Inovace tohoto předmětu je spolufinancována Evropským sociálním fondem a státním rozpočtem České republiky
Testy toxicity sedimentů
K.Hilscherová
Sedimenty
- velmi různorodé složení - polotuhá matrice - pevná fáze (částice) a
pórová voda
• v podstatě akvatický ekvivalent půdy
- heterogenní prostředí - směs jílu, písku, minerálů, huminových látek,
odumřelých organismů a antropogenních polutantů
- akumulace a inaktivace polutantů
(např. AVS – kovy, Corg – PAHs)
• primární úložiště biotického i abiotického materiálu (včetně
polutantů) v akvatickém prostředí
• akumulace polutantů v sedimentech může způsobit:
1. Změny ve struktuře bentických společenstev
2. Zvýšené zatížení organismů polutanty
3. Toxicitu
Klasifikace sedimentů
1. Obsah organického uhlíku – ovlivňuje sorpci
neutrálních organických látek  zvýšené Kow =
zvýšená sorpce
2. Distribuce zrnitostních frakcí – větší částice mají
tendenci sorbovat méně polutantů
3. Obsah a typ jílu
4. Kationtová výměnná kapacita (KVK)
– ovlivňuje sorpci kationtů
1. pH – ovlivňuje speciaci kovů, sorpci
Další fyzikálně chemické parametry
– DO, salinita, amoniak
Transport a resuspendace sedimentů
Proudy, povodně, vítr, vlny
- Způsobují pohyby sedimentů v závislosti na jejich velikosti
Porová voda
• Voda mezi částicemi sedimentů
• Nepolární polutanty  sedimenty  porová voda 
vodní sloupec
• Primární zdroj expozice polutantů pro organismy žijící v
sedimentu
Sedimenty mohou vázat polutanty, pak být překryty další
vrstvou sedimentů  redukce biodostupnosti
Odběry vzorků sedimentů
- tyčové vzorkovače (vertikální profil, historie sedimentace)
- pasivní vzorkovače – sedimentové pasti (plaveniny)
- drapákové vzorkovače (směsné vzorky)
- SPMDs – odběr určitých typů polutantů (zejm. pórová voda)
 Narušení fyzikálně chemických parametrů sedimentů
Manipulace se vzorky
• Uskladnění:
změny toxicity vzorků v závislosti na teplotě (chlazení (4ºC) vs. mražení
(<-20ºC)) , době uskladnění a stupni kontaminace sedimentů
• Úpravy vzorků:
1.) úpravy pH (6-9) – vliv na toxicitu a biodostupnost kovů (Zn, Ni, Pb,
Cu, Cd), amoniaku a sirovodíku
2.) lyofilizace vs. zmražení
3.) amoniak – odstranění amoniaku ze vzorku probubláváním nebo
přidáním zeolitu
4.) homogenizace
5.) kovy – odstranění kovů přidáním EDTA nebo sulfidů
6.) výluhy (vodné/organické) vs. SPTs – změny toxicity eluátů v závislosti
na volbě rozpouštědla (voda, methanol, DCM) vs. toxicita biodostupné
frakce kontaminantů
7.) pórová voda vs. SPTs
You created this PDF from an application that is not licensed to print to novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
Testy se sedimenty
• Organismy v sedimentu vystaveni látkám zachyceným v pevné i
kapalné složce matrice
• Pro bentické organismy - biodostupnost chemických stresorů v
sedimentech.
• Sediment = potenciální dlouhodobý zásobník/zdroj kontaminantů
uvolněných do vody
• Může být nezbytné remediovat kontaminované lokality bagrováním
nebo odstraněním sedimentů
• odstranění sedimentu, jeho transport a uložení mohou být velmi
nákladné; studie toxicity umožní identifikovat nebezpečně
kontaminované lokality – kde je třeba odstranění, kde možno
ponechat bez významného rizika.
• Zejména EPA a ASTM metodiky
Jak hodnotit toxicitu sedimentů?
