(©) Centrum pro výzkum toxických látek v prostředí ^ Ekotoxikologické biotesty Půdní biotesty Doc. RNDr. Jakub Hofman, Ph.D. TERSTVO ŠKOLSTVÍ. OP Vzděláváni -h^U^i ■»wtf I 95 IVII I UVUi ř00!?'"^ | MINISTERSTVO ŠKOLSTVÍ, OP Vzděláváni "í^kJ^J^ř tondVCR EVROPSKÁ UNIE MLÁDEŽE a TĚLOVÝCHOVY pro konkurenceschopnost 'Mna**" INVESTICE DO ROZVOJE VZDĚLÁVÁNÍ Inovace tohoto předmětu je spolufinancována Evropským sociálním fondem a státním rozpočtem České republiky Půdní biotesty Testy s půdními organismy Matrice je půda (solid phase) Cíl: chránit půdu a půdní biotu před účinky chemických látek a dalšími stresory ■ Proč? Půda je nepostradatelná složka přírody, základna pro růst rostlin, zásobárna živin, počátek a konec potravních řetězců a cyklů prvků, filtrační a dekontaminační zóna (©) Centrum pro výzkum toxických látek v prostředí Proč ekotoxikologické testy ? CHEMICKÉ ANALÝZY samotné NEDOKÁŽOU postihnout reálné riziko pro živé organismy: 1) reálná expozice se liší podle biodostupnosti toxických prvků a látek v dané situaci, 2) jde vždy o směs toxikantů, která působí jinak než jednotlivé toxikanty zvášť 3) Negativní vlivy matrice samotné bez ohledu na obsah toxikantů na živé organismy či interakce vlivu matrice s efekty toxikantů 4) spektrum analytických metod (tedy i limitních hodnot) je omezené a ve vzorku mohou být přítomny neanalyzované významně toxické látky. (©) Centrum pro výzkum toxických látek v prostředí ^ Proč testy kontaktní (půdní) ? Účinky na půdní organismy exponované v pevné matrici nelze zcela extrapolovat z testů akvatických Do hry vstupuje významně osud kontaminantu v půdním prostředí, vliv na reálnou biodostupnost pro půdní organismy Nezanedbatelné vlivy samotné matrice (např. nevhodné fyz.- chem. vlastnosti, kombinace s toxicitou) Centrum pro výzkum toxických látek v prostředí ^ Důsledky expozice v pevné matrici ■ Pevné matrice jsou dosti heterogenní ■ Obsahuje vždy všechny tři fáze PEVNOU, KAPALNOU (pórová voda) a PLYN (vzduch) ■ Přítomnost pevné fáze zejména má významný vliv na OSUD a CHOVÁNÍ chemické látky ■ V závislosti na vlastnostech látky, vlastnostech půdy a^čase dojde k DISTRIBUCI látky v půdě, případně vzniku SPECIÍ ■ Stěžejním procesem je SORPCE a důsledkem je klíčový faktor půdních testů (eko)toxicity - BIODOSTUPNOST ■ To vše má fatální důsledky pro výslednou toxicitu a riziko ■ Důsledkem je i ztížená extrapolace mezi půdami, z akvatických testů na půdní a z laboratorních testů na reálnou situaci I Centrum pro výzkum toxických látek | v prostředí Schéma expozice v půdním prostředí Vstup POLUTANTU x (©) POLUTANT v půdě prostorově distribuován a v různých formách EXPOZICE je funkce: osudu polutantu v půdě + vlastností organismu (morfologie, fyziologie, ekologie ...) Centrum pro výzkum toxických látek v prostředí ORGANISMUS Polutant v organismu Metabolismus, eliminace, efekty Které vlastnosti matrice jsou kritické ■ Obsah organické hmoty - OM, TOC ■ Obsah jílovitých částic (0 < 10 |jm) ■ Kationtová výměnná kapacita . pH ■ Vlhkost ■ Struktura půdy ■ Čas (©) Centrum pro výzkum toxických látek v prostředí (©) Centrum pro výzkum toxických látek v prostředí l- Využití půdních biotestů v ochraně půd TERSTVO ŠKOLSTVÍ. OP Vzděláváni ■»wtf I 95 lvll * ITOJi ř00!?'"^ Iflfl^ | MINISTERSTVO ŠKOLSTVÍ, OP Vzděláváni "í^kJ^J^ř tondVCR EVROPSKÁ UNIE mládeže a tělovýchovy pro konkurenceschopnost 'Mna**" INVESTICE DO ROZVOJE VZDĚLÁVÁNÍ Inovace tohoto předmětu je spolufinancována Evropským sociálním fondem a státním rozpočtem České republiky Využití půdních biotestů při ochraně půd ■ Zakotvení v legislativě = PROČ mají půdní biotesty své místo na slunci ■ Do teď zejména při hodnocení nebezpečnosti chemických látek a pesticidních přípravků ■ Silný nárůst zájmu o využití biotestů při hodnocení komplexních směsí jako jsou odpady, kal ČOV, sedimenty, komposty, hnojiva a pod. ■ Velký potenciál biotestů při hodnocení kvality půd např. před a po remediaci, při inventuře kontaminovaných ploch apod. (©) Centrum pro výzkum toxických látek v prostředí ^ Legislativa vs půdní biotesty - ČR 1)CHEMICKÉ LÁTKY ■ Zákon č. 356/2003 Sb., O chemických látkách a chemických přípravcích a jeho prováděcí vyhláška č. 222/2004 Sb., kterou se u chemických látek a chemických přípravků stanoví základní metody pro zkoušení fyzikálně-chemických vlastností, výbušných vlastností a vlastností nebezpečných pro životní prostředí (ve znění ve znění vyhlášky č. 389/2005 Sb.) ■ Jako povinné ekotoxikologické testy jsou uvedeny (včetně metodiky): > akutní test se žížalou E. fetida m testy efektů na aktivitu půdních mikroorganismů při transformaci dusíku a uhlíku > test efektů na aerobní a anaerobní transformace v půdě ■ Jde v podstatě o přeložené metodiky OECD testů Centrum pro výzkum toxických látek v prostředí Legislativa vs půdní biotesty - CR 2) PESTICIDY ■ Zákon č. 326/2004 Sb., o rostlinolékařské péči a jeho prováděcí vyhláška č. 329/2004 Sb., o přípravcích a dalších prostředcích na ochranu rostlin > Příloha 1: Seznam studií, které musí žadatel dodat pro hodnocení přípravku > Příloha 2: seznam studií, které musí žadatel dodat pro hodnocení účinné ■ S půdními biotesty souvisí požadavek na zhodnocení vlivů na: > necílové suchozemské členovce (dle metodiky SETAC/ESCORT) > žížaly (akutní, reprodukce a pokud potřeba i polní test) > mikroorganismy (dle metodiky SETAC) ■ Vyhláška č. 327/2004 Sb., ochrana včel, zvěře, vodních organismů před přípravky na ochranu rostlin > Definuje skupinu prospěšných, necílových členovců = beneficial, non-target arthropods > Definuje skupinu půdních organismů ■ Neobsahuje doporučení konkrétních testů látky (©) Centrum pro výzkum toxických látek v prostředí Legislativa vs půdní biotesty - ČR 3) ODPADY, HNOJIVA A DALSI ... ■ Zákon 185/2001 Sb., o odpadech a jeho prováděcí vyhláška č. 376/2001 Sb., o hodnocení nebezpečných vlastností odpadů (stejně jako EU pod kódem H14 je zde ekotoxicita) > Definuje hodnocení účinků na vyšší rostliny > Test inhibice růstu kořene hořčice bílé výluhem odpadu (Metodika v Metodickém pokynu MŽP ke stanovení ekotoxicity odpadů - Zpravodaj MŽP 12/1998) ■ Kontaktní testování odpadů bylo dosud opomíjeno, ač má pro pevné odpady nesrovnatelně vyšší vypovídací schopnost, zejména v případě kalů, sedimentů, stavebních odpadů apod. ■ Hnojiva - pouze obecně definováno, že nesmí mít negativní vliv ■ Vyhláška č. 257/2009 Sb., O používání sedimentů na zemědělské půdě: chvostoskok, roupice, rostlina a mikroorganismy Centrum pro výzkum toxických látek v prostředí ^ Legislativa vs půdní biotesty - EU ■ Council Directive 2001/59/EC adapting to technical progress for the 28th time Council Directive 67/548/EEC on the approximation of the laws, regulations and administrative provisions relating to the classification, packaging and labelling of dangerous substances > Příloha V obsahuje metody včetně ekotoxikologických biotestů s žížalami a půdními mikroorganismy dle směrnic OECD ■ Council Regulation (EEC) 793/93 on the evaluation and control of the risks of existing substances ■ Regulation (EC) 1907/2006 of the European Parliament and of the Council concerning the Registration, Evaluation, Authorisation and Restriction of Chemicals (REACH) ■ Technical Guidance Document on Risk Assessment. Part II: Environmental Risk Assessment. European Chemical Bureau, Luxembourg (2003) = TGD Centrum pro výzkum toxických látek v prostredt Legislativa vs půdní biotesty - EU COUNCIL DIRECTIVE 91/414/EEC of 15 July 1991 concerning the placing of plant protection products on the market Příloha 1 - seznam účinných látek hodnocených na evropské úrovni, které byly seznány, že rizika jsou přijatelná a není třeba je dále hodnotit na národní úrovni Příloha 2 - seznam studií, které musí žadatel dodat pro hodnocení účinné látky Příloha 3 - seznam studií, které musí žadatel dodat pro hodnocení přípravku Příloha 61 - podle čeho a jak se hodnotí na základě EC2 a SETAC3 metodik. Povinnými testovacími druhy necílových členovců jsou Typhlodromuspyri (dravý roztoč), Aphidius rhapalosiphi{\un\c\V), Chrysoperla carnea (zlatoočka), Coccinela septempunctata (slunéčko), Aleochara bilineata, Poecilus cupreus (střevlík), Orius laevigatus (klopuška), Hypoaspis aculeifer 1. Guidance document on Terrestrial Ecotoxicology in the context of Directive 91/414/EEC (SANCO/10329/2002) 2. Council Directive 97/57/EC of 22 September 1997 establishing Annex VI to Directive 91/414/EEC concerning the placing of plant protection products on the market 3. Guidance Document on Regulatory Testing and Risk Assessment Procedures for Plant Protection Products with Non-Target Arthropods. From the ESCORT 2 Workshop (European Standard Characteristics of Non-Target Arthropod Regulatory Testing). Ed: MP Candolfi, KL Barrett, PJ Campbell, R Forster, N Grandy, M-C Huet, G Lewis, PA Oomen, R Schmuck, H Vogt. SETAC-Europe Centrum pro výzkum toxických látek v prostředí ^ Legislativa vs půdní biotesty - EU ■ Směrnice 91/689/EEC o nebezpečném odpadu a seznamu odpadů (rozhodnutí 2000/532/EC) ■ Rozhodující je 14 kriterií, která jsou odvozena z legislativy o nebezpečných látkách. ■ Kritérium H14 značí „ekotoxické vlastnosti" - odpady, které představují nebo mohou představovat akutní nebo pozdní nebezpečí pro jednu nebo více složek životního prostředí. ■ Zatím není definován odkaz k žádné metodě a ani v seznamu odpadů nejsou ekotoxické vlastnosti blíže specifikovány pro rozhodnuti, zda se jedná či nejedná o nebezpečný odpad. ■ Příloha III direktivy 91/689/EEC pouze uvádí, že testovací metody by měly korespondovat s metodami legislativy pro chemické látky a dalšími doporučeními OECD. ■ Standard EN 14735 definuje přípravu a nakládání se vzorky odpadů pro ekotoxikologické testy. V příloze B je obsažen i seznam použitelných ekotoxikologických testů. Z půdních jsou zde roupice, žížaly, chvostoskoci a rostliny I Centrum pro výzkum toxických látek | v prostředí EU ringtest 2006-2007 . I- Cíle: zhodnotit standard EN 14735 vyhodnotit aplikovatelnost baterie testů ^13 zemí 59 laboratoří 5 základních testů 9 přídavných testů půl tuny odpadů (3 vzorky) XBAM MV\ ECTGmbH Ecotoxicotogicdl Characterization of Waste mmCm Výstupy: ■ Kniha, report a zejména příprava nového EN standardu:" 292050: Characterisation of waste - Guidance on the use of ecotoxicity tests applied to waste (a Centrum pro výzkum toxických látek v prostředí EU - Základní sada testů Testy pevného odpadu Organismus Typ testu Endpointy Doba trvaní Výsledek Norma w fh h zízala Eisema fetida akutní mortalita 14 dní LC5Ü ISO 11268-1 [15] rostlina Ávena sativa, Biasicca rapa akutní vyklíčení inhibice růstu cca 14 dul EC50 ISO 11269-2 [16] Testy vadného výluhu odpadu Organismus Typ testu Endpointy Doba trvaní Výsledek Norma bakterie Vibrio fisheri akutní inhibice hunini scénce 30 min EC50 ISO 11348 [17] korýš Daphnio magna akutní/chróme to inhibice mobility 4S hod EC50 ISO 6341 [18] rasa Desmodeswus subcapitals Pseudokirch n erielh. subcapitata chronický růst EC20 3 dny ISO 8692 [19] EU - Rozšířená sada testů T ŕ sty pevného odpadu Organismus Typ testu E n i\\ io in ty Doba trvání Výsledek Norma zízala Eisenia fstida chronický reprodukce biomasa 56 dní EC50 ISO 11268-2 [201 zízala Eisenia fstida chronický únikové chování 2 dny I30.DIS 17512-1 [211 roupice Enchytraeiís albidus Enchytraeits crypúcus akutní/ chronický mortalita reproducke 4 týdny 6 týdnů LC/EC50 ISO 16387 [22] chvostoskok FoJsomia Candida chronický mortalita reprodukce 28 dní LC/EC50 ISO 11267 [23] Tes ry vodného výluhu odpadu Organismus Typ testu E n i\\ io in ty Doba tnáuí Výsledek Norma okřehek Lewma minor chronický růst 7dní EC50 ISO 20079 [24] umu Salmonella typhimurium genotoxicita -aktivace genů 4hod ISO 13829 [25] bakterie Pssudomans putida chronický růst 16 hod ISO 10712 [26] (©) Centrum pro výzkum toxických látek v prostředí Příprava nové legislativy v ČR VÚV v.vX - CfcHO Centrum pro hospodárení s odpady Aktivity CeHO MZP0002071102 - Výzkum pro hospodaření s odpady v rámci ochrany životního prostředí a udržitelného rozvoje Porovnání 18 testů na 18 odpadech Vybraná sada testů: - Test toxicity na perloočkách: ČSN EN ISO 6341 - Test toxicity na řasách: ČSN EN ISO 8692 ■ Test zhášení bioluminiscence baktérií: ČSN EN ISO 11348-1-3 ■ Test reprodukční toxicity na chvostoskocích: ISO 11267 ■ Test reprodukční toxicity na roupicích: ISO 16387 ■ Test inhibice růstu kořenů suchozemských rostlin: ISO 11269-1 Centrum pro výzkum toxických látek v prostředí "3 ISO 16387 (2004) p :h ISO 11267 (1999) ■ , , i i ( ISO 11269-1 (1993) (©) Centrum pro výzkum toxických látek v prostředí l- Dostupné standardní postupy půdních biotestů TERSTVO ŠKOLSTVÍ. OP Vzděláváni ■»Wtf I ZH5 ivi| % iMji ř00!?'"^ | MINISTERSTVO ŠKOLSTVÍ, OP Vzděláváni "í^kJ^J^ř tondVCR EVROPSKÁ UNIE MLÁDEŽE a TĚLOVÝCHOVY pro konkurenceschopnost 'Mna**" INVESTICE DO ROZVOJE VZDĚLÁVÁNÍ Inovace tohoto předmětu je spolufinancována Evropským sociálním fondem a státním rozpočtem České republiky Půdní potravní síť vs dostupné biotesty Organic Matter Waste, residue and metabolites from plants, animals and microbes. First trophic level: Photosynthesizers Second trophic level: Decomposers Mutualists Pathogens, parasites Root-feeders Third trophic level: Shredders Predators Grazers Fourth trophic level: Higher level predators Fifth and higher trophic levels: Higher level predators Pudní mikroorganismy Standardy půdních metod - ISO ISO 10381-6:2009 Soil quality - Sampling - Part 6: Guidance on the collection, handling and storage of soil under aerobic conditions for the assessment of microbiological processes, biomass and diversity in the laboratory ISO 14240-1:1997 Soil quality - Determination of soil microbial biomass - Part 1: Substrate-induced respiration method ISO 14240-2:1997 Soil quality - Determination of soil microbial biomass - Part 2: Fumigation-extraction method ISO 16072:2002 Soil quality - Laboratory methods for determination of microbial soil respiration ISO 17155:2002 Soil quality - Determination of abundance and activity of soil microflora using respiration curves ISO 15685:2004 Soil quality - Determination of potential nitrification and inhibition of nitrification - Rapid test by ammonium oxidation ISO 14238:1997 Soil quality - Biological methods - Determination of nitrogen mineralization and nitrification in soils and the influence of chemicals on these processes ISO 23753-1:2005 Soil quality - Determination of dehydrogenase activity in soils - Part 1: Method using triphenyltetrazolium chloride (TTC) ISO 23753-2:2005 Soil quality - Determination of dehydrogenase activity in soils - Part 2: Method using iodotetrazolium chloride (INT) ISO/DIS 11063 Soil quality - Method to directly extract DNA from soil samples ISO/TS 29843-1:2010 Soil quality - Determination of soil microbial diversity - Part 1: Method by phospholipid fatty acid analysis (PLFA) and phospholipid ether lipids (PLEL) analysis ISO/PRF TS 29843-2 Soil quality - Determination of soil microbial diversity - Part 2: Method by phospholipid fatty acid analysis (PLFA) using the simple PLFA extraction method ISO/TS 10832:2009 Soil quality - Effects of pollutants on mycorrhizal fungi - Spore germination test ISO/TS 22939:2010 Soil quality - Measurement of enzyme activity patterns in soil samples using fluorogenic substrates in micro-well plates ISO 11266:1994 Soil quality - Guidance on laboratory testing for biodegradation