(©) Centrum pro výzkum toxických látek v prostředí Experimentální modely ekotoxicity pro bezobratlé živočichy Klára Hilscherová RECETOX- Přírodovědecká fakulta MU Brno evropský f^lkn |^|^ | MINISTERSTVO ŠKOLSTVÍ, OP Vzdělávání ^A^J^ď TOndVCR EVROPSKÁ UNIE MLÁDEŽE A TĚLOVÝCHOVY pro konkurenceschopnost t*OíA**' INVESTICE DO ROZVOJE VZDĚLÁVÁNÍ Inovace tohoto předmětu je spolufinancována Evropským sociálním fondem a státním rozpočtem České republiky Bezobratlí živočichové • Přítomnost a aktivita bezobratlých je naprosto rozhodující pro stav ekosystému. • Bezobratlé najdeme ve všech ekosystémech. • Bezobratlí tvoří významnou část celkové biomasy v terestrických i akvatických ekosystémech, mají nepoměrně vyšší druhovou bohatost oproti obratlovcům. • Hrají významnou roli v potravním řetězci jako destruenti, ale i konzumenti prvního a druhého řádu, s čímž je spojená možná bioakumulace. • Díky změnám habitatu při metamorfóze mohou zasahovat do více ekosystémů i během jednoho životního cyklu, díky čemuž mohou přijímat široké spektrum polutantů a přenášet je mezi jednotlivými ekosystémy. /'^r~S\ I Centrum pro výzkum fř^j) toxických látek V^t^/ v prostředí Testy ekotoxicity v půdě v Půdní testy s bezobratlými Uspořádání: umělý substrát, vlhčená petriho miska, standardní nebo přírodní půda - různé nádoby... - zpravidla 14 dní (letalita), 56 dní - reprodukce ... Organismy Krouzkovci - žížaly, háďátka, roupice Hmyz - Chvostoskoci (Collembola) chvostoskoci roupice TERESTRICKÉ PROSTŘEDÍ - konzumenti - bezobratlí Zejména pro testování biocidů VČELY testování insekticidů dávkování v potravě Moucha domácí 13 umvtnftysf Ntoratkt |o*p»lm*m of Entomology Centrum pro výzkum toxických látek v prostředí Drosophila (hodnocení genotoxicity) Testy s vodními bezobratlými Stanovení akutní či prolongované toxicity: chemických látek, výluhů z pevných matric průmyslových či komunálních odpadních vod povrchových nebo podzemních vod TaMe 1, Common and ítienlific nam« ofÍnwrttbrott& uírtf forocuit túxicity ířJrínf.1 flrťW fotím.-ind (pário* OoHnltiůn nimi ' i. r,- Strtpiocephůlh.y írúJj AttiUiA bnevicuudus Araphípůda GdtttHtarus psaudolimmutií :;i»i^.:.t,-l- '.-■.Kufiri:-' Tiťn.y ruda rujc Fairy Hh.rijr.p:; L.i,ij:':i:iiiJ:, SAdstvinifM i.-nvti.o CrajFish Gbss shrimp P!jCCúJ!U:ih AcTcntiiTuinfi. ■Í'iIiii^ vir. E|př*it1ťrii|i:H'rn Htxagenia bitituatů WiM/ílMLfl Bp. Triebíjptíf* Hyíti#f>vycf\c up. Líŕn^cpAifai ip. DipCem TSpuJj :-p. C tmu íwnu >|> : -i .- -.| f'.'jmini.w;af pÍD TTOJUÍ >1 IÍítíj: uahif FiLonefLinr, DrnpaiJlifti; r:.irv-..l:h Cti ne (Les Thí toltowbng tih iLigtiof irwi?rt*bTůtrí went Leatod: dnpb-r»KÍB-ÍLrat iiiatan criyfisli-WTly m&tir: HWnriry-Eirjit yi*r ■claafl (1-20 mmtotígl, **cand yaar claAHB0-4D mm langj; uid mldfcc—foortb iiuur. All útHwr JnrverLebmt*! wcrn rtaig-rviCíd ji mand, jjv^iuk, # mturv. Testy toxicity na vodních bezobratlích Normy testů na bezoobratlých: ČSN EN ISO, OECD, ASTM, US EPA, TNV, EEC, AFNOR Testy na korýších (Crustacea) - planktonní - neičastější Daphnia magna, D. pulex, Ceriodaphnia dubia, Artemia šalina (mořská), Thamnocephalus platyurus Testy na vířnících (Rotifera) - Brachionus calyciflorus Testy na kroužkovcích (Annelida) - Tubifex