Základní podmínky kultivace in vitro Požadavky na vybavení laboratoře Živná média Základní podmínky kultivace in vitro • aseptická kultura nutnost sterilizace a desinfekce • vhodná výživa explantátu živná média • vhodné fyzikální podmínky – osvětlení – teplota – koncentrace plynů – vlhkost vzduchu Sterilizace a desinfekce A. Fyzikální • mechanická a elektrostatická vzduch očkovacích boxů (laminární, 2. třída) filtrace termolabilních látek - filtry: skleněné (frity G5, S4) membránové (Seitz, Millipore, Sartorius) 0,22mm • UV záření (kultivační místnosti, boxy) • teplota suché nebo vlhké teplo Očkovací boxy laminární proudění vzduchu do pracovního prostoru přes filtry: předfiltry HEPA-filtry („High Efficiency Particulate Air“) • horizontální proudění FATRAN (Slovensko) GELAIRE (Itálie) • vertikální proudění UNIFLOW (z Kolína/n. R.) HOLTEN (Německo) AURA (Itálie) A2 Vