145 mmol/l 1:12 +67 mV K+ 155 mmol/l 4 mmol/l 39:1 -98 mV Cl" 4 mmol/l 123 mmol/l 1:31 -90 mV volný Caz+ 10~4 mmol/l 1,5 mmol/l 1:15.000 +129 mV fixní anionty 155 mmol/l Tab. 2.2. Tabulka rozložení iontových koncentrací na buněčné membráně kosterního svalu savce. A. Príčiny a důsledky klidového potenciálu membrány 1 pasivní rozložení iontů 2 aktivní Na'-K1-pumpa Ěcr iCT ECT > Kíl L a K+ a ^2 bílkoviny fosfáty" cli cr ICT 3 difúzni potenciál K1 ICT bílkoviny" fosfáty Na* aktivní transport prostřednictvím ATPá^y bílkoviny" fosfáty' K+ chemický gradient K+vzrůstá T difúze K+ z ICT do ECT T vznik potenciálu 4 potenciál žene Cl z ICT do ECT l ° 1 ECT 5 konečný stav: klidový membránový potenciál ECT ° ,f bílkoviny" fosfáty" pasivně cr INTRA EXTRA Rovnovážný potenciál - pro daný iont Nernstova r. RT [ion]e Elon = -- In zF [i on] i [ion]e E. = 61mVloe--------- ion & [ion]i Goldman-Hodgkin-Katz r. RT PK[K+]e + PNa[Na+]e + PCl[Cľ]i Er = - ln--------------------------------- F PK[K+]i + PNa[Na+]i + PCl[Cľ]e A~ P ADP^-P Intracelulámi prostor '4mV 155rnV 'Membrána Extracelulámí prostor Obr. 2.9. Rozdílné membránové podmínky pro Na+ a K\ Na/K pumpa stále udržuje na membráne gradient Ma+ i K *. Zatímco K+ véak může membránou volné procházet, pro Na* jetérnér nepropustná. Na* je čerpáno Hdo strmého kopce" - proti velké elektrochemické síle. Gradient Intra/Extra Rovnovážný potenciál 1:12 +67 mV 39:1 -98 mV Hnací síla = Driving Force -90mV - (Rovnovážný potenciál) lont Koncentrace Gradient Intra/Extra Rovnovážný potenciál Intracelulární Extracelulární Na+ 12 mmol/l 145 mmol/l 1:12 +67 mV K+ 155 mmol/l 4 mmol/l 39:1 -98 mV er 4 mmol/l 123 mmol/l 1:31 -90 mV volný Caz+ 10~4 mmol/l 1,5 mmol/l 1:15.000 +129 mV fixní anionty 155 mmol/l Tab. 2.2. Tabulka rozložení iontových koncentrací na buněčné membráně kosterního svalu savce. Na/K ATP-áza nabíjí membránu Jen 6 kationtů vně navíc na pozadí 440.000 iontů ostatních je schopno nabít membránu. Stačí tedy přemístit jen nepatrná množství a potenciál se výrazně změní. + - + — + -+ + — + — + - + - + - + — + — + - + - + - + - + - + - + -+ - + - + - + _+_ + - + - + - + - + - + -++- + - + - + - + - + - + - + - + -+ - + - + - + - + - + - + - - + - + - + -+ - + - + - + - + - + - + -+ - + - + - + -+- + - + -+ - + - + - + -++- + -+ - + - + - + - + - + - + -+ - + - + - + - + - + - + - exact balance of charges on each side of the membrane; membrane potential = 0 Figure 11 -22 Molecular Biology of the Cell 5/e Garland Science 20081 + - + - + - + - + — + — + + + — + - + - + - + - + -+ + + - + — + - + -+- + -+ + + - + - + - + - + - + -+ + + - + - + - + - + - + -+ + + - + - + - + - + - + -+ + + - + - + - - + - + - + + - + - + - - + - + - + + - + - + - - + - + - + + - + - + --++- + + - + - + - - + - + - + + - + - + - - + - + - + a few of the positive ions (red) cross the membrane from right to left, leaving their negative counterions (red) behind; this sets up a nonzero membrane potential lonty odpovědné za vznik membránového potenciálu leží v tenké vrstvě u membrány. Počet kationtů, který je schopen přechodem membrány změnit napětí o 100mV je pouze 1/100.000 celkového počtu kationtů v cytosolu. Stačí tedy malá a rychlá změna k AP. Jeden AP koncentrace nezmění. Klidový potenciál Uložená energie pro řadu membránových „strojů" (spřažený transport) signálů (Ca signály, fertilizace vajíčka). V neuronech na generování, zpracování a šíření elektrických signálů: Akční potenciál - vhodný pro dálkový, nezkreslený a rychlý přenos signálů Místní potenciál - vhodný pro zpracování, syntézu, modifikaci informací Akční potenciál Horní záznam odpovídá průběhu "nervového akčního proudu", tak jak Jej Bernstem naměřil r, 1663 a publikoval r. 1871. Na spodnim záznamu, který Bernstein publikoval v Elektrobíologii r. 1913, chybí překmlt "akčního proudu" do kladných hodnot (průběhy jsou zaznamenány s opačnou polaritou, než na jakou jsme dnes zvyklí}. 50. léta Fine Glass ^ Thread Micro-pipette Drop of Electrolyte Solution u 1 /i.m Cathode Ray Oscilloscope (CRO) Micro-pipette Tip Electrometer (Input from Electrode) Ground Electrode Squid Axon Fig. 4.4 The micropipette is used for electrical recording (extracellular, intracellular, patch), electrical stimulation (current or voltage clamp), or delivery of substances (microionophoresis or pressure ejection). Preparation of an intracellular recording micropipette is shown on the left. The diagram on the right shows the arrangement for recording from a squid axon and observing potentials on a cathode ray oscilloscope (CRO). 1. Action potentials are recorded with an intracellular electrode The squid giant axon is about 0.5-1 mm in diameter and several centimeters long. An electrode in the form of a glass capillary tube containing a conducting solution can be thrust down the axis of the axon so that its tip lies deep in the cytoplasm. With its help, one can measure the voltage difference between the inside and the outside of the axon —that is, the membrane potential —as an action potential sweeps past the electrode. The action potential is triggered by a brief electrical stimulus to one end of the axon. It does not matter which end, because the excitation can travel in either direction; and it does not matter how big the stimulus is, as long as it exceeds a certain threshold: the action potential is all or none plasma intracellular mém hran e filed rods action potential I I_I 1 mm Jak se dnes měří a jak vypadá? http://wvvw.hhrni.ora/biointeractive/vlabs/neu roDhvsioloav/i ndex.html Informace, kterou přenáší, je zapsána do frekvence. Buď nevznikne vůbec, nebo vzniká stále stejně velký. Iontová hypotéza Vzniku AP The Nobel Prize in Physiology or Medicine 1963 "for their discoveries concerning the ionic mechanisms involved in excitation and inhibition in the peripheral and central portions of the nerve cell membrane" Sir John Carew Eccles 1/3 of the prize Australia Australian National University Canberra, kus#9ik d. 1997 Alan Lloyd Hodgkin 1/3 of the prize United Kingdom University of Cambridge Cambridge, United kin^Mn d. 1998 Andrew Fielding Huxley 1/3 of the prize United Kingdom London University London, United kin1$lWn Voltage clamp Hodkgkin & Huxley napěťový zámek, 1963. Dodávaný proud kompenzuje iontové toky tak, aby napětí zůstalo konstantní. Proud je registrován. ( ) Axon Current Amplifier Record Membrane ( Current B In ^Na "ľ" I Out Feedback Amplifier Voltage Amplifier C In 9 |gNaí KkJ fflJ im = ína + 'k o Out L = gN\ transport, signalizaci (Ca) i— A. Homeostasis of Volume and Electrolytes in the Cell 'lí NaVK'-ATPase ATP Amino acids, glucose, sic, cr e ® * C. Regulation of Cell Proliferation, Motility and Differentiation Ions Cell membrane 1 Cas* IT Na1 Metabolism yl r*l r*\ i, In narva and muscEe cells: Na* Griannela 10 / Mi 3Na+ Na* Amino acids, glucose, etc, Extracellular matrix Ions. Messenger ^ substances and other signals > Cytoskeleton > Genome ^^^Cell nucleus^^ Synthesis of growth factors Differentiation Form Migration Biosynthesis Adhesion Proliferation K' -► CI -► Kanály - prostředek udržování integrity buňky a komunikace Buněčnými receptory buňky „vidí" své okolí. h NS „vidí" jen to, co zasáhne funkci kanálů. I Nevrátkované - určují klidový potenciál L Vrátkované - přijímají signály a řídí místní i akční I potenciály - příjem a zpracování informace NS ' Vrátkované kanály nejsou jen na nervových buňkách Leukocyty, stejně jako rakovinové buňky mají napěťově vrátkované kartely ^\ ^^^^^H Parametium - trepka BP^k Rostlinné buňky m tnuv ŕí.'.n Kanály - typy vrátkování Li Band ^ Přenášená látka O o o Chemicky vrátkovaný kanál Elektrochemický gradient Pi erasem látka O r —^^++ + i Elektricky vrátkovaný Kanál □epolírizovaná membrána Elektrochemický gradient ° O Mechanicky vrátkovaný kaná membránový potenciáí interstícium cytosol y a čety k tt£ (nikotin acetykholin ergní) vnéjsMigandy Ct" y p h protažení bunečné membrány 4 intracelulární metaboJity intracelulární signální látky Liqandem řízené: lonotropní transdukce - receptor přímo na kanálu Ligand se váže extracelulárně (transmitter-gated) membránový potenciál m TABLE 12.3 lonotropic and metabotropic receptors: Structural, functional, and mechanistic differences Characteristic lonotropic receptors Receptor molecule Molecular structure Molecular action Second messenger Gating of ion channels Type of synaptic effect Ligand-gated channel receptor Five subunits around an ion channel Open ion channel No Direct Fast EPSP or IPSP protažení buneč né membrány Metabotropic receptors G protein-coupled receptor Protein with seven transmembrane segments; no channel Activate G protein; metabolic cascade Yes (usually) Indirect (or none] Slow PSPs; modulatory changes (in channel properties, cell metabo lism, or gene expression) Intracelulárně • Ion gated • Nucleotide gated • Fosforylací řízený acetylcholin (nikotinergrtí) vnější ligandy TABLE 12.3 lonotropic and metabotropic receptors: Structural, functional, and mechanistic differences Characteristic lonotropic receptors Metabotropic receptors Receptor molecule Molecular structure Molecular action Second messenger Gating of ion channels Type of synaptic effect Ligand-gated channel receptor Five subunits around an ion channel Open ion channel No Direct Fast EPSP or IPSP G protein-coupled receptor Protein with seven transmembrane segments; no channel Activate G protein; metabolic cascade Yes (usually) Indirect (or none) Slow PSPs; modulatory changes (in channel properties, cell metabolism, or gene expression) Metabotropni transdukce Struktura - Transmembránové proteiny Rekonstrukce podle vlastností -ID 40 20 O -na -40 AChR a aubunlt 0 IUU NU; 200 TtX) Amlru->.i<.iď. 4IN) CLXJH Clone aiid sequence -Induce a m ino acid seifLiericc- 1 he gene Amino acids ft ITydmphylii- 9 Polar/iiiriLyblv O Hydrophobic # Clycosyl,i tion ^tc Analvzíí .l.i UFťjuencí* far. / \ \ i.ofig si neiťbes of Regions rich in hyrliifiphylic Clycosybiicwi site* hydrophobic ,u s and in charged aa's Mtimbmne-spiiririnK Intracellular arid ĽxtracellĽEar peptides n-fieiicai ponlons estraccllidarpepi ide portions containing sugars ÉP I \ Figure 1,10 Analysis of hydropathy and the folding of membrane proteins The amino add sequence of a membra ne pmkrin can ustrd in maku inference* about protean structure, a» described in the text. X ray krystalografie - prostorový vzhled proteinů tvořících kanály a) Secondary structure (linear presentation) Extracellular fluid In this hypothesized secondary structure of the entire protein molecule, each cylinder represents an cc-helix (see Box 2.1). Cell membrane Hydrophilic amino acid string Hydrophobic a-helix -v- Domain I -Y- Domain II Domain 111 Cytoplasm Cill L»»JliyiJ.i cut giuupo omojo jjiKjj^*,^ jljk^^m ... face, not the inner, cytoplasmic face (see Figure| hydrate groups are thought to serve as attachi cellular proteins and as cell recognition sites. 1 The word fragment glyco refers to carbohydrates (after the I Figure 2.4 The structure of a transmembrane pre gated Na+ channel—illustrating several modes of Domain IV This molecule consists of four domains, each of which includes six o>helices. (b) Simplified three-dintentional structure enclosed in a sketch of the envelope of the molecule Extracellular fluid (c) Stylized version of chemical structure showing subunits (d) Semi realistic symbol (e) Schematic symbol (f) Stylized version of chemical structure showing associated protein molecules Cell' membrane Cytoplasm For different purposes, the protein can be represented in a variety of ways. A protein of this sort may be associated in the membrane with other transmembrane protetns| (e.g., p) or peripheral proteins (e.g., y). Topology of voltage-gated N a"1' channels 4 domény, 6 segmentů in Na kanál • Citlivý na napětí • Selektivní • Schopný inaktivace Citlivý na napětí Fig. 5.3 Presumed tertiary structure of the Na + channel protein based on hydropathicity plots of the primary amino acid sequence. A. The channel protein consists of four repeating subunits, each containing six presumed transmembrane segments. Segment 4 contains an excess of positively charged residues and is assumed to be the voltage sensor. A long loop between segments 5 and 6 is believed to dip into the membrane and form the face of the pore. A cytoplasmic loop contains the inactivation gate. B. View looking down on the membrane to see the arrangement of the four subunits around the central pore. The Ca2+ channel protein is similar in its construction. (Modified from Catterall, 1988, and Stevens, 1991, in Kandel et al., 1991) 'nj Topology of voltage-gated Na1' channels Extracellular Quid Cytoplasm \(b) Surface view of a Na"1" channel COOH (c) Vol tage-dependent conformational change Voltage sensor Gate closed Gate open Na" Obr. 13 Kluzně šroubový model napěťově závislého vrátkování podle Catteralla. Segment S Je zřejmě senzor napětí. Segment S4 domény III sodíkového kanálu elektrického orgánu parejnoka Torpédo je znázorněn jako transmembránová ot šroubovice s řadou pozitivních nábojů, tvořených opakujícími se zbytky "zásadité" aminokyseliny argininu. Každý pozitivní náboj je neutralizován negativním nábojem sousedních transmembránových šroubovic (každá třetí v pořadí sekvence). Vytváří se spirála iontových párů prostupujících membránou. Síla membránového elektrického pole stabilizuje tvorbu iontových párů tím, že táhne pozitivní náboje dovnitř a vytlačuje negativní náboje ven podobně jako jádro v elektromagnetu. Při depolarizaci (AV) se tato síla uvolní a šroubovice tvořící segmenty S4 ve všech 4 homologních doménách se vysunou ven jako uvolněné pružiny ve směru spirály přibližně o 5 A, přičemž se otočí o 60° tak, že se kladné náboje posunou vzhledem k sousední šroubovici o jedno místo ven z buňky. Dojde tím ke snížení kladného náboje na vnitřní straně membrány. Je zajímavé (A), že velmi podobné uspořádání bazických argininových nebo lysinových kladně nabitých zbytků nacházíme v tomto předpokládaném napěťovém senzoru S4 jak u sodíkového kanálu z parejnoka či mozku potkana, tak ve vápníkovém kanálu králičího kosterního svalu a v draslíkovém kanálu mutanta Shaker octomilky Prosophila mefanogaster (viz obr. 14). (Podle Catterall 1988) Sugar residues Channel profein Voltage sens Extracellular side Narrow selectivity filter I Lipid bilayer Cytoplasmic siiie Aqueous pore i-jmuult Aiicťulia, he. j l'IlIiii Jll U iia ftp v ch qufr n nnn cut q Fig 5.8 Basic Model of a Voltage Gated Ion Channel Selektivní Fig. 5.3 Presumed tertiary structure of the Na+ channel protein based on hydropathicity plots of the primary amino acid sequence. A. The channel protein consists of four repeating subunits, each containing six presumed transmembrane segments. Segment 4 contains an excess of positively charged residues and is assumed to be the voltage sensor. A long loop between segments 5 and 6 is believed to dip into the membrane and form the face of the pore. A cytoplasmic loop contains the inactivation gate. B. View looking down on the membrane