tubifex Testy na hmyzu (Insecta) - Chironomus tentans Testy na měkkýších (Mollusca) Potamopyrgus antipodarum Testy na bentických korýších (Crustacea) Gammarus, Hyallela azteca I Centrum pro výzkum fř^j) toxických látek V^ty^/ v prostředí Da pli iiia magna Artemia salina /'^r~S\ Centrum pro výzkum (^"^J ) toxických látek V^t^/ v prostředí Hrotnatka velká (Daphnia magna) Ríše Animalia (živočichové) - kmen Arthropoda (členovci) - podkmen Crustacea (korýši) - třída Branchiopoda (lupenonožci) - řád Cladocera (perloočky) - čeleď Daphniidae (hrotnatkovití) - rod Daphnia (hrotnatka) Daphnia pulex (hrotnatka obecná), D. magna (h. velká) • zástupce zooplanktonu • akutní i chronické testy • běžně používaný modelový organismus (OECD 1984) c© Centrum pro výzkum toxických látek v prostředí - citlivost k toxikantům - rychlá reprodukce - determinované toxikologické parametry - rychlý životní cyklus - snadná kultivace - biochemické markery Normy testů s Daphnia magna ČSN ISO 6341 (75 7751) Jakost vod - Zkouška inhibice pohyblivosti Daphnia magna Straus (Cladocera, Crustacea) -Zkouška akútni toxicity ^ ČSN ISO 10706 (75 7752) Jakost vod - Stanovení chronické toxicity látek pro daphnia magna Straus (Cladocera, Crustacea) ISO 6341/1996 Water quality - Determination of the inhibition of the mobility of Daphnia magna Straus (Cladocera, Crustacea) -Acute toxicity test ISO 1070/2000 Water quality - Determination of long term toxicity of substances to Daphnia magna Straus (Cladocera, Crustacea) OECD 202 Daphnia sp. Acute Immobilisation Test (Updated Guideline, adopted 4th April 1984) OECD 211 Daphnia magna Reproduction Test (Original Guideline, adopted 21st September 1998) Centrum pro výzkum toxických látek v prostředí Permanentní laboratorní chov Daphnia magna • kultivační místnost • stálá teplota 20 2 C • stálá fotoperioda 16h světla /8h tmy • stálé pH • kultivační médium M4 • pravidelné krmení směsí řas 3-5 mm dlouhý, převážně planktonický sladkovodní živočich dospívají během 6-10 dní, množí se partenogeneticky, životnost až 56 dní při 20°C c© Centrum pro výzkum toxických látek v prostředí Cíl: určení počáteční koncentrace, která v testu imobilizuje 50% jedinců Daphnia magna Podmínky akutního testu: • jedinci mladší 24 hodin, získaní partenogenezí • expozice 24/48 h, bez aerace, bez krmení, bez úpravy pH • standardní médium (CaC03, MgS04, NaHC03, KCI) • bez osvětlení nebo 16 h světla / 8 h tmy, teplota 20 C 2 C • pH 6 - 9 (změna během testu max. 1,5) • během testu měříme pH, teplotu, 02 • rozpuštěný kyslík > 2mg/l / > 3 mg/l • referenční látka:dichroman draselný Zpracování a příprava vzorků vody • Láhve se naplní vzorkem, aby se zamezilo přístupu vzduchu. • Zkouška toxicity se provede co nejdříve po odběru, nejpozději do 6 hod. Pokud není možné tento interval dodržet, vzorek se na místě odběru zchladí na +4°C [nebo zmrazí na -20°C]. V tomto případě musí být vzorek zpracován do 48 hod. Centrum pro výzkum fř^j) toxických látek V^t^/ v prostředí Vlastní zkouška: Nejméně: 20 jedinců na koncentraci (4x5ml/5ks), 5 organismů na jamku či nádobku • nádobka 5-1 Oml/ks (30 jamková destička (10 ml)) - 2 ml testovaného roztoku na jedince po 5 jedincích do každé jamky nejméně 20 jedinců (©) Centrum pro výzkum toxických látek v prostředí ředící jamka testovací jamky Zkoušené roztoky: min. 5 koncentrací + kontrola (testovaná látka + ředící médium) Sledovaný parametr: imobilizace po 24, 48 hodinách - počítáme mobilní jedince - kriterium imobilizace: jedince, kteří nejsou schopni se rozplavat ani po 15s mírném zamíchání považujeme za imobilizované, i kdyby ještě pohybovali tykadly Platnost výsledků = validita testu Koncentrace rozpuštěného kyslíku na konci zkoušky je větší anebo se rovná 2 mg.l~ Procento imobilizace kontrolních vzorkuje menší než nebo se rovná 10% 24h-EC50i pro dichroman draselný je v rozsahu od 0,6 do 1,7 mg.1-1 Vyjadřování výsledků Hodnocení: Počet imobilní ch jedinců počáteční inhibiční koncentrace - hodnoty EC50 (pro 24h a 48h popř. nejnižší c pro 100% imobilizaci a nej vyšší c pro 0% imobilizaci Hodnoty 24h-EC50i 48h-EC50i a limity odpovídající 0% a 100% imobilizace se vyjadřují: U odpadních vod v procentech ředění U chemických látek v miligramech na litr /'^r~S\ I Centrum pro výzkum fř^j) toxických látek v prostředí ALTERNATIVNI MIKROBIOTESTY ("toxkitv") s bezobratlymi www. microbiotests. be *Test organisms are included in the kits as "dormant eggs (cysts) " which can he hatched "on demand' ROTOXKIT F chronic Contains all the materials to perform three 48h reproduction assays THAMNOTOXKIT F™ MICROBIOTESTS With the crustacean Thamnocephalus platyurus PROTOXKIT F™ MICROBIOTESTS MIKROBIOTESTY http ://www. m icrobiotests. be/ • Výhody: miniaturizace, zkrácení doby inkubace a tím i zjednodušení • Možnost dlouhodobého uchovávání testovacích organizmů ve formě kryptobiotických klidových stádií, v lyofilizovaném nebo imobilizovaném stavu. • Organizmy se před použitím v testech uvedou do aktivního stavu. • Synchronně vylíhlí jedinci jsou uniformní a pocházejí z geneticky přesně definovaných zásobních kultur. • V současnosti jsou mikrobiotesty komerčně dostupné v podobě tzv. toxkitů /'^r~S\ I Centrum pro výzkum fř^j) toxických látek V^t^/ v prostředí Mikrobiotesty DAPHTOXKIT FTM magna, DAPHTOXKIT FTM pulex: 24-48h test akutní toxicity pro korýše Daphnia magna a Daphnia pulex (odpovídá OECD a ISO normám) CERIODAPHTOXKIT FTM: 24 h test akutní toxicity pro korýše Ceriodaphnia dubia (odpovídá USEPA normě) THAMNOTOXKIT FTM: 24 h test akutní toxicity pro korýše Thamnocephalus platyurus (Test s Thamnocephalem u nás normován TNO) OSTRACODTOXKIT FTM: 6 denní chronický test toxicity (mortalita/inhibice růstu) s korýšem Heterocypris incongruens. První kontaktní mikrobiotest pro kontaminované sedimenty nebo půdy ROTOXKIT FTM: 24 h test akutní toxicity pro vířníka Brachionus calyciflorus (odpovídá standardní normě ASTM E1440-91). ROTOXKIT FTMshort -chronic: 48h krátký-chronický (reprodukční) test s vířníkem Brachionus calyciflorus (odpovídá francouzské normě AFNOR) PROTOXKIT FTM: 24h chronický (inhibice růstu) test toxicity pro prvoka Tetrahymena thermophila. Metodika pro odpovídající test je vyvíjena v OECD. RAPIDTOXKIT (tm): Hodinový test toxicity s larvami korýše Thamnocephalus platyurus pro rychlou detekci kontaminace vody. /'^r~S\ I Centrum pro výzkum fř^j) toxických látek v prostředí Thamnotoxkit • Testovací organismus