of organic chemicals in soil under aerobic conditions ISO 15473:2002 Soil quality - Guidance on laboratory testing for biodegradation of organic chemicals in soil under anaerobic conditions ISO 14239:1997 Soil quality - Laboratory incubation systems for measuring the mineralization of organic chemicals in soil under aerobic conditions f^&\\ centrum pro výzkum W*""^) toxických látek ^^fcj^/ v prostředí metod - ISO Suchozemské rostliny ISO 11269-1:1993 Soil quality - Determination of the effects of pollutants on soil flora - Part 1: Method for the measurement of inhibition of root growth ISO 11269-2:2005 Soil quality - Determination of the effects of pollutants on soil flora - Part 2: Effects of chemicals on the emergence and growth of higher plants ISO 17126:2005 Soil quality - Determination of the effects of pollutants on soil flora - Screening test for emergence of lettuce seedlings (Lactuca sativa L.) ISO 22030:2005 Soil quality - Biological methods - Chronic toxicity in higher plants ISO/CD 29200_ Soil quality - Assessment of genotoxic effects on higher plants - Micronucleus test on Vicia faba (a Centrum pro výzkum toxických látek v prostředí Půdní bezobratlí Standardy půdních metod - ISO rasi ISO 11268-1:1993 Soil quality - Effects of pollutants on earthworms (Eisenia fetida) - Part 1: Determination of acute toxicity using artificial soil substrate ISO 11268-2:1998 Soil quality - Effects of pollutants on earthworms (Eisenia fetida) - Part 2: Determination of effects on reproduction ISO 11268-3:1999 Soil quality - Effects of pollutants on earthworms - Part 3: Guidance on the determination of effects in field situations ISO 11267:1999 Soil quality - Inhibition of reproduction of Collembola (Folsomia Candida) by soil pollutants ISO 16387:2004 Soil quality - Effects of pollutants on Enchytraeidae (Enchytraeus sp.) - Determination of effects on reproduction and survival ISO 15952:2006 Soil quality - Effects of pollutants on juvenile land snails (Helicidae) - Determination of the effects on growth by soil contamination ISO 20963:2005 Soil quality - Effects of pollutants on insect larvae (Oxythyrea funesta) - Determination of acute toxicity ISO 17512-1:2008 Soil quality - Avoidance test for determining the quality of soils and effects of chemicals on behaviour -Part 1: Test with earthworms (Eisenia fetida and Eisenia andrei) ISO/DIS 17512-2 Soil quality - Avoidance test for determining the quality of soils and effects of chemicals on behaviour -Part 2: Test with collembolans (Folsomia Candida) ISO 23611-1:2006 Soil quality - Sampling of soil invertebrates - Part 1: Hand-sorting and formalin extraction of earthworms ISO 23611-2:2006 Soil quality - Sampling of soil invertebrates - Part 2: Sampling and extraction of micro-arthropods (Collembola and Acarina) ISO 23611-3:2007 Soil quality - Sampling of soil invertebrates - Part 3: Sampling and soil extraction of enchytraeids ISO 23611-4:2007 Soil quality - Sampling of soil invertebrates - Part 4: Sampling, extraction and identification of soil-inhabiting nematodes ISO/DIS 23611-5 Soil quality - Sampling of soil invertebrates - Part 5: Sampling and extraction of soil macro-invertebrates ISO/DIS 23611-6 Soil quality - Sampling of soil invertebrates - Part 6: Guidance for the design of sampling programmes with soil invertebrates (a Centrum pro výzkum toxických látek v prostředí Standardy půdních biotestů - Čí CSN ISO 16387 CSN ISO 11267 Kvalita půdy - Vliv znečišťujících látek na Enchytraeidae (Enchytraeus sp.) Stanovení vlivu na reprodukci a na přežití _ Kvalita půdy - Inhibice reprodukce chvostoskoků (Folsomia candida) látkami znečišťujícími půdu_ (©) Centrum pro výzkum toxických látek v prostředí 25 Standardní metody OECD 3v/ OECD Test No. 208: Terrestrial Plant Test: Seedling Emergence and Seedling Growth Test 2006 Test No. 227: Terrestrial Plant Test: Vegetative Vigour Test 2006 Test No. 207: Earthworm, Acute Toxicity Tests 1984 Test No. 220: Enchytraeid Reproduction Test 2004 Test No. 222: Earthworm Reproduction Test (Eisenia fetida/Eisenia andrei) 2004 Test No. 228: Determination of Developmental Toxicity of a Test Chemical to Dipteran Dung Flies(Scathophaga stercoraria L. (Scathophagidae), Musca autumnalis De Geer (Muscidae)) 2008 Test No. 232: Collembolan Reproduction Test in Soil 2009 Test No. 226: Predatory mite (Hypoaspis (Geolaelaps) aculeifer) reproduction test in soil 2008 Test No. 216: Soil Microorganisms: Nitrogen Transformation Test 2000 Test No. 217: Soil Microorganisms: Carbon Transformation Test 2000 Test No. 317: Bioaccumulation in Terrestrial Oligochaetes 2010 Test No. 304A: Inherent Biodegradability in Soil 1981 httD://www.oecd.org/document/40/0,3746,en 2649 34377 37051368 1 1 1 1.00.html (O Centrum pro výzkum toxických látek v prostředí Standardizované postupy v ČR Vyhláška 222/2004 Sb., příloha 2: ČÁST I. METODY PRO ZKOUŠENÍ VLASTNOSTÍ NEBEZPEČNÝCH PRO ŽIVOTNÍ PROSTŘEDÍ I. METODA PRO STANOVENÍ AKUTNÍ TOXICITY PRO RYBY II. METODA PRO STANOVENÍ AKUTNÍ TOXICITY PRO DAFNIE III. METODA PRO STANOVENÍ INHIBICE RŮSTU ŘAS IV. -VII. METODY PRO STANOVENÍ „SNADNÉ" BIOLOGICKÉ ROZLOŽITELNOSTI, ROZLOŽITELNOSTI, ABIOTICKÉHO ROZKLADU VIII. METODA PRO STANOVENÍ TOXICITY PRO ŽÍŽALY IX. -XII. METODY PRO STANOVENÍ BIOLOGICKÉ ROZLOŽITELNOSTI XIII. METODA PRO STANOVENÍ BIOAKUMULACE - PRŮTOKOVÁ ZKOUŠKA NA RYBÁCH XIV. METODA PRO STANOVENÍ RŮSTU NA NEDOSPĚLÝCH RYBÁCH XV. METODA PRO STANOVENÍ TOXICITY NA RYBÍCH EMBRYÍCH A POTĚRU XVI. METODA PRO STANOVENÍ AKUTNÍ ORÁLNÍ TOXICITY PRO VČELU MEDONOSNOU XVII. METODA PRO STANOVENÍ AKUTNÍ KONTAKTNÍ TOXICITY PRO VČELU MEDONOSNOU XVIII. METODA PRO STANOVENÍ ADSORPCE / DESORPCE V ROVNOVÁŽNÉM STAVU XIX. METODA PRO STANOVENÍ ODHADU ADSORPČNÍHO KOEFICIENTU (KOU) PRO PŮDY A ČISTÍRENSKÉ KALY XX. METODA PRO STANOVENÍ TOXICITY PRO REPRODUKCI U DAPHNIA MAGNA XXI. METODA PRO STANOVENÍ AKTIVITY PŮDNÍCH MIKROORGANISMŮ PŘI TRANSFORMACI DUSÍKU XXII. METODA PRO STANOVENÍ AKTIVITY PŮDNÍCH MIKROORGANISMŮ PŘI TRANSFORMACI UHLÍKU XXIII. METODA PRO STANOVENÍ AEROBNÍ A ANAEROBNÍ TRANSFORMACE CHEMICKÉ LÁTKY V PŮDĚ XXIV. METODA PRO STANOVENÍ AEROBNÍ A ANAEROBNÍ TRANSFORMACE V SYSTÉMECH VODA-SEDIMENT Vyhláška 389/2005 Sb. přidává: (©) Centrum pro výzkum toxických látek v prostředí 27 Standardy půdních biotestů - US EPA 850.2450 - Terrestrial (Soil-Core^ Microcosm Test (PDF) (19 ppf 12310 850.4000 - Backaround-Nontaraet Plant Testina (PDF) (15 pp, 50IO 850.4025 - Taraet Area Phytotoxicitv (PDF) (15 po, 51IO 850.4100 - Terrestrial Plant Toxicity. Tier I (Seedlina Emeraence') (PDF) (8 pp. 2910 850.4150 - Terrestrial Plant Toxicity, Tier I (Veaetative Viaor) (PDF) (8 ppf 2810 850.4200 - Seed Germination/Root Elonaation Toxicity Test (PDF) (8 pp. 29K) 850.4225 - Seedlina Emeraence, Tier II (PDF) (10 pp, 3610 850.4230 - Early Seedlina Growth Toxicity Test (PDF) (9 pp. 3310 850.4250 - Veaetative Viaor, Tier II (PDF) (10 pp. 3510 850.4300 - Terrestrial Plants Field Study, Tier III (PDF) (8 pp, 2710 850.4600 - Rhizobium-Leaume Toxicity (PDF) (14 pp, 73K) 850.4800 - Plant Uptake and Translocation Test (PDF) (13 pp, 3510 850.5100 - Soil Microbial Community Toxicity Test (PDF) (11 dd, 46K) 850.6200 - Earthworm Subchronic Toxicity Test (PDF) (13 pp, 4310 httD://www.eDa.aov/ocsDD/Dubs/frs/home/draftauidelines.htm (a Centrum pro výzkum toxických látek v prostředí 28 EPPO standards Scheme for the environmental risk assessment of plant protection products [Number PP 3/1(2) PP 3/2(2) PP 3/12(1) PP 3/3(2) PP 3/4(2) PP 3/5(2) PP 3/6(2) PP 3/7(2) PP 3/9(2) PP 3/10(3) PP 3/11(2) (a Centrum pro výzkum toxických látek v prostředí Title of Standard Chapter 1 - Introduction Chapter 2 - Guidance on identifying aspects of environmental concern Chapter 3 - Air Chapter 4 - Soil Chapter 5 - Ground water Chapter 6 - Surface water and sediment Chapter 7 - Aquatic organisms Chapter 8 - Soil organisms and functions Chapter 9 - Non-target terrestrial arthropods Chapter 10 - Honeybees Chapter 11 - Terrestrial vertebrates PP 3/13(1) 29 Přirození nepřátelé škůdců z řad členovců, kteří jsou standardizováni ve směrnicích IOBC, BART, EPPO (Sams0e-Petersen, 1990) (©) Centrum pro výzkum toxických látek v prostředí Crop Type of natural enemies Examples1 Cereals Polyphagous predators Pterostichus cupreus** Bembidion lam pros* Tachyporus hypnorum Aleochara bilineata* Linyphiid spiders* L ycosid spiders* Chrysoperla carnea* Aphid-specific predators Coccinella septempunctata* Episyrphus balteatus Eupeodes corollae* Aphid parasitoids Aphidius spp.+* Vegetables Polyphagous predators As for cereals Aphid parasitoids Aphidius spp.+ Diaeretiella rapae* Lepidopteran parasitoids Trichogramma cacoeciae* Orchards Predatory mites Typhlodromus pyri** Amblyseius potentillae* Aphid-specific predators As for cereals Lepidopteran parasitoids As for vegetables Polyphagous predators Anthocoris spp.+ Oriussp* Glasshouses Predatory mites Phytoseiulus persimilis Whitefly parasitoids Encarsia formosa Aphid-specific predators As for cereals (except syrphids) Aphidoletes sp. Aphid parasitoids As for vegetables Leaf miner parasitoids Dacnusa, Diglyphus Optus* Organizace spojené s půdními testy OECD = Organization for Economic Cooperation Development ISO = International Standardization Organization US EPA = US Environmental Protection Agency SETAC = Society for Environmental Toxicology and Chemistry IOBC = International Organisation for Biological and Integrated Control of Noxious Animals and Plants EPPO = European and Mediterranean Plant Protection Organization ASTM = American Society of Testing and Materials ANSI = American National Standards Institute CEN = European Commitee for Standardization AFNOR = Association Francaise de Normalisation EEC = European Economic Community WHO = World Health Organisation BBA = Biologische Bundesanstalt für Land- und Forstwirtschaft OPPTS = The Office of Prevention, Pesticides and Toxic Substances (EPA) BART = Beneficial Arthropod Regulatory Testing Centrum pro výzkum toxických látek v prostredt r testů do procesů hodnocení rizik ■ Optimální vlastnosti půdního testu jsou: ■ standardizovatelnost, opakovatelnost, variabilita ■ praktická proveditelnost, cena, rychlost ■ citlivost ■ vypovídací hodnota, použitelnost pro ochranu ŽP ■ ekologická relevance (samozřejmě platí vlastně i pro všechny další biotesty) Centrum pro výzkum toxických látek v prostředí Příklad: sada testů z Vyhlášky 257/2009 Sb ■ Před testy s roupicemi a vyššími rostlinami jsou reprezentativní vzorek sedimentu i reprezentativní vzorek referenční půdy (půda, na kterou má být sediment použit) vysušeny při laboratorní teplotě, zhomogenizovány a přesáty přes síto 2 či 4 mm. ■ Pro testy inhibice nitrifikace je referenční půdou nekontaminovaná půda splňující požadavky ISO 15685 (2004) a jak sediment tak referenční půda jsou vzorkovány, zpracovány a skladovány v souladu s ISO 10381-6 (2009): v přirozené vlhkosti, přes 2 mm síto, uchování v 4 °C maximálně dva týdny. ■ Před testováním se hodnocený sediment smíchá s půdou v objemovém poměru 1:3, který vychází z maximálního povoleného poměru výšky použitého sedimentu a orničního profilu v vyhlášce. relevance testů ■ testované druhy by měly reprezentovat relevantní funkční skupinu ■ test má respektovat ekologii organismu ■ sledované odpovědi by měly být ekologicky relevantní a indikovat stav a funkci organismu (přežití, růst, reprodukce, přijímání potravy a mobilita) ■ při sledování reprodukce by měla expozice pokrývat většinu životního cyklu ■ abiotické a biotické faktory by měly v testu být podobné jako v habitatu ■ expoziční cesty by měly napodobovat reálné expozice ■ biodostupnost kontaminantu by měly být podobná jako v reálu ■ koncentrace by měly být environmentálne reálné (u půdy obecně pro všechny látky lze jako maximum dát 1 g/kg půdy) Centrum pro výzkum toxických látek v prostředí Ekologická relevance organismů ■ hrají klíčovou roli ve fungování půdního ekosystému ■ vyskytují se v řadě ekosystémů ve vyšší abundanci ■ lehce použitelné v polních i laboratorních podmínkách ■ dostávají se do kontaktu s polutanty ■ jsou dostatečně citlivé na stres Problém ekotoxikologie obecně: ■ v testech použiji organismy A (z celé řady důvodů), ale cílové organismy v systému jsou B jaký je vztah výsledků pro A a B ■ Příklad: Eisenia fetida - nejznámější půdní test Centrum pro výzkum toxických látek v prostředí Eisenia fetida - žije v kompostu !! Aporrectodea caliginosa (©) Centrum pro výzkum toxických látek v prostředí 1- Základní koncepce půdních biotestů TERSTVO ŠKOLSTVÍ. OP Vzděláváni ■»Wtf I ZH5 ivi| % iMji ř00!?'"^ | MINISTERSTVO ŠKOLSTVÍ, OP Vzděláváni "í^kJ^J^ř tondVCR EVROPSKÁ UNIE MLÁDEŽE a TĚLOVÝCHOVY pro konkurenceschopnost 'Mna**" INVESTICE DO ROZVOJE VZDĚLÁVÁNÍ Inovace tohoto předmětu je spolufinancována Evropským sociálním fondem a státním rozpočtem České republiky Koncepce půdních biotestů (©) Centrum pro výzkum toxických látek v prostředí Stresor Odpověď +/- lAiiBjiCj +/- lAiiBjiCj ABC ABC ABC ■ Jde o prospektivní přístup k HODNOCENÍ EKOLOGICKÝCH RIZIK ■ CÍL: Určit, jaká koncentrace chemické látky v půdě je bezpečná ■ K tomu slouží soubor půdních ekotoxikologických testů a následně metodika hodnocení ekologických rizik Centrum pro výzkum toxických látek v prostředí Půdní biotesty - koncepce Response Dose i. Testuje se chemická latka koncentrační rada, napr. 1, 10, 100, 1000 mg Cd / kgsuché pudy Testuje se materiál typu kontaminovaná půda, sediment, kal ČOV apod. koncentrační řada vzniká „ředěním" s referenční půdou, např. 10, 20, 40, 80, 100 % kalu s čistou půdou (©) Centrum pro výzkum toxických látek v prostředí Proč testy kontaktní ? výluh 1:10 smíchání v různých poměrech testy výluhů nelze simulovat toxicitu pevných vzorků PROČ? -» reálná BIODOSTUPNOST -> integrován EFEKT MATRICE (©) Centrum pro výzkum toxických látek v prostředí Testování toxicity tuhé matrice Biotesty jako nástroj hodnocení kvality tuhé matrice Existuji ISO normy určující vyber testu ■ ISO 15799 (2003): Guidance on the ecotoxicological characterization of soils and soil materials ■ ISO 17616 (2008): Guidance on the choice and evaluation of bioassays for ecotoxico logical characterization of soils and soil materials (©) Centrum pro výzkum toxických látek v prostředí Biotesty jako nástroj hodnocení kvality tuhé matrice Retention function - Biotests with eluates Ecotoxic contents Genotoxic contents Luminescent Algal inhibition test U m u-test Habitat function - Biotests with solids Site inherent test organisms Added test organisms Bacteria contact test Earthworm avoidance test Respiration test Nitrification test (O Centrum pro výzkum toxických látek v prostředí Plant test Earthworm test Collembolan test ^ Expoziční systémy ■ Chemikálie smíchána s půdou - Artificiální půda (OECD, ISO) ■ Reálná půda (LUFA 2.2 či jakákoliv jiná) I Centrum pro výzkum toxických látek j v prostředí Expoziční cesty v pevném vzorku Ingesce a orální vstup ■ potrava a půdní částice - organismy konzumují minerální a organickou hmotu - významná expoziční cesta pro sorbované chemikálie; kontaminanty se mohou bioobohacovat - např. v houbách, které konzumují chvostoskoci; významná cesta pro členovce Dermální vstup ■ z půdy, z půdního roztoku - zejména organismy vrtající v půdě (žížaly a roupice), které mají tenkou kutikulu a jsou v kontaktu s půdou a pórovou vodou; lze modelovat výsledky