to see the arrangement of the four subunits around the central pore. The Ca2+ channel protein is similar in its construction. (Modified from Catterall, 1988, and Stevens, 1991, in Kandel et ah, 1991) Polární vodný obal zabraňuje průniku přes membránu K iont nemůže být stabilizován jako Na a tak neprojde filtrem. Eilracillulir lida Wtrr.bíane CytDplaarme f 101 Selektivita K+ kanálu Streptomyces (b) Ion selectivity filter i (r) Model of ion permeation Extraceliular fluid Within the channel, K+ ions occupy alternate sites and repel each other; movement of an ion to the innermost site of the selectivity filter displaces each ion by one site. Cell membrane Unhydrated K+ Hydrated K+ Figure 11.22 Ion permeation through K+ channels {a) The structure of a bacterial K+ channel as determined by X-ray diffraction. The subunits correspond to membrane-spanning segments 5 and 6 and the P loop of voltage-gated channels (see the figure in Box 11.1). The narrow ion-selective pore is lined by the P loop of each of the four subunits (yellow; only two of the four are visible here), and it has four sites that can be occupied by K+ ions (green spheres). An additional K"1 ion can occupy an inner cavity below the selectivity filter, (b) Sites occupied by K+ ions in and near the selectivity filter. IC ions are normally surrounded by polar water molecules, but in the pore of a potassium channel, oxygen atoms lining the pore compete with water molecules to attract the cation. The image shows a K"1 ion in the inner chamber with eight water molecules around it (bottom), four unhydrated K+ ions at the selectivity filter sites, a K~ ion at the outer face of the pore, and a K+ ion with a partial shell of four water molecules (top), (c) A model of Ky ion permeation. This chain reaction allows the channel to be both highly selective and highly permeable to K+. (a from Morais-Cabra! et ai. 2001; b from Zhou et al. 2001; carter Miller 2001.) An ion enters the channel from the inner end... Cytoplasm ...displacing another ion at the cavity site in the inner chamber, with short axons or no axons, so a graded potential change at or of the cell can spread passively (electro tonic ally) to the termina out major decrement. The inputs and outputs of spiking and nonspikingneurons, same, but the short-axon nonspiking neuron does not require! encoding to carry the signal over large distances. Examples of nor ing neurons include the photoreceptors, bipolar cells, and hor cells of the vertebrate retina (see Chapter 13), granule cells of the i toiy bulb, and many arthropod interneurons. Negativně nabité AK lákají kationty. Z cytosolu se pór otevírá do vestibulu. To umožňuje K iontům zůstat hydratované i v polovině membrány. V úzkém selektivním filtru řada O tvoří řadu dočasných vazebných míst pro dehydrovaný K. K musí ztratit svůj vodní obal a místo s vodou interaguje s O. H H \ / H i H (A) tónin \ „+ .... , O...... K ..... vestibule / H I H A. H V (B) íon in selectivíty =C o filter 1 Hgure 1t-24 Moletolar Ďiology ol the Cíli 5/e [o Garland Science 2008) H = V A rt O .....■ Na .....O H I H A. ií v o o Menší sodík nevstupuje, protože karbonylové kyslíku jsou příliš daleko aby kompenzovaly energetickou ztrátu odhození vodního obalu. Schopný inaktivace Fig. 5.3 Presumed tertiary structure of the Na+ channel protein based on hydropathicity plots of the primary amino acid sequence. A. The channel protein consists of four repeating subunits, each containing six presumed transmembrane segments. Segment 4 contains an excess of positively charged residues and is assumed to be the voltage sensor. A long loop between segments 5 and 6 is believed to dip into the membrane and form the face of the pore. A cytoplasmic loop contains the