ISO 11348 – 3 (1998)
Stanovení inhibičního účinku vzorků
vod na světelnou emisi Vibrio fischeri
Zuzana Šalplachtová & Šárka Křepelková
o Metoda stanovení inhibice luminiscence emitované mořskými
bakteriemi Vibrio fischeri s využitím lyofilizovaných bakterií.
o Zkušebním kritériem je snížení luminiscence po expozici 15 min a 30
min, nebo volitelně po 5 min.
o Hodnotí se korekční faktor fkt, který je měřítkem změn intenzity
kontrol během doby expozice.
PRINCIP
ISO 11348 - 3
odpadní
vody
vodné
výluhy a
průsakové
vody
sladké,
slané a
brakické
vody
pórovou
voduo Metoda je použitelná pro:
o Pomocí koncentračních řad je možné
stanovit inhibiční účinek vzorku vody
jako LID (nejnižší neúčinné ředění)
nebo jako hodnoty EC20 popř. EC50.
o Odběr vzorků se provádí dle normy ISO 5667 – 16.
o Je třeba upravit pH, u vzorků slaných vod osmolaritu a zakalené vzorky
se filtrují nebo nechají usadit.
o Nerozpustné, málo rozpustné nebo těkavé látky.
o Silně zbarvené nebo zakalené vzorky.
o Vzorky znečištěné organickými látkami .
o Vzorky s vysokými koncentracemi solí.
Některé z nich mohou být kompenzovány nastavením metodiky měření.
ISO 11348 - 3
RUŠIVÉ VLIVY
VZORKY
o Ředicí řady vzorku, ředicí voda a kontrolní vzorky s roztokem NaCl
se nechají temperovat na 15 °C ± 1 °C
o K ampulím s lyofilizovanou kulturou se přidá 1 ml ochlazené
destilované vody
o Po 5 min lze ze zásobní suspenze připravit zkušební suspenze.
ISO 11348 - 3
PŘÍPRAVA ZÁSOBNÍ SUSPENZE
o Rehydratovaná suspenze luminiscenčních bakterií slouží jako
zásobní suspenze a uchovává se při teplotě 3 °C ± 3 °C
ISO 11348 - 3
PŘÍPRAVA ŘEDICÍ ŘADY
VARIANTA 1
o přímo ve zkušebních zkumavkách
o do vytemperovaných zkumavek s 500 μl média se ve stejných
časových intervalech, v jakých se bude měřit, přidá 10 μl zásobní
suspenze
o suspenze se připraví s Erlenmeyerově baňce
o k 50 objemovým dílům média se přidá 1 objemový díl zásobní
suspenze
o ve stejných časových intervalech, v jakých se bude měřit, se do
zkumavek odměří 500 μl zkušební suspenze
ISO 11348 - 3
PŘÍPRAVA ZKUŠEBNÍ SUSPENZE
VARIANTA 2
Pro každé ředění se připraví duplikáty.
Měření intenzity luminiscence zkušební
suspenze I0 v časových intervalech 20 s.
Přidání vzorku nebo kontrolního vzorku NaCl ke
zkušební suspenzi a doplnění na objem 1 ml.
Opakování ve stejných časových intervalech (20
s) s dalšími vzorky.
Intenzita luminiscence ve všech zkumavkách
(včetně kontrol) se stanoví a zaznamená po 15 a
30 min (I15, I30), nebo volitelně po 5 min.
ISO 11348 - 3
POSTUP
1. INHIBIČNÍ ÚČINEK NA LUMINISCENČNÍ BAKTERIE
o Ze změřené intenzity luminiscence vypočítáme korekční faktor fkt,
který slouží ke korekci počátečních hodnot I0 :
o Vypočítáme Ict (korigovaná hodnota I0 pro zkumavky se vzorkem):
ISO 11348 - 3
VYHODNOCENÍ
o Pro vyhodnocení závislosti účinků na koncentracích se pro každé
ředění vypočítá hodnota gama Γ:
o Inhibiční účinek vzorku se stanoví podle rovnice:
ISO 11348 - 3
o Pomocí lineární regresní analýzy
o Závislost účinku na koncentraci je popsána lineární rovnicí:
o Hodnoty EC20 a EC50 se vypočítají metodou nejmenších čtverců s
intervaly spolehlivosti:
ISO 11348 - 3
2. STANOVENÍ HODNOT ECX
o hodnota fkt pro 30 min inkubaci je v rozsahu 0,6 až 1,8
o paralelní stanovení kontrol i zkušebních vzorků se
neodchyluje od svých průměrů o více než 3%
o tři srovnávací látky způsobují při 30 min expozici inhibici
20% až 80% v daných koncentracích
ISO 11348 - 3
PLATNOST ZKOUŠKY
DĚKUJEME
ZA POZORNOST…