i z testů v akvatickém prostředí při doplnění modelu distribuce látky mezi půdní roztok a sorpci na částice = tzv. Equilibrium partitioning theory (EqP) Dýcháním ■ nejsou téměř žádná data Centrum pro výzkum toxických látek v prostředí || Artificiální půda_ ■ 10% Suchá a jemně namletá rašelina ■ 20% Kaolinitový jíl obsahující minimálně 30% kolinitu ■ 70% Křemenný písek jemný obsahující minimálně 50% zrn o velikosti 0,05 - 0,2 mm ■ 0,3 - 1% Uhličitanu vápenatého, který je přidán tak, aby výsledné pH bylo 6 ± 0,5 Artificial ní vs reálná půda: Složení artificiální půdy je předmětem výzkumu (©) toxických látek v prostředí 11 LUFA Standardní pŮdy (http://lufa-speyer.de/) ■ Landwirtschaftliche Untersuchungs und Forschungsanstalt Speyer ■ přírodní půdy je potřeba před testy ošetřit: defaunace, úprava vlastností ■ Cena: 4 EUR za 1 kg + doprava LUFA 2.1 LUFA 2.2 LUFA 2.3 LUFA 5M LUFA 6S organic carbon (%) 0.81 ± 0.21 2.16 + 0.40 0.98 + 0.05 1.29 + 0.20 1.75 + 0.11 particles < 0.02 mm (%) 8.2 ± 0.9 13.9 + 1.1 22.7+1.1 25.3 + 1.8 65.1 + 2.7 pH (0.01M CaCI2) 5.1+ 0.4 5.4 + 0.1 6.4 + 0.6 7.2 + 0.1 7.2 + 0.1 cation exchange capacity (meq/lOOg) 4+ 1 10+1 8 + 2 15 + 3 22 + 6 water holding capacity (g/lOOg) 33.2 + 1 48.2 + 5 34.4 + 2 42.1 + 4 40.7 + 5 weight per volume (g/lOOOml) 1404 + 46 1197 + 60 1291 + 30 1212 + 56 1264 + 90 Particle size (mm) distribution according to German DIN (in %): < 0.002 3.0 + 0.9 6.4 + 0.9 9.4 + 0.9 10.8 + 1.3 42.1 + 1.8 0.002 - 0.006 2.2 + 0.7 3.5 + 0.7 4.2 + 0.8 5.4 + 0.3 10.8 + 0.7 0.006 - 0.02 2.9 + 0.7 3.8 + 0.7 9.1 + 0.5 9.1 + 0.5 12.1 + 1.3 0.02 - 0.063 5.3 + 1.8 5.4 + 1.2 18.6 + 2.3 19.5 + 1.3 14.1 + 2.5 0.063 - 0.2 27.0 + 3.1 35.4 + 2.3 29.3 + 3.4 38.9 + 1.0 8.7 + 0.9 0.2 - 0.63 57.2 + 4.3 44.8 + 2.7 26.9 + 0.7 14.9 + 1.0 9.0 + 0.3 0.63 - 2.0 2.4 + 0.6 0.7 + 0.1 2.5 + 0.8 1.4 + 0.1 3.2 + 0.7 soil type sand (S) loamy sand (IS) loamy sand (IS) silty sand (uS) clayey loam (tL) Particle size (mm) < istribution according to USĎA (in %) < 0.002 3.0 + 0.9 6.4 + 0.9 9.4 + 0.9 10.8 + 1.3 42.1 + 1.8 0.002 - 0.05 8.8 + 1.8 12.2 + 0.6 29.8 + 3.0 27.5 + 2.2 36.0 +2.3 0.05 - 2.0 88.2 + 1.2 81.4+1.2 60.8 + 2.6 61.7+3.2 21.9 + 1.6 soil type sand loamy sand sandy loam sandy loam clay European reference soil set (IRMM-443-EUROSOILS) (a Centrum pro výzkum toxických látek v prostředí ■ cílem je HOMOGENITA expozice testovanou látkou Dávkování látek do ve vodě rozpustné I^Ib ■ pro přídavek využita destilovaná voda, kterou současně adjustujeme potřebné ovlhcení půdy, přičemž by jejich koncentrace v pridávané vodě neměla přesahovat 50% saturační koncentrace nerozpustné ve vodě 1. suspendovány ve vodním roztoku pomocí nosiče, který není toxický, je rozpustný ve vodě (aceton, etanol, arabská guma) a je volatilní 2. rozpuštěny v organickém rozpouštědle, které není toxické a rychle se odpaří V předchozích případech lze aplikovat: 1. do malého množství (1-10%) jemného křemenného písku; po odpaření rozpouštědla je tato směs přidána do půdy a promíchána 2. přímo do vzorku půdy (suchý či vlhký) s následným odparem a promícháním Ve všech případech je nutno zařadit kontrolu na nosič respektive na rozpouštědlo nerozpustné ve vodě ani ve vhodném rozpouštědle ■ lze smíchat přímo s křemenným pískem (2,5g písku na 20g půdy) Centrum pro výzkum toxických látek v prostředí Testovací design obecně ■ Mladí ale dospělí jedinci (většinou 10) jsou exponováni chemikálii (či kontaminované zemině) smíchané s artificiáln půdou v nádobkách ze skla či inertního materiálu (+ potrava) ■ Předběžný test - hledáme rozmezí používaných koncentrací (ředící faktor 10; 0,1 - 1000 mg/kg); mortalita hlavní endpoint hodnocený po krátke době (např. 2 týdnech) ■ Finální test - výstupem je funkce závislosti účinků na koncentraci testované substance (jemnější škála; nejlépe s faktorem 2); hodnoceny přežití dospělců (mortalita - akutní test) a počty juvenilů (reprodukce - reprodukční test) ■ NOEC design - méně koncentrací, ale více opakování - např. 5 koncentrací po 5 opakováních a kontrolní varianta (bez chemické látky, na rozpouštědlo apod.) ■ EC/LC design - více koncentrací, méně opakování - regresní metody Centrum pro výzkum toxických látek v prostředí (©) Centrum pro výzkum toxických látek v prostředí 1- Půdní biotesty s mikroorganismy TERSTVO ŠKOLSTVÍ. OP Vzděláváni -h^U^i evr?p?xý | ZH5 ivi| % iMji ř00!?'"^ | MINISTERSTVO ŠKOLSTVÍ, OP Vzděláváni "í^kJ^J^ř tondVCR EVROPSKÁ UNIE MLÁDEŽE a TĚLOVÝCHOVY pro konkurenceschopnost 'Mna**" INVESTICE DO ROZVOJE VZDĚLÁVÁNÍ Inovace tohoto předmětu je spolufinancována Evropským sociálním fondem a státním rozpočtem České republiky Testy s půdními mikroorganismy OECD 216 (2000) Soil Microorganisms, Nitrogen Transformation Test OECD 217 (2000) Soil Microorganisms, Carbon Transformation Test ISO 14238 (1997) Determination of nitrogen mineralization and nitrification in soils and the influence of chemicals on these processes Soil sampling Storage Pre-incubation (7 days) START Centrum pro výzkum toxických látek v prostředí 10 g per replicate aerobic conditions 60% WHC; 22°C; dark Substance application > Negative control > Positive control > 7th day 14th day 21st day 28th day Microbial parameters na půdu ■ přirozená půda, která je vybrána tak, aby byla citlivá vůči kontaminaci a splňovala tzv. "nejhorší scénář", tj. maximální expozici mikroorganismů polutantu v této půdě: více než 70% písku . pH 5,5 - 7,0 . Corg 0,5 - 1,5% > Cbio/Corg více než 1% (dostatečné oživení) kationtová výměnná kapacita vyšší než 70 mmol/kg ■ v historicky známé době nekontaminovaná (adaptace společenstva) Alternativy: ■ vzhledem k možnosti přítomnosti resistentních mikroorganismů v reálném společenstvu existují postupy, kdy je do sterilizované přirozené půdy inokulována specifická kultura mikroorganismů {Pseudomonasputida, Bacillus cereuš) plynulý přechod k "solid phase testům (SPT)" toxicity s prokaryoty Centrum pro výzkum toxických látek v prostředí Endpointy v mikrobiálním testu ■ Standarně pouze mineralizace dusíku a uhlíku jako produkci C02 a sumy minerálních forem dusíku (NH4+, N02-, NO3-) ■ Lze ale stanovit i další parametry: ■ Mikrobiální biomasu ■ Substrátem indukovanou respiraci ■ Enzymatické aktivity ■ Kinetiku mineralizace C a N ■ Amonifikaci, nitrifikaci ■ Diverzitu . Výstupy: NOEC, LOEC, LC50, EC50, IC50 ... (©) Centrum pro výzkum toxických látek v prostředí Stanovení mikrobiální biomasy Fumigačně-extrakční metoda Soil sample Ó0% WHC; 2 mm sieved 3x 1 Ogj fumigation overnight 3 x 1 Og; no fumigation exfraction in 0.5M r^SO, Microbial biomass: Cbi =Ec/0.38 F minus NF exfr action in 0.5M r^SO, ISO 14240-2 1997 Determination of soil microbial biomass - Part 2: Fumigation-extraction method Bazálni a potenciální respirace Voda VZOREK 40% WHC Předinkubován Vzorek - 60% WHC Produkce C02 měřená 24 h/22°C Voda*- Glukóza Vzorek - 60% WHC + saturující množství glukózy í Produkce C02 měřená ^ 6 h / 22°C Bazálni respirace Potenciálni respirace ISO 14240-1 1997 Determination of soil microbial biomass - Part 1: Substrate-induced respiration method ISO 16072 2002 Laboratory methods for determination of microbial soil respiration Hodnocení mineralizace dusíku Vzorek půdy Předinkubace 60% WHC Předinkubace 60% WHC l Rozdíl = mineralizační ■ ■ potenciál Inkubace 28-30 dní; 25 °C Minerální N Stanovení N03-N + NH/- N | Inkubace^8-30 dní; 25 °C 4- 5* Pravidelné odběry v čase na produkci NOa - N + NH4+- N Pozn: Obě varianty lze provést i s přidaným substrátem (např. síran amonný, org. hmota). Doba inkubace pak bude kratší podle koncentrace substrátu. ISO 14238 1997 Determination of nitrogen mineralization and nitrification in soils and the influence of chemicals on these processes Krátké testy toxicity s půdními mikroorganismy - SIR kinetika A) Testování kontaminovaných půd 100 T ó" 10+ o u R.1 unpolluted soil (1) polluted soil (2} + 50 100 time [h] 150 200 B) Testování chemikálií .100 T T 9 #■ ■ ;n O S 10 4 * 1 i V M 1 llllllll RB * §111111 'rV^v'/«*!'