inactivation gate. B. View looking down on the membrane to see the arrangement of the four subunits around the central pore. The Ca2+ channel protein is similar in its construction. (Modified from Catterall, 1988, and Stevens, 1991, in Kandel et ah, 1991) Proteáza intracelulárně zrušila inaktivaci - musí být intracelulárně Také K kanál je schopen inaktivace, ale později než Na. Figurr li-31 Molrtufar Biology of thr Cell 5/r <» Gůrfand Stientr 20Q&\ STAVY KANÁLŮ r ZAVŘENY i AKTIVOVATELNÝJ dttpolarisac* f OTEVŘENÝ AKTIVOVANÝ repolarisac* ZAVŘENÝ ™ ^INAKTIVOVANÝ Refrakterní fáze kanálu - omezení frekvence AP Ne vždy je kanál pórem mezi 4mi doménami. Cl kanál je dimer, kde každá podjednotka má svůj pór. Jsou asymetrické a dohromady tvoří selektivní filtr. (A) CHLORIDE CHANNEL (B) POTASSIUM CHANNEL The Nobel Prize in Physiology or Medicine 1991 "for their discoveries concerning the function of single ion channels in cells" Patch Clamp -Technika, která „vidí" kanály při práci Erwin Neher 112 of the prize Federal Republic of Germany Max-Planck-1nstitut fur Biophjssikalische Chemie Goettingen, Federal Republic of Germany b. 1944 Bert Sakmann 1/2 of the prize Federal Republic of Germany Max-Planck-Institut für medizinische Forschung Heidelberg, Federal Republic of Germany b. 1942 Neher & Sackman Tercikovy zarnek, 1991 Whole-cell record in Strong — pulse of suction Inside-nut rer«rtlin Cytoplasm is continuous* ^villi pipetU: iiLtL'iior Outsi de-out recording Retract pipette Expose to air i=SSs Cytoplasmic domain accessible Ends of membrane anneal P0^ / Extracellular ^ä*N •A- 'ti'Lin i dt:cösible 14.12 MEMBRÁNOVÉ PROCESY V JEDNOTLIVÝCH TKÁNÍCH 66 Obr. 14.18 Proudy tekoucí Na+-kanály (vlevo) a K+-kanály (vpravo). Membránové napětí bylo po dobu 14 ms experimentálně skokem přestaveno z -80 mV na -40 mV (horní křivka), a to bylo desetkrát opakováno. Přitom byly měřeny membránové proudy (10 křivek v dolejší části obr.). Proudy proteklé jednotlivými kanály se objevují porůznu během depolarisace a trvají různě dlouho. Sumací takovýchto záznamů vzniká záznam sumačního proudu, VNa popř. Jk (zubatá křivka). Je vidět, že u Ná*~-kanálů je otevření nejpravděpodobnější krátce po změně napětí na membráně a že pák dochází k pozvolné inak-tivaci. K^-kanály se naproti tomu otevírají v průměru s jistým zpožděním, pak se však ustavuje určitá střední častost otevření, která zůstává konstantní po celou dobu depolarisace. (Z DUDELA 1990b) big current, thee time course ofthi site to each other, the Hodgkin 9 suiting from p< membrane pot In 1952, Ale-landmark papc demonstrate ai underlying the mental result o potential is cla current-measi required to se charge stored I not ionic curre a shift in accui Each IMa+channel opens with little delay following initial depolarization, and stays open for less than a millisecond before becoming inactivated. The voltage-gated KT channels open slightly later and can stay ^ open until shortly after membrane repolarization. Pravděpodobnostní děj A Lurrnnr rjinrmel Chwind ÍIJKfll Sfi^wd sccond chuiKl ctúnswl opon* dwcii Tiniu B 1 4> ^.^f^ 104) ihh NEUROBtOLOGY Roderick MacKinnon and Ion Channels Roderick MacKinnon, M.D., a visiting researcher at the U.S. Department of Energy's Brookhaven National Laboratory, is a recipient of the 2003 Nobel Prize in Chemistry 'for structural and mechanistic studies of ion channels., His research explains "how a class of proteins helps to generate nerve impulses - the electrical activity that underlies all movement, sensation, and perhaps even thought. The work leading to the prize was done primarily at the Cornell High Energy Synchrotron Source [CHESS] and the National Synchrotron Light Source [NSLS] at Brookhaven. The proteins, called ion channels, are