Jitka Johnová - Alena Nekvapilová
 Akutní semistatický test
embryotoxicity a teratogenity
 Využití embryí drápatky vodní
(Xenopus Laevis)
 Test standardizovaný ASTM (American
Society for Testing and Materials) – norma
ASTM E 1439-98
 Standard Guide for Conducting the Frog
Embryo Teratogenesis Assay – Xenopus
 Tradiční modelový organismus
– známá ontogeneze
 Výhradně akvatický druh
 Možnost
indukovat rozmnožování
 Nenáročný laboratorní chov
 Přirozený výskyt v Africe,
karnivorní predátoři (hmyz, korýši, ryby)
Sexuální dimorfismus u Xenopus laevis
 Výběr vhodného páru (dospělí, min. 3 měsíce bez
páření)
 Stimulace choriogonadotropinem do hřbetního
lymfatického vaku (Pregnyl 5000)
 Umístění do pářící kádě – FETAX médium, mřížka,
termostat na 21-23 stupňů)
 Po 12 hodinách dochází ke kladení 500 – 2000
vajíček
Látka Na 1,5L (20x konc)
NaCl 18,75 g
NaKCO3 2,88 g
KCl 0,9 g
CaCl2 0,45 g
CaSO4.2H2O 1,8 g
MgSO4 2,25 g
Amplexus
Snůška vajíček
 Vybrat kvalitní, oplodněná vajíčka (kulatý tvar, černý a
bílý pól)
 Připravit koncentrační řadu testované látky, pro
každou koncentraci 3 opakování – každé opakování s
vajíčky od jiného páru
 5 hodin po oplodnění (do ukončení stádia gastruly)
přenést 25 vajíček na Petriho misku spolu s 10 ml FETAX
média (pH 7 – 7,6) a testovanou látkou
 Negativní kontrola = FETAX médium, pozitivní kontrola
teratogen 6 - aminonikotinamid
 96 hodin – do 46. vývojového stádia
embryí
 Teplota 21 stupňů, denní světlo, pH
expozičního roztoku 6,5 - 9
 Semistatický test - každých 24 hodin
výměna média a odstranění uhynulých
embryí
 Larvy se nekrmí
 Ukončení testu – fixace 3% roztokem
formaldehydu
 Pomocí binokuláru a mikroskopu se analyzuje délka
těl larev a výskyt malformací (podle Atlas of
Abnormalities – A Guide for the Performance of FETAX,
Bantle et al. 1996)
Normální embrya Úhyn ve stadiu blastuly Malformace
Standardní výstup dat:
 LC50 - koncentrace způsobující 50% úhyn embryí (případně
LC10,LC90 a jiné)
 EC50 - koncentrace způsobující malformace u 50% embryí
(případně EC10,EC90 a jiné)
 teratogenní index TI - hodnota podílu 96h LC50 a 96h EC50
 MCIG - minimální koncentrace způsobující inhibici růstu
(porovnání délky embrya (hlava-ocas) oproti kontrole)
 hodnocení vzniklých malformací (malformace vnitřních
orgánů, očí, mozku; výskyt edémů; abnormální zakřivení
páteře)
 TI = LC50/EC50
 hodnocení potenciálu látky
způsobit teratogenní poškození
 TI < 1,5 = neteratogenní látka
 3 < TI = silně teratogenní látka
 Čím vyšší TI a nižší MCIG, tím
silnější teratogen
 stanovení účinků expozice testovaných vzorků na
inhibici růstu ve srovnání s negativní kontrolou =
analýza rozptylu (ANOVA), Dunnet's test
 Hodnocení LC
a EC – statistická
probit analýza
 Akutní, semistatický
 Ekotoxicita, embryotoxicita, teratogenita
 Čisté látky, směsi, vody, výluhy, sedimenty
+ Rychlý
+ Dobře standardizovaný
+ Snadný chov
testovacího organismu
+ Levný
- Pro naše prostředí
málo relevantní druh
(alternativně
Rana pipiens, Bufo Americanus)