 Toxicita porové vody/výluhů (několik ISO / OECD
norem)
: 100 g d.w./L vody, 24h pomalé třepání, filtrace, test
V. fisheri (30 min), řasy, bezobratlí - D. magna (2 dny)
? Vodný výluh vs. Sediment
 Doporučeny nejméně 2 různé druhy (např. Hyalella, Chironomus, Daphnia, …) a dva různé
sledované parametry (např. růst, přežití, reprodukce...)
 Kontaktní toxicita (jen málo norem …)
: sedimenty+organismy & hodnocení účinků – červi, hmyz, šneci … dny - týdny
Skríningové testy toxicity/genotoxicity
Bakteriální modely
Testy s výluhy sedimentů:
• Vibrio fischerii (Microtox) – 0,5 h
• Escherichia coli (Toxichromotest) – 2 h
Kontaktní verze testu
• Flash test s Vibrio fischerii – kinetický test - stanovení inhibičního
účinku vzorků na světelnou emisi Vibrio fisheri
• srovnatelné se statickou zkouškou s luminiscenčními bakteriemi podle
ČSN EN ISO 11348
• Flash verze - eliminace vlivu zákalu a zbarvení vzorku, umožňuje
provedení testu se suspenzí vzorku bez přípravy vodného výluhu. Je
mezistupněm ke kontaktním zkouškám ekotoxicity
Testy genotoxicity s výluhy:
• SOS chromotest
• umuC test
• GFP test atd.
Nástroje pro hodnocení
• Základní požadavky
– Měření zakalených (barevných) materiálů
– Schopnost rozlišení TOXICKÝ - NETOXICKÝ
– Rychlost
• Bakteriální bioluminiscenční testy toxicity
– Klasické – Microtox®, BioToxTM, LUMISTox aj.
– Alternativní – modifikace klasických testů (např.
BioToxTM Flash test*)
* Lappalainen, J. et al. (1999): Chemosphere, 38(5), pp. 1069-1083.
Microtox
• Vibrio fischerii
- Mořská bakterie schopná bioluminiscenece
Design:
- Akutní
- mikrodestička
- Endpoint: inhibice bioluminiscence
- Luminometr – t = 0, 15, 30 minut
- Testování vodného výluhu
Flash test
• Vibrio fischerii
- testováni zakalených a barevných
vzorků, bez potřeby referenčního
materiálu
design:
- akutní
- inhibice bioluminscence
- mikrodestička
- luminometr s dispensorem
- nutné vzorek protřepat (během měření)
- krátká doba měření – Hodnota píku
Smax (0-2s) v porovnání s píkem
S30s (po 30s měření)
You created this PDF from an application that is not licensed to print to novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
Akutní testy toxicity I.
• Porová voda
• Eluát ze sedimentu
• 48-96 h expozice
• Příprava eluátu: 24h třepání, 100 g sedimentu/1L vody
• Druhy: Daphnia magna, Daphnia pulex, Ceriodaphnia
dubia, střevle potoční (Pimephales Promelas), pstruh
duhový (Oncorhynchus mykiss)
• Sledované parametry: přežívání, imobilizace
Akutní testy toxicity II.
• Kontaktní testy - Celý sediment
• 96h – 10 dní expozice
• Druhy: různonožec (Hyalella azteca), jepice
(Hexagenia limbata), pakomár
(C.tentants/riparius)
• 10-denní test s Hyalella azteca a Chironomus
tentans
• Sledované parametry: přežívání
Chronické testy toxicity I.
• Porová voda
• Eluát ze sedimentu
• 7-35 dní expozice
• Druhy: Ceriodaphnia dubia, střevle potoční (Pimephales
Promelas), pstruh duhový (Oncorhynchus mykiss)
• Sledované parametry: přežívání, imobilizace, růst,
reprodukce, doba první reprodukce, doba úhynu,
přežívání mladých
Chronické testy toxicity II.