Thamnocephalus platyurus • Uchovávání: klidová stádia • Doba líhnutí: 20 hod., 4000 Ix, 20°C • Inkubace: 24 hod., 4000 Ix, 20°C • Vyhodnocení: mortalita, 24 LC50 Výhody: 20 h líhnutí, větší, citlivý organismus, expozice 24-48 h, srovnatelné výsledky s dafnií (+ citlivější) i zakalené/zabarvené vzorky, je v TNV Obdobně CERIODAPHTOX ^^^^^^ Ceriodaphnia dubia jfeŠSlfe. (©) Centrum pro výzkum toxických látek v prostředí ODVĚTVOVÁ TECHNICKÁ NORMA VODNÍHO HOSPODÁŘSTVÍ ^ ^CL^ MZe ČR MIKROMETODA STANOVENÍ AKUTNÍ TOXICITY NA KORÝŠI THAMNOCEPHALUS PLATYURUS TNV 75 7754 Obsah Strana 1. Předmluva....................................................................................................... 1 2. Předmět normy.................................................................................................. 2 3. Termíny, definice a zkratky................................................................................. 2 4. Podstata zkoušky............:................................................................................... 3 5. Materiály a chemikálie......................................................................................... 3 6. Přístroje a pomůcky............................................................................................ 4 7. Příprava vzorků zkoušené vody........................................................................... 4 8. Postup zkoušky.................................................................................................... 5 9. Vyjadřování výsledků............................................................................................ 7 10. Protokol o zkoušce............................................................................................... 7 11. Příloha A (informativní) - Korýš Thamnocephalus platyurus.................................. 8 12. Přílohy B (informativní) - Limitní hodnoty pro Thamnocephalus platyurus............. 9 13. Příloha C (informativní) - Literatura....................................................................... 10 /^Vv I Centrum pro výzkum I J toxických látek v prostředí Rotoxkit F • Testovací organismus: Brachionus calycifloris (vodní vířník) • Uchování: klidová stádia, cysty • Doba líhnutí: 18 hod., 20°C, 4000lx • Design: 6 opakování, 6 koncentrací v jedné destičce, jamka á 0,3 ml ^^^^ • Inkubace: 24 hod., 20°C, 4000lx • Vyhodnocení: mortalita, 24 LC50 Výhody: Domácí běžný druh, přídavná informace Nevýhody: Malý, většinou méně citlivý Závěr: zajímavý doplněk testů toxicity, není nutný, je-li v baterii korýš Obdobně Protoxkit s prvokem Tetrahymena thermophila Centrum pro výzkum fř^j) toxických látek V^t^/ v prostředí 'Ó 3 H g- H* a p* n m I a •d H- o o 3 3 C 3 000000 * ta Hl >C OOOOOO- oooooo- OOOOOO-OOOOOO" oooooo- OOOOOO-í o o H* (D tfi {+ H-0« Plnění testovací destičky Centrum pro výzkum toxických látek v prostředí ředící voda C5 C4 C3 KJ C2 KJ ředění toxické C1 látky 0.7m! 0.3 ml r_j;_^ l l oooooo ooooooo €3000000 'OOOOOO oooooo yooooooo testovací destička 1 Přenos cca 50 vířníkú do každé ředící jamky Přenos vířníku do testovacích jamek c 5 vířníků v testovací janče >00000© oooooo ooooooo O'OOOOOO ooooooo CD'QQQQQQ janka pro ředící lihnutí