.'' •',''. *! *!'' • -.-.■*',■!,*!.*.'..■!«!•!• Ji . , ,',■• 1 • *•'«'•* ■*! * ŕ * 1* • 'J'- ■' ■ !'•!•! •! • I* ľ'.,v..níiVľ 4-1-- 50 100 time |h] 150; —i ^200 ISO 17155 2002 Determination of abundance and activity of soil microflora using respiration curves Krátké testy toxicity s půdními mikroorganismy - Oxidace amoniaku ISO 15685 2004 Determination of potential nitrification and inhibition of nitrification - Rapid test by ammonium oxidation ■ Jde o míru nitrifikace = první krok nitrifikace ■ SNA = short term nitrification assay ■ PAO = potential ammonium oxidation půda inkubována v roztoku síranu amonného chlorečnan sodný inhibuje oxidaci dusitanu po 6 hod stanovení N02- Cchlo r ečnanN ,__sod ný (©) Centrum pro výzkum toxických látek v prostředí NO, NH4 (©) Centrum pro výzkum toxických látek v prostředí 1- Půdní biotesty s bezobratlými TERSTVO ŠKOLSTVÍ. OP Vzdělávání -h^U^i evr?p?xý | ZH5 ivi| % iMji ř00!?'"^ | MINISTERSTVO ŠKOLSTVÍ, OP Vzděláváni "í^kJ^J^ř tondVCR EVROPSKÁ UNIE MLÁDEŽE a TĚLOVÝCHOVY pro konkurenceschopnost ''Aukv* INVESTICE DO ROZVOJE VZDĚLÁVÁNÍ Inovace tohoto předmětu je spolufinancována Evropským sociálním fondem a státním rozpočtem České republiky Žížaly v ekotoxikologii ■ žížaly jsou asi nevíce a nejdéle ekotoxikologicky užívaný představitel půdní fauny Výhody a důvody: ■ celý vývojový cyklus probíhá v půdě - typický geobiont ■ zkonzumují velká množství půdy (vysoká expozice potravou a akumulace kontaminantů) ■ mají velmi úzký fyzikální kontakt s půdou (expozice pokožkou) ■ mají výrazné bioakumulační a biokoncantrační charaktery (jejich analýzou posuzujeme vliv delšího časového období) = patří mezi tzv. makrokoncentrátory ■ vysoký a významný podíl na tvorbě půdy, dekompozičních procesech, půdní úrodnosti ■ klíčové postavení v přenosu polutantů v potravních řetězcích ■ výskyt téměř ve všech půdách ve vysokých počtech i váhách ■ osvědčené, zavedené v laboratorních testech (nenáročný chov) •jÄTcidno se identifikují v reálných vzorcích (díky velikosti) || V různých testech různé endpointy ■ Mortalita ■ Reprodukce ■ Změny váhy ■ Behaviorální změny ■ Malformace ■ Fyziologické změny ■ Snížení imunity ■ Aktivity enzymů ■ Biochemické markery ■ Genotoxicita B ■ ■ ■ ■ I Centrum pro výzkum toxických látek | v prostředí E/sen/a fetida Výhody ■ Standardní druh ■ Snadná kultivace velkých počtů ■ Krátký životní cyklus Cocoon formation i 23 days incubation period t 4 days Eisenia fetida Temperature 25 *C Moisture * 76 % (Venter a Reinecke 1988] E)) Centrum pro výzkum toxických látek v prostředí - 60 dayš Clitefium development || Chov žížal_ Nevýhoda těchto jinak perfektních testů: nároky na prostor, čas ■ boxy 50x50x15 cm s těsnícími víky ■ médium 1:1 směs kravího či koňského hnoje a rašeliny ■ pH cca 7 ■ nekontaminovaná amoniakem či močí ■ pokud vše jde dobře za 6 týdnů až 1000 žížal (na 20 kg směsi) týdně 2-5 Rokonů s cca 4 juvenily na kokon ■ v optimálních podmínkách je dospělá za 2-3 měsíce ■ kulturu lze také získat ve vermikompostovacích firmách Synchronizace kultury: ■ začne se s kokony, za 3-4 týdny se vylíhnou, za 7-8 týdnů dospějí (20°C) Centrum pro výzlnim I «/ V x toxických látek v prostředí E, fetida akutní test v půdě dospělci E.f. jsou chovány 14 dní v artificiální půdě obsahující kontaminant (500 g půdy) před finálním testem provádíme test hledající rozmezí koncentrací kontaminace se udává v mg/kg; doporučené koncentrace jsou 0.1, 1, 10, 100, 1000 dávkování (rozpustné x nerozpustné x pevné ... klasika) vyšší koncentrace než 1000 mg/kg nejsou environmentálne relevantní a nemá smysl je testovat na 1 koncentraci 1 nádoba v předběžném testu a 4 nádoby ve finálním testu nádoba má 10 jedinců (dospělci: clitellum, váha 300 - 600mg, věk 2-12 měsíců, rozdíly ve věku by neměly být vetší než 4 týdny) kontinuální osvětlení (400-800lx) zabezpečuje setrvání jedinců celou dobu v půdě mortalita a váha po 7 a 14 dnech (nereagují na jemný mechanický stimul) se převede na LC50 doporučuje se užití referenční látky - chloracetamid (LC50 mezi 20 a 80mg/kg) kontrola - mortalita méně než 10% a úbytek váhy menší než 20% ISO 11268-1 1993 Effects of pollutants on earthworms (Eisenia fetida) - Part 1: Determination of acute toxicity using artificial soil substrate , £, fetida reprodukční test v nádobách 1-2L s povrchem 200cm2, vrstvička asi 5-6cm (500-600g) AS potrava 0,5g hnoje na jedince a na týden do nádoby 10 dospělců 1 týden předinkubace; předběžný test; finální test 20°C; 16:8 400-800lx; krmení 5g sušeného hnoje týdně po cca 4 týdnech mortalita, zvážení, spočítají se kokony + juvenilové; oddělají se dospělci kokony se inkubují další čtyři týdny - extrakce juvenilů ručním tříděním výsledky jsou váha dospělců a počet juvenilů na dospělce KONTROLA musí mít cca 30 juvenilů/dospělce; koeficient variance pro reprodukci <30% a mortalita dospělců po 4 týdnech by neměla být větší než^ 10% REFERENČNÍ LÁTKA je doporučován carbendazim; má mít statisticky významný efekt v koncentraci 1-5 mg/kg ISO 11268-2 1998 Effects of pollutants on earthworms (Eisenia fetida) - Part 2: Determination of effects on reproduction Reprodukční test 8ři íi ä ** íB if Příprava půd Přídavek 10 adultů do nádoby na test (©) Centrum pro výzkum toxických látek v prostředí Měření WHC půd Zváženi jedinců Ovlhčená AS rozvážená do testovacích nádob Výběr 10 reprezentativních adultů z chovu a jejich omytí Zvážení žížal Zhodnocení mortality Centrum pro výzkum toxických látek v prostředí Reprodukční test Vodní lázeň s narůstající teplotou 40°C až 60°C Po cca 20 min juvenilové na povrchu Přesátí půdy Ruční tříděni kokonu Centrum pro výzkum toxických látek v prostředí Příklad hodnocení pesticidů Prüfung der Auswirkungen f auf Regenwürmer Labortest mit Kompostwurm Kokons des Kompostwurms ein he im ische Regen wurm a rt 1. Akute Toxizität (2 Wochen) Bewertunq: JER = U^L < 1Q [ Mortalität, PEC Körpergewicht 2. Einfluss auf die Fortpflanzung (8 Wochen) Bewertung: Anzahl der Jungtiere, Körpergewicht TER = NOEC PEC < 5 3. Auswirkungen im Freiland (1 Jahr) Bewertung: Individuenzahlen, Risiken für Populationen und Lebensgemeinschaften Earthworm Avoidance Test Guideline: Species: Substrate: Duration: Parameter: Test vessels: ISO/DIS 17512 (draft) E. fetida / E. andrei LUFA St. 2.2 standard soil 1 - 2 days Behaviour of the worms Dual chamber Centru rr toxickýc v prostře s roupicemi ■ Relevance: ■ Modelový organismus půdních destruentů ■ Roupice zastávají podobné funkce jako žížaly a v některých systémech je nahrazují ■ Realistická expozice - obývají horní vrstvičku půdy ■ Praktické výhody testů při srovnání s prostorovými, časovými a finančními náklady testů na žížalách: ■ 4-6 týdnů oproti 8 týdnům ■ 20g půdy oproti 1/2 kg ■ Malé ale dobře manipulovatelné ■ Malý a snadný chov (není potřeba hnůj) Centrum pro výzkum toxických látek v prostředí || Enchytraeus albidus vs crypticus ■ E albidus: 15 - 40 mm ■ E crypticus je mnohem menší (5 - 10 mm) ■ praktické problémy - potřeba barvení ■ ALE dá se bez problémů kultivovat ve velkém na agaru ■ vzhledem ke kratší generační době ho získáme velké počty v krátké době (E.a. 33 dnů x E.c. 8 dnů) (©) Centrum pro výzkum toxických látek v prostředí Chovy roupic V půdě (E albidus, E crypticuš) či na agaru (E crypticuš) Substrát může být artificiální půda, prírodní půda, či zahradní zemina, či směs napr. 1:1 Substrát musí být defaunizován (opakované zmražení a roztáni), nesmí obsahovat