• Kontaktní testy - Celý sediment
• Zpravidla 28 dní expozice
• Druhy: různonožec (Hyalella azteca), pakomár
(C.tentants/riparius)
• Sledované parametry: přežívání, imobilizace, růst,
reprodukce, doba první reprodukce, doba úhynu,
přežívání mladých
• 28- a 42-denní testy s H. azteca
• Sub-chronické a celoživotní testy s Chironomus tentans
• 10-denní krátkodobý chronický test s larvami
obojživelníků
ASTM E 1706 (2005) Standard Test Method for Measuring the Toxicity of
Sediment-Associated Contaminants with Freshwater Invertebrates
• korýš Hyalella azteca ( H. azteca)
• pakomár Chironomus tentans
• 10 denní test, 300-mL kádinky, 100 mL sedimentu, 175 mL
vody, organismy krmeny
• Parametry: přežívání, růst
Další testy sedimentů:
Chironomus riparius, Daphnia magna and Ceriodaphnia dubia, Hexagenia
spp., Chronický test s Tubifex tubifex (28 dní) – přežívání, růst, reprodukce
Chronický test s H. azteca
Diporeia spp.
Chironomus dilutus - přežívání, růst, vylétávání, reprodukce
Ekotoxikologické biotesty se sedimenty – přehled EPA
e
g
a
t
u
s
t
e
c
a
u
s
“
w
o
r
m
”
s
www.epa.gov
You created this PDF from an application that is not licensed to print to novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
Ekotoxikologické biotesty se sedimenty – přehled EPA
www.epa.gov
Testy toxicity sedimentů ASTM
Testy toxicity sedimentů ASTM
Tubifex tubifex - Nitěnka obecná
• Součást makrozoobentosu
• Relevantní organismus pro sediment
• Inhibice pohybu a letální koncentrace
kmen: KROUŽKOVCI
třída: opaskovci
podtřída: máloštětinatci
Spíše chroničtější expozice – viz. Chronické testy
– pakomáři, mlži, korýši, kroužkovci - Hyallela, Lumbriculus
Testy toxicity sedimentů
Akutní test
Účel: Test je určen k hodnocení akutní toxicity látek na nitěnky. Nitěnky patří mezi
nejčastěji a nejdéle používané testovací organismy.
Princip: Test spočívá ve sledování chování a přežívání nitěnek v odstupňovaných
koncentracích látky ve srovnání s kontrolou
v ředící vodě. Expozice je 48 h. Možno i prolongovaný 10-14 denní test
Hodnocené parametry: přežívání, aktivita, bioakumulace
Testy s larvami pakomárů rodu Chironomus
• OECD 218 Sediment-Water Chironomid Toxicity Test Using
Spiked Sediment
• OECD 219 Sediment-Water Chironomid Toxicity Test Using
Spiked Water
• USEPA 2000 Celoživotní (Life-cycle) test pro hodnocení účinků
kontaminace sedimentů s pakomárem Chironomus tentans
Chironomus riparius Meig.
(pakomár)
You created this PDF from an application that is not licensed to print to novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
Charakteristika modelového druhu
• rod Chironomus - řád dvoukřídí (Diptera) = hmyz
s proměnou dokonalou
• vajíčko-larva(4 instary)-kukla-imago
• dominantní konzumenti 1. řádu v rámci
sladkovodních akvatických
ekosystémů
• značná abundance
• kosmopolitní rozšíření
• larvy - všežravci
- živí se řasami, rozsivkami,
detritem
10-denní test s larvami pakomárů rodu Chironomus
Nasazovány larvy ve stadiu 2-3
instaru (cca 10 d staré)
10 jedinců/kádinku
100 ml sedimentu/175 ml vody
Teplota 20 ± 2°C
Pravidelné krmení, vzduchování
Fotoperioda 16 h světla / 8 h tmy
Sledováno pH, kyslík, vodivost
Po 10 dnech hodnoceno přežívání a
růst
Celoživotní (Life-cycle) test pro hodnocení účinků
kontaminace sedimentů s pakomárem Chironomus tentans
Nasazovány larvy mladší jak 24 h
12 jedinců/kádinku
100 ml sedimentu/175 ml vody
Teplota 20 ± 2°C
Pravidelné krmení, vzduchování
Fotoperioda 16 h světla / 8 h tmy
Sledováno pH, kyslík, vodivost
Doba expozice 50-60 d (ukončeno 7 dní po
posledním vylétnutí)
Hodnocené parametry: 20-denní přežívání a
váha (růst), vylétávání samiček a samečků