jamka jamky pro test (©) Centrum pro výzkum toxických látek v prostředí Daphtoxkit pulex Výhody Nevýhody Jako ISO, OECD * 3 dny líhnutí Z klidových stádií * Nevyrovnané líhnutí • Problémy se skladováním • Povrchové tenze -neplavou Závěr: zatím není zcela vyladěný Centrum pro výzkum toxických látek v prostředí RAPIDTOXKIT Test s nejrychlejší odpovědí „jídelní tesť - sledováno ovlivnění příjmu potravy stresem (toxickou látkou) Testovací organismus: Thamnocephalus platyurus Uchování: klidová stádia, cysty Doba líhnutí: 30-45 hod., 25°C, 4000lx Inkubace: 15-60min, 25°C, 4000lx Pak přidány červeně obarvené mikrospory (potrava), inkubace 15-30 min Vyhodnocení: pod mikroskopem zhodnocen příjem potravy v jednotlivých expozičních variantách -hodnocena inhibice příjmu mikrospor v porovnání s kontrolou Centrum pro výzkum toxických látek v prostředí Suspected water Control water Lxpose the test organisms (small larval crustaceans) hatched front dormant eggs to the suspected water and a control watet\for a short period of time (15 minutes, to 1 hoar) Add red microspheres aad allow the test organisms to take up the particles during 15-30 minutes Observe the coloration of the digestive tract of the larvae under a stereomicroscope No uptake (or significant fy decreased uptake) of the red microspheres points to the presence of « unwanted » compounds which should trigger attention and action S, Toxic hazard ? VALIDITA: Výsledky testu jsou považovány za platné, když • Koncentrace rozp. kyslíku neklesla pod 60% nasycení • Koncentrace testované látky neklesla pod 80% • Mortalita kontrolního vzorku nepřesáhla 10% • Zjištěná koncentrace LC50 je v souladu se standardy ~~ Centrum pro výzkum toxických látek v prostředí PŮDA + SEDIMENTY Mikrobiotest - OSTRACODTOXKIT FTM: 6 denní chronický test toxicity (mortalita/inhibice růstu) s korýšem Heterocypris incongruens. Kontaktní test v mikrodeskách 3x2 jamky (objem 1 ml). 10 jedinců na jamku, OSTRACODTOXKIT F™ MICROBIOTESTS Uchování: klidová stádia, cysty for sediment toxicity testing Doba líhnutí: 52 hod., 25°C, 4000lx With the Inkubace: 6 dní, 25°C, 4000lx benthic crustacean Vyhodnocení: mortalita, 24 LC50, růst Centrum pro výzkum fř^j) toxických látek V^t^/ v prostředí Testy toxicity s bezobratlými Ekonomické hodnocení (orientační ceny bez cla a dopravy) • Rotoxkit, Thamnoto..................... .............. 1000Kč • Daphtoxkit.................................................. 1300Kč • Algaltoxkit..................................................4300Kč • ECHA Biocide monitor................................ 200Kč • MetPad.............................................. 500Kč • Toxichromotest (SedimentChromoPad), Toxichromotest....................................1000Kč I Centrum pro výzkum (ťí) toxických látek | v prostředí Chronické testy s vodními bezobratlými živočichy Akvatické testy • Reprodukční test s hrotnatkou Daphnia spp. (ISO 1070/2000) • Test přežívání a reprodukce s břichatkou Ceriodaphnia dubia (USEPA, 1989) • Chronické biotesty s vidlonožci (Mysidacea - řád korýšů z podtřídy rakovců) - mořští, pronikají i do brakických a sladkých vod Sedimentové testy 10-denní test přežívání a růstu s různonožcem Hyalella azteca (USEPA, 2000) 42-denní test přežívání, růstu a reprodukce s různonožcem Hyalella azteca (USEPA, 2000) 10-denní test přežívání a růstu s pakomárem Chironomus tentans (USEPA, 2000) Celoživotní (Life-cycle) test pro hodnocení účiků kontaminace sedimentů s pakomárem Chironomus tentans (USEPA, 2000) Centrum pro výzkum fř^j) toxických látek V^t^/ v prostředí Chronický test na Daphnia magna ČSN ISO 10706 Jakost vod - Stanovení chronické toxicity látek pro Daphnia magna Straus (Cladocera, Crustacea) • organismy mladší 24h • 10 organismů na koncentraci • individuálně v 50ml media M4/kádinku • médium výměna 3x týdně • expozice 21 dní • teplota 20 2 C • pH 6-9 ( 1,5) • rozpuštěný 02 > 3mg/l • fotoperioda 16 h světla / 8 h tmy • krmení směs řas Jednou týdně: 02, teplota, tvrdost a pH v médiu, kontrolních nádobách a u nejvyšší zkušební koncentrace. /'^r~S\ I Centrum pro výzkum fř^j) toxických látek v prostředí Příprava média Elendt M4 Zásobní roztoky SrCl2.6H20 MnCl2.4H20 ZnCl2 CoCl2.6H20 Na2Se03 CuCl2.2H20 H3B02 LiCl RbCl NaBr KI NH4V03 Centrum pro výzkum toxických látek v prostředí CaCl2.2H20, NaHC03, NaN03 MgS04.7H20, KH2P04, KCl, K2HP04, Na2Si03.9H20 Roztok I (stopové prvky) Thiamin hydrochlorid, Biotin, Cyanocobalamin Roztok II. (makroživiny vitamíny) Zkušební roztok a zkušební koncentrace Zkušební koncentrace se připravuje alespoň v pěti variantách s faktorem <3,2 (geometr, řada) cn = c0*qn n = 1,2,3,... Rozptyl koncentrací se nastavuje podle cíle testuf^^^l ■ LOEC/NOEC • ECX Nepoužívá se koncentrace se statisticky významným účinkem na přežití dospělců -> toxicita pro reprodukci a mortalitu Rozpouštědla a dispersanty do 0,1 ml/l, lépe je nepoužívat /'^r~S\ I Centrum pro výzkum fř^j) toxických látek V^t^/ v prostředí Sledované parametry • Mortalita, přežívání • Reprodukce • Počet narozených juvenilů • Den první reprodukce • Chování - způsob pohybu koncentrace 15 mg/l -•— control BIOMAS s -*- AQ EXTRACT -*- C18 PERMEATE -»- C18 ELUATE T /// ■ ■-1 1/ y. . 10 12 14 16 18 20 22 čas (dny) \mi i toxickycn lateK s/ v prostředí koncentrace 135 mg/l -■-1 I-■-1 i-•-1 w v rl ASS \ "N \. -•- contc -4- BIOW \"' T T T g g > XTRACI 3ERME^ ELUATE \TE •——é——i \ \, _._I i_._i I_._I I_._I I_._I i_._i i_._i i_._i i_._i 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 čas (dny) další parametry (zbarvení, tukové kapénky, velikost gonád) - měření délky matečných organismů na konci zk. - velikost a počet potomků jednoho organismu - počet potracených plůdků,... Testy toxicity s bezobratlými Závěr • pro konkrétní případ, vzorek a problém může zkušený ekotoxikolog vybrat vhodnou kompozici detekčního systému • akutní testy toxicity jsou jednou z několika součástí systému hodnocení - chemické analýzy - struktura zoocenoz a fytocenoz - biokumulace a biokoncentrace - QSAR - biomarkery - atd... /'^r~S\ I Centrum pro výzkum fř^j) toxických látek v prostředí m • evropský ^^^^H lvT|~ 4 ! f0CÍflnL | M|N|STERSTVO šKoLSTVÍ, OPVzdělávání TOnd V CR EVROPSKÁ UNIE MLÁDEŽE A TĚLOVÝCHOVY pro konkurenceschopnost INVESTICE DO ROZVOJE VZDĚLÁVÁNÍ Inovace tohoto předmětu je spolufinancována Evropským sociálním fondem a státním rozpočtem České republiky Centrum pro výzkum toxických látek v prostředí