tiny pores that stud the surface of all of our cells. These channels allow the passage of potassium, calcium, sodium, and chloride molecules called ions. Rapid-fire opening and closing of these channels releases ions, moving electrical impulses from the brain in a wave to their destination in the body."1 "Potassium channels act as both gateways and gatekeepers on cell membranes, controlling the flow of ions and enabling brains to think, muscles to move, and hearts to beat. Malfunctioning ion channels contribute to epilepsy, arrhythmia, and other diseases."2 An overhead view of a voltage-dependent potassium ion channel shows four red-tipped "paddles" that open and close in response to positive and negative charges. This structure, discovered by Rockefeller scientists, shows for the first time the molecular mechanism by which potassium ions are allowed in and out of living cells during a nerve or muscle impulse. The Nobel Prize in Chemistry 2003 "for discoveries concerning channels in cell membranes" "for the discovery of water channels" "for structural and mechanistic studies of ion channels" Peter Agre Roderick MacKinnon 1/2 of the prize 1/2 of the prize Johns Hopkins University School of Medicine Baltimore, MD, USA Rockefeller University New York, NY, USA; Howard Hughes Medical Institute b. 1949 b. 1956 Kanály a metody mol. genetiky (B) cDNA Transfect, select, and culture Figure 1,9 Common methods of gene expression for recording the electrical activity of ion channels and other membrane proteins (A) Injection into a Xenopus oocyte, which can then be studied by voltage clamping-(B) Transfection. DNA incorporated into plasmid or vival vector is introduced into the cell by electroporation, Ca2+ shock, or direct injection into the nucleus (as shown). Cell line may then b,e used for patch-clamp recording. V!tl, membrane potential; Ve; com in and potential; R, feedback resistance of patch amplifier; /,„, membrane current. After Fain (1999). Vápníková komunikace a Ca kanály r— A, Regulace buňky ionty Ca21, p o d r á žd én í č í d I a, u« ^ i rá m gap j u net i o ns, otvírá n í/za v í rá n í j i ných i o ntovýc h, kanálů m igra ce bu ně k a j. Ca v myokardu a jeho podíl na tvaru AP A Skeletal imise |e S (met I lupe !:iriy: n^. [íhníre l.ii .i Hepci|qti'p"lMiq :VH5 inwť b NEUROBIOLOGY Gary G. Matthäus Ca v myokardu a jeho podil na tvaru AP Nurniul atlHTi pMUmliuL ifcpoliirUJAJülkdue Kj •■ ■ ilüqJe ■üV-pcndenl N;r lPuiuilIk Ll'IlL N*4"-CWTipOfWIU Atii'wn iRjuifiual du 10 Kuh Vi" lI:iiir^_ 1^.....J i ,r' dtunlwlL Tmiu Ci^"1, irarnpxinenl Rapucted (imr-caiirce wtlbuurt ■ * channel" 3:k- 'Ii NEUROBIOLOGY Gary G. Matthews b NEUROBIOLOGY Gary G. Matthews i runw riBiitfiniix-- ^frl 11 a g)T - J£l i YJri C LJ Ca^+rtiannul i ľipťrMd hy JepnlariTiiľirnil c HJ m - Ol t i v □ L=d K+Channel í-nfirnciL \ry i nlť-mnl fj--1- UcrjciliiŕiíuiHW J KĽpiJaji^itlun -K.+ íIIIiia Y. ~ ľIl^jiii-: h- "f>ľii b NEUROBIOLOGY Gary G. Matthäus B. Oscilace Cai+ 1 nízká frekvence stimu názy II UUAAAAJVA. a f \ • \ i s "AAJVAA ca s 3 deaktivace enzymu 2 zvýšená frekvence liAAAAAAAA aktivita CaM-ki-názy II autoíbsro rylo vany cas cas čas narůstající autofosforylace ,^ ATP 4r [cAMP] | PKCf 4 1 lipasa C 4 kakitoriin parafolikulární C-buňka , PTH para tyreoidóín f buňka PKCT\ tcAMP] ^ ■ Jak měřit změny intracelulárního vápníku Intracelulární vápník je jakousi centrální veličinou, na které závisí téměř všechny buněčné regulační mechanizmy. Volného intracelulárního vápníku je v buňkách nepatrně, a proto stačí přidat (nebo ubrat) jen mizivé množství, aby to vyvolalo okamžité a hluboké změny v jeho koncentraci. O tom se vědělo již dávno. Problém byl však v tom, že experimentální sledování změn tak nízkých vápníkových koncentrací