– poměr pohlaví, doba vylétávání, počet
nakladených vajíček, přežívání dospělců
Podobné
uspořádání jako
v 10-denním
testu
Celoživotní test - dle OECD #218/219
• provádí se v 600ml kádinkách
• sediment artificiální nebo přírodní
• voda - studniční, povrchová,
provozní, uměle připravená
• sediment : voda 1:4
• 20 ±2°C, 500 – 1000 lux, 16L : 8D
A. nylonová síťka
B. plastový kryt
C. kádinka bez zobáčku
D. otvory na výměnu vody
E. sediment
kontaminace: sedimentu
vody nad sedimentem
koncentrační řada: aspoň 5 koncentrací
f ≤ 2
kvalita vody - pH 6-9, rozpuštěný kyslík –
aspoň 60% ASV, změřit tvrdost a amoniak
vzdušnění – Pasteurovou pipetou (jemně)
Celoživotní test - dle OECD #218/219
• 1-4 dny staré larvy vysazujeme do sedimentu
• 20 jedinců/kádinka
• počet opakování: 3 - ECx; 4 - NOEC, LOEC
• krmení– tetrafinR, 0,25-0,5 mg/larva/den
• délka trvání – 28d (C.riparius)
Celoživotní test - dle OECD #218/219
Cílové parametry:
• procento líhnutí dospělců:
ER: procento líhnutí dospělců (emergence ratio)
na: počet jedinců vysazených do kádinky
ne: počet vylíhlých jedinců celkem (na konci pokusu)
Přijatelnost testu: ER kontroly >0,7
• střední čas vývoje: čas od vysazení do líhnutí
a
e
n
n
ER 
You created this PDF from an application that is not licensed to print to novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
• střední rychlost vývoje:
x: střední rychlost vývoje v kádince
i: index intervalu mezi pozorováními
m: počet všech intervalů mezi pozorováními
fi: počet vylíhnutých jedinců během daného intervalu
ne: počet vylíhlých jedinců celkem (na konci pokusu)
xi: rychlost vývoje larev vylíhlých v intervalu i
deni: den pozorování (od začátku)
li: délka intervalu mezi pozorováními (obvykle 1 den)
e
ii
m
i n
xf
x 

0
2/
1
ii
i
lden
x


ECx Regresní analýza
NOEC, LOEC ANOVA
Závislost citlivosti
na pohlaví
Chi-square
Procento
vylíhnutých
jedinců
Cochran-Armitage test, Fisher’s exact test, Mantel-Haentzal
test s Bonferroni-Holm úpravou p-hodnot, ANOVA (+arsin
transformace)
Projevy u bezobratlých:
Narušení reprodukce, rodivosti (fekundita)
Poruchy růstu, sexuálního dozrávání (maturace)
Narušení sexuálního dimorfismu, Intersex, Imposex
další procesy řízené hormony: pigmentace,
regenerace končetin, diapauza
Sagi et al. (2003) – Cherax quadricarinatus
Rudolphi (1999) – Samastacus spiniformis
Suzuki (1999)
– Armadillidium vulgare
?AG
Barki et al. (2003)
Jungmann et al. (2004)
- Gammarus fossarum
Endokrinní disrupce (ED) = narušení hormonální rovnováhy
organismů s potenciálními negativními následky pro celkovou
homeostázu, reprodukční, vývojové a behaviorálních funkce
SUBLETSUBLETÁÁLNLNÍÍ TOXICITATOXICITA
U VODNU VODNÍÍCH MCH MĚĚKKÝKKÝŠŠŮŮ
- vodní měkkýši využíváni jako testovací organismy pro
vyhodnocení účinků endokrinních disruptorů ve vodním
prostředí
Test sedimentů s písečníkem novozélandským
PotamopyrgusPotamopyrgus antipodarumantipodarum
- vhodný a efektivní nástroj pro testování přírodních
sedimentů a čistých látek
- finančně atraktivní varianta oproti
chemickým analýzám sedimentů
trvání 4 týdny (popř. 8 týdnů)
nádoba objem 1 l
médium 800 ml vody
expozice statická, 50 g sedimentu
odběry 20 jedinců po 4 (8) týdnech
parametry
mortalita; změny v morfologii pohl. orgánů;
počet embryí, poměr embryí bez ulity a s ulitou
+ nízké nároky na kultivace
- nedostatečná velikost pro biochemické
analýzy
ParametryParametry
„„PotamopyrgusPotamopyrgus sediment testusediment testu““
PPřříípravaprava
Typy sedimentů
o přírodní
o artificiální
listová hrabanka + křemitý písek
o spajkovaný artificiální sediment
vyhodnocení efektů čistých látek
(1) spajkování artificiálního sedimentu.