polutanty a mít vhodné vlastnosti (zejména pH) a přesátý přes 2 mm Krmení - autoklávované mleté ovesné vločky V chovu musí být přístup vzduchu a optimální vlhkost Indikátory nevhodného substrátu: roupice pohybující se pouze po povrchu, či snažící se uniknout z nádoby, nevyskytující se juvenilní jedinci apod. Cyklus (18 °C): kokon obsahuje průměrně 5 - 15 vajíček; po 1-3 týdnech se vylíhnou juvenilní jedinci, kteří dospívají cca po 3 až 6 týdnech 2 x týdně kontrola vlhkosti a krmení Centrum pro výzkum toxických látek v prostredí Test na reprodukci roupic - 1. část ■ Je možno provádět se dvěma druhy E albidusa E crypticus m Inertní nádobky a v každé 20g půdy pro E.a. a 10 g pro E.c. ■ Podmínky testu: optimální teplota (max 20 °C), vlhkost (40 - 60% WHC), osvětlení (perioda 16:8, 400-800 lux) ■ 10 dospělých jedinců (opasek s tečkami vajíček) do každé nádobky ■ Každý týden s výjimkou prvního týdne po odstranění dospělců je přidávána potrava (cca 1,2 mg ovesných vloček na g půdy). ■ Mortalita - po 2 týdnech (E.c.) či 3 týdnech (E.a.) se spočítají dospělci a odstraní se z půdy ■ Pozorování morfologických změn lze provádět na petriho > Jedinci jsou asi 12 hodin necháni na miskách v chladu, čímž dojde k vyčištění trávící soustavy. > Jedinec je přemístěn do kapky vody na podložní sklíčko > Pozorování začíná na lOOx zvětšení a detailní studium externích a interních struktur provádíme při 400x zvětšení. miskách: (©) Centrum pro výzkum toxických látek v prostředí Test na reprodukci roupic - 2. část ■ Po odstranění adultů se inkubuje pouze půda s kokony (bez potravy) ■ Po dalších 2 týdnech (E.c.) či 3 týdnech (E.a.) se hodnotí reprodukce - fekundita, pro extrakci juvenilních jedinců ■ Metoda mokré extrakce (fixace etanolem a barvení 1% bengálskou červení po 12 hodinách) ■ Kontrola v testu (bez aplikace chemikálie i nosiče) má vykazovat následující parametry: > mortalita dospělců méně než 20% na konci testu > rozmnožení nejméně 25 juvenilních jedinců na 10 dospělců (pro E.c. je zo 300 až 500) > koeficient variance pro počet juvenilů méně než 50% ■ Pozitivní kontrola - referenční látka - carbendazim (l,2±0,8mg/kg by mělo vyvolat EC50) (©) Centrum pro výzkum toxických látek v prostředí OECD test 220 (2004): Enchytraeid Reproduction Test Timetable Period Day-7 Day -Z Range-finding test Preparation of artificial soil (Mixing of dry constituents) Check of pH of prepared AS Measurement WHCmax Definitive test Preparation of artificial soil (Mixing of dry constituents) Check of pH of prepared AS Measurement WHCmax Day -3 to -1 D.i y - I Day 0 Day 14 Day 21 Day 23 D J y . Z Sorting out of worms for acclimatisation Premoistening of AS and division into batches 1 Preparation of stock solution 2 Application of test substance 3 Weighing of test substrate into the test vessels 4 Mixing of food into the soil 5 Introduction of worms 6 Measurement of pH and moisture Check of moisture Determination of mortality Estimation of number of juveniles Measurement of pH and moisture Sorting out of worms for acclimatisation Premoistening of AS and division into batches 1 Preparation of stock solution 2 Application of test substance 3 Weighing of test substrate into the test vessels 4 Mixing food into the soil 5 Introduction of worms 6 Measurement of pH and moisture Check of moisture; feeding Check of moisture; feeding 1 Removal of adults 2 Check of behaviour 3 Determination of mortality 4 Check of moisture; feeding Check of moisture Check of moisture; feeding Centrum pro výzkum toxických látek v prostředí Day 42 Counting of juvenile worms Measurement of pH and moisture Avoidance test s E, a Ibid us Např. testování odpadů odpad artificiální puda 0 8,4 cm 1 q 0pakování 2 x 10 g půdy Centrum pro výzkum toxických látek v prostředí Hledání živých roupic ^ i v obou polovinách 24 hodin Parameter Bioakumulační test s máloštětinatci (©) Centrum pro výzkum toxických látek v prostředí Test organism Test substrate Control substrate Biological parameters Endpoints Test duration Temperature Light regime & light intensity Test chambers Feeding during exposure Water Equilibration Test item Spiking of soil Analysis of test item Number of test concentrations Test concentrations Number of replicates per test concentration/sampling date Number of organisms per test chamber Determination of soil diy weight and organic carbon content in soil Determination of lipid content in biota Validity of test Evaluation Eisenia fetida/andrei. or Enchytraeus albidus, adult worms of similar size spiked artificial soil based on OECD guideline No. 207 (OECD 1984) uncontaminated artificial soil based on OECD guideline No. 207 (OECD 1984) concentration of test item in worms during uptake and elimination period bioaccumulation factor, uptake rate coefficient, elimination rate constant uptake period: until steady state or 28 d; plus 10 day elimination period 20 ± 2°C constant light; 400 to 800 lx e.g. 250 1111750 mL glass tubes: additional chambers of appropriate size for chemical analyses food added to soil directly after spiking; additional feeding once per week during exposure periodic addition of deionised water 4 days; spiked soil under test conditions 14C-labelled/metal if possible, test item dissolved in water mixed with dry soil; optional: coating of sand in worms and soil 1 plus control(s) to be fixed (expressed in Bq or mg kg"1 soil dry weight) at least 3 per sampling date Eisenia: 1; Enchytraeus■: 20 4 samples after soil preparation 4 samples at end of uptake phase* mortality during test period < 10% (earthworms). < 20% (enchytraeids) Use of appropriate methods (e.g. nonlinear regression analysis, ANOVA, Duimett's t-test) Testy s chvostoskoky ■ ekotoxikologicky dlouho využívané organismy - první test na filtračním papíře byl již v roce 1956 s DDT Výhody: dobře prostudovaná skupina půdních bezobratlých ekologická relevance široce rozšířené, abundantní v půdách lehce vzorkovatelní lze je chovat v laboratoři relativně rychlý životní cyklus s vysokou reprodukcí nejčastěji užívaným druhem je Folsomia candida m omnivor (řasy, bakterie, prvoci, detritus) > lehká kultura > partenogenetická povaha neposkytuje příliš ekologicky relevantní obrázek Centrum pro toxických látek v prostředí i další druhy: Folsomia fímetaria, Isotoma viridis, Onychiurus awiatus, O. quadricellatus, Orchesella cincta, Tullbergia granulata testu s F. Candida Kultivace ■ na petriho miskách či jiných nádobách, kde je na dně štuková sádra (pH 6,4) a aktivní uhli (pH 6-7) smíchané v poměru 8 až 10 ku 1, lOOg směsi + 60-100g vody = dostatečná vlhkost; uhlí pohlcuje exkrety ■ tmavé pozadí umožňuje pozorování ■ 20-22°C; 70-80% rel. vlhkost vzduchu; 400-800lx ■ potravou jsou kvasnice párkrát týdně ■ po 8 týdnech je nutné přemístit do nové misky (tím se spouští ovipozice) Synchronizace ■ shluk vajíček se přemístí do nové nádoby; po 48h. odstranit zbylá vajíčka a krmí se juvenilové ■ nebo čerstvě vylíhlí jedinci se dají do nové nádoby a po nakladení vajíček se odstraní dospělci ■ manipulace pomocí exhaustoru dechového či automatického Centrum pro výzkum toxických látek v prostředí || Test s F. candida_ ■ 30g AS + na počátku 2mg sušených kvasnic + 10 jedinců F.c. (10-12 dní staré) a těsně zavřít nádobky ■ po 28 dnech (případně po době, než se vylíhnou potomci z vajíček nakladených dospělci) se sleduje přežití a potomstvo (Fl) ■ flotační metoda na konci pokusu ■ endpointy jsou reprodukce (produkce vajíček), růst, změny v chování, přežití . REFERENČNÍ LÁTKA: Betanal plus (160g/L Phenmedipham) či E605 forte (507,5g/L Parathion) efekt na reprodukci 100-200mg první látky a 0,l-0,18mg druhé ■ VALIDITA TESTU: v kontrole ne více než 20% mortalita a