není zrovna jednoduché. V 80. letech vyvinul Robert Tsien fluorescentní látky, zejména fura-2 a fluo-3, které mění své optické vlastnosti v závislosti na přítomnosti i nepatrných množství vápníku. Nové látky přinesly pokrok ve dvou směrech. Zaprvé je není třeba do buněk složitě vpravovat. Před použitím se esterifikují, což jim dodá schopnost snadno prostupovat lipoidními membránami. Jakmile se takto dostanou do buňky, vrhnou se na ně intracelulární esterázy, látka je hydrolyzována a tím ztratí svoji lipofilní vlastnost. Zůstane tedy uvězněna v buňce jako v kleci. Ta druhá výhoda spočívá v tom, že jejich fluorescence je mnohonásobně vyšší, než byla fluorescence ekvorinu, takže pro úspěšný pokus stačí, aby byly v buňkách přítomny v celkem rozumných koncentracích. Prakticky probíhá sledování hladiny intracelulárního vápníku tak, že po inkubaci s některým z výše uvedených optických indikátorů jsou buňky umístěny pod speciálně upravený mikroskop, kde jsou střídavě osvětlovány dvěma vlnovými délkami. Na obě vlnové délky odpovídá indikátor fluorescencí (s maximem obvykle kolem 540 nm). Vtip je v tom, že na jednu vlnovou délku (většinou kolem 340 nm, záleží na typu fluorescenční látky) odpovídá hlavně ta část látky, která vytvořila s intracelulárním vápníkem komplex, při druhé (obvykle 380 nm) odpoví zbytek, tedy ta část, která zůstala volná. Změny hladiny vápníku poruší rovnovážný stav mezi látkou, která vytvořila s vápníkem komplex, a tou, která zůstala volná, a tím se také mění měřená fluorescence. Tato metoda dnes umožňuje sledování změn vápníku během různých experimentálních postupů. Kanály citlivé na jedy a anestetika • Eter používán jako celkové anestetikum (1846), nahrazen chloroformem, (toxicita), N20, • Lidokain, Xylokain - lokálni anestetikum, blokuje Na kanály a bráni vzniku AP Local Anesthetic Novocaine, Xylocaine Blocks voltage gated Na4 channels General Anesthetics Ether, Chloroform, Isoflurane Blocks voltage gated K4 channels Diazepam (Valium) Opens CI" channels The following are poisons that exert their effects through interference with nerve conduction. Agitoxin, Chary bdotoxin Scorpion Blocks potassium "leaky" channels Dendrotoxin Green Mamba Blocks voltage-gated potassium channels Phoneutriatoxin Banana spider Slows inactivation of voltage-gated sodium channels Batrachotoxin Poison Arrow Frog Prevents sodium channels from closing Brevetoxin Red Tide Dinoflagellate Activates sodium channels Maculotoxin Blue-Ringed Octopus Blocks sodium channels Iontové kanály a rakovinné metastázy Rakovinné buňky projevující velkou schopnost metastázovat obsahují v membránách značný počet sodíkových kanálů (Na+) řízených napětím. Jestliže jsou sodíkové kanály zapojeny přímo do metastázové kaskády, pak by po jejich blokádě měla schopnost vytvářet metastázy klesnout. Když se metastázujícím nádorovým buňkám prostaty zablokují sodíkové kanály tetrodotoxinem, pohyblivost buněk klesne a také přestanou vysílat výběžky. Druhou vlastností metastázujících buněk je, že se na své cestě k novým místům osídlení „probourávají" tkáněmi pomocí proteolytických enzymů. Vylučování enzymů i jiných látek je v buňce často spojeno s depolarizací, vyvolanou otevřením napěťově citlivých sodíkových a vápníkových kanálů. Tak se vylučují například neurotransmitery v mozku i na periferii a zřejmě i některé enzymy, které rakovinným buňkám otevírají cestu k tvorbě metastáz. A právě tetrodotoxin pomohl prokázat, že u jednoho typu prostatických nádorových buněk klesá vylučování exocytů po zablokování sodíkových kanálů. Zpomalí anestetika zhoubné bujení? František Vyskočil Publikováno: Vesmír 79, 312, 2000/6 V lidském genomu je několik tisíc genů kódujících iontové kanály. Přes 150 jich kóduje napěťově citlivé kanály.