(2) po odpaření solventu je přidáno medium
(3) ustavení rovnováhy mezi sedimentem a
vodou, po 4 dnech přidáni šneci .
1 2 3
2(3) dny
ve tmě
4 dny
Médium
- voda s přídavkem
NaHCO3, CaCO3
- 16°C,
700±100μS/cm
L:D 16:8
Komerční řasové
pelety
Expozice, vyhodnocenExpozice, vyhodnoceníí
Parametry: mortalita a počet plně vyvinutých a nezralých
embryí
(Xeno)estrogenní účinek
- ethinylestradiol, bisfenol A, octylfenol, nonylfenol
Xenoandrogenní účinek
- tributylcín, trifenylcín
Biomonitoring dnových sedimentů (Nisa, Odra)
You created this PDF from an application that is not licensed to print to novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
Kontaktní Testy Toxicity – ovlivňující faktory
Faktory mimo kontaminace
• zrnitost sedimentů
• obsah a typ jílu
• obsah a charakter organického uhlíku
• struktura a vlastnosti huminových látek/organického materiálu
• pH
• obsah kyslíku
• toxicita amoniaku /sulfidů
• aktuální stav testovací populace
• výživa
Změny toxicity sedimentů díky vzorkování a experimentálnímu
postupu
– promíchání více kontaminovaných sedimentů s tenkou vrstvou na
rozhraní vody-sedimentů
– oxidace a precipitace redukovaných kovů díky provzdušňování
požadovanému v testu toxicity
Testy bioakumulace
• Kontaktní testy – celý sediment
• 28-56 dní expozice
• In-situ a/nebo Ex-situ testy pro zhodnocení příjmu
kontaminantů organismy
• Používány zejména na lokalitách kontaminovaných
bioakumulativními látkami (PAHs, PCBs, rtuť,
PCDDs/PCDFs, ...)
• Výsledky porovnávány s referenčními lokalitami a/nebo
povolenými limity
• Druhy: různonožec (Hyalella azteca), máloštětinatci
(Lumbriculus variegatus, nitěnka obecná)
Test subject: water
Test subject: sediment
Determination of
macrozoobenthos
saprobic index
functional feeding groups
life form index
evenness & diversity
Bioassays
toxicity, cytotoxicity
endocrine disrupting potential
genotoxicity, mutagenicity
Chemical analyses
organical analyses
limnochemical parameters
heavy metals
Ecosystem
native & concentrated surface water
whole sediment, sediment pore water, elutriate
and organic - extracts
Assessment
Identification
... in vitro and in vivo
bioassays
Integrated assessment
of aquatic ecosystems In situ testy
• Klecování – měkkýši, ryby, další bezobratlí,
• Mortalita, zdravotní stav, příp. reprodukce a
specifické biomarkery v exponovaných
organismech
• Subletální biomarkery, histologie
THE SEDIMENT QUALITY
“QUADRAD”
Bioaccumulation
Tests/Fish Tissue
Analysis
Sediment
Toxicity
Benthic Community
Survey
Sediment
Chemistry
Inovace tohoto předmětu je spolufinancována
Evropským sociálním fondem a státním rozpočtem
České republiky
You created this PDF from an application that is not licensed to print to novaPDF printer (http://www.novapdf.com)