minimum 100 juvenilů na jednu testovací nádobu I Centrum pro výzkum toxických látek | v prostředí Folsomia Candida ISO 11267 (1999). Soil Quality - Inhibition of reproduction of Collembola (Folsomia Candida) by soil pollutants OECD (2009): Collembolan Reproduction Test. Proposal of the new guideline Centrum pro výzkum toxických látek v prostředí Testy s hlísticemi ® Hlístice jsou de facto vodní organismy - žijí v pórové vodě ® Nesnadná extrapolace na reálné podmínky © Velmi rychle testy - kratky životni cyklus © Hlístice jsou nejpočetnější půdní bezobratlí © Existují varianty s půdou jako matricí Caenorhabditis elegans, Panagrellus redivivus, Plectus acuminatis Centrum pro výzkum toxických látek v prostředí Caenorhabditis elegans chov a test ASTM: E2172-01 Standard Guide for Conducting Laboratory Soil Toxicity Tests with the Nematode Caenorhabditis elegans C. elegans se chová na agarových plotnách s nárůstem E coll Nutné jsou aseptické techniky a opatrné zacházení Několik medií - NGM - Nematode Growth Medium, LB - agar, K -roztok apod. Po 1-2 měsících se přesazuje na nové plotny Při nedostatku potravy se vyvinout tzv. Dauerovy larvy (©) Centrum pro výzkum toxických látek v prostředí m Protože testovací organismy by měly byt stejné věkové a váhové kategorie, použije se synchronizovaná kultura nematod: ošetření kultury roztokem chlornanu a hydroxidu sodného (SAVO) - vajíčka rezistentní, dospělce usmrtí; pak cca 3-4 dny staré hlístice ■ připraví se varianty půd ve větších objemech; poté na petriho miskách (0 3,5) menší navážky + testovací organismy (10 jedinců) ■ po 24h. pokusu Í20°C ve tmě) se provede speciální extrakce (Ludox® - koloidní suspenze) + centrifugace; nematoda jsou na povrchu supernatantu - přemístíme je na petriho misku s médiem a počítají se mrtví jedinci (bez pohybu při dráždění); spočítá se LC50 ■ kontrola pro validitu měření by měla mít 80% výtěžnost nematod z půdy a v kontrole 90% přežívání ■ pokud je test delší než 24h. musíme zajistit potravu - inokulum E co li Centrum pro výzkum toxických látek v prostředí t.5 MU TEST SOLUTION 2.333 G SOIL. Postup Kontaminovanou půdu lze připravit předem Nutný je kvalitní mikroskop Tento test je méně ekologicky relevantní než ostatní půdní testy: hodně vodné fáze krátké trvání : rychlý screeningový test (©) Centrum pro výzkum toxických látek v prostředí 35MM DISH {MIX, EQUILIBRATE AT20*C) ADD 1Q WORMS (20-CFOR24 HR} I R!NSE WITH LUDOX § DAY 1 DAY2 DAY 3 1G0MM DISH COUNT WORMS CENTRIFUGE 2500 RPM, 2 MIN. Testy s prospěšnými členovci existuje pojem "užiteční členovci", spojen s ochranou pred ucinkem pesticidů na necílové organismy, například na pavouky, hmyz a roztoče které jsou přímo prospěšné^ neboť v ekosystémech fungují proti škůdcům (predátoři a parazité škůdců) existuje skupina IOBC (International Organisation for Biological and Integrated Control of Noxious Animals and Plants) - připravila cca 30 testů v 3 stupňovém schématu hodnocení rizik (vychází z testů BBA a spolupracuje s BART) cca 6 testů na blanokřídlých 4 testy na broucích 2 testy na dvoukřídlých jeden na síťokřídlých jeden na plošticích 3 na roztočích jeden na pavoucích jeden na patogenní houbě Lithobius mutabilis Philonthus cognatus Poecilus cupreus Centrum pro výzkum toxických látek v prostředí Linyphiidae (©) Centrum pro výzkum toxických látek v prostředí 1- Půdní biotesty s vyššími rostlinami TERSTVO ŠKOLSTVÍ. OP Vzděláváni -h^U^i evr?p?xý | ZH5 ivi| % iMji ř00!?'"^ | MINISTERSTVO ŠKOLSTVÍ, OP Vzděláváni "í^kJ^J^ř tondVCR EVROPSKÁ UNIE MLÁDEŽE a TĚLOVÝCHOVY pro konkurenceschopnost 'Mna**" INVESTICE DO ROZVOJE VZDĚLÁVÁNÍ Inovace tohoto předmětu je spolufinancována Evropským sociálním fondem a státním rozpočtem České republiky Testy s vyssimi rostlinami velké množství - obtížná přehlednost ■ dřívější testy zaměřené na klíčivost semen a elongaci kořene jsou označovány jako poměrně necitlivé a málo relevantní pro ekologii ■ pro relevantnější interopretace byly vyvinuty testy vícegenerační s možností studia subletálních účinků Nej používanější endpointy 1. Klíčivost semen (půdní roztok) - nerelevantní 2. Elongace kořene (půdní roztok či půda) 3. Růst sazenic 4. Produkce biomasy Životní cyklus (změny hmotnosti, počet květů, semen ..) 5 e. Enzymatický test 7. Centrum pro výzkum toxických látek v prostředí Fyziologické testy (fotosyntéza, respirace) Testy klíčivosti a elongace kořene semena jsou exponovány v substrátu (křemenný písek), půdě toxické látce či přímo v kontaminované půdě z terénu a po 5 dnech se sleduje klíčivost -direct test ■ relativně necitlivý: semeno má bariéry pro vstup látky a energeticky je soběstačné, látka ho nemůže stresovat ■ postupy se v detailech liší, někdy bývá přímo spojen (US EPA) se sledováním délky kořene ■ jindy se ale vliv na délku kořene sleduje jako nepřímá expozice v roztoku Test inhibice růstu kořene Sinapsis alba ■ 72 hodin jsou semena vystavena roztoku látky (+kontrola) ■ 20°C; 5ml roztoku na petriho misku; 30 semen na misku; tma ■ stanoví se délka kořene a počet vyklíčených semen (ířS) I t^teMkoty\ V^ty'j/ v prostředí délka kořene L Test růstu kořene ■ ISO 11269-1(1993): Soil quality -Determination of the effects of pollutants on soil flora - Parti: Method for the measurement of inhibition of root growth ■ rozšířená se salátem Lactuca sativa ■ PRINCIP: Měří se délka kořenů predklíčeného salátu v kontrole a zkoušeném vzorku po 5 dnech inkubace. Ekotoxicita vzorku je stanovena jako statisticky významný rozdíl v délce kořenů zkoušeného vzorku ve srovnání s kontrolou, popř. se stanoví hodnota EC50 z koncentrační (ředící) řady. (©) Centrum pro výzkum toxických látek v prostředí Podmínky zkoušky • Teplota: 24 C 2 C • pH: 6,0-8,0 • doba expozice: 120h 2h • množství vzorku: 200 až 300 g vlhkého vzorku na zkušební nádobu • počet zkoušených semen - 15 predklíčených semen v jedné zkušební nádobě • počet paralelních stanovení: 3 až 5 • ostatní podmínky - bez osvětlení (©) Centrum pro výzkum toxických látek v prostředí Postup - detaily • Predklíčení semen - na vrstvě filtračního papíru zvlhčené demineralizovanou vodou po dobu 36h až 48h, při laboratorní teplotě bez regulace osvětlení. Pro zkoušku se vybírají naklíčená semena s kořínkem, který je kratší než 2 mm. Postup - detaily • Do nádoby se naváží 200 až 300 g zkoušeného vzorku nebo kontroly se známou sušinou, zvlhčeného na hodnotu 70% ± 5 % WHC • pravoúhlá síť např. 5x3 bodů • do jamek asi 1 cm hlubokých se pinzetou rovnoměrně rozmístí po 15 naklíčených semenech kořínkem směrem dolu • semena se k zemině přitlačí, zeminou se nezakrývají a takto připravené nádoby uzavřené víčkem se umístí do termostatu s teplotou 24°C ± 2 °C bez přístupu světla • po 5 dnech se salát šetrně oddělí od vzorku a změří se a zaznamenává délka kořenů ve zkoušeném vzorku a v kontrole s přesností na 1 mm (©) Centrum pro výzkum toxických látek v prostředí (©) Centrum pro výzkum toxických látek v prostředí Vyšší rostliny :"v-^&^"* •••• .„ ISO 22030 (2005): Chronic toxicity in higher plants Centrum pro výzkum toxických látek v prostředí _ Využití při registraci pesticidů Verschiedene Konzentrationsstufen im: * Auswirkungen auf andere Pflanzen Auf tauftest Wachstumstest Lein Erbse Prüfpflanzen: 6 Pflanzenarten aus unterschiedlichen Familien 1. Stufe: Prüfungen im Gewächshaus Auflauftest: Auswirkungen auf Keimung und Auflauf Wachstumstest: Auswirkungen auf den Biomassezuwachs TER < 10 2. Stufe: Weiterführende Versuche • Verlängerte Gewächshausversuche • Mehr Arten • Freilandversuche N a Lurbauiibalt * • Půdní ekotoxikologie vs biotesty Není soubor půdních ekotoxikoloqických biotestů Pomáhá POROZUMĚT složitým vztahům mezi chemickými látkami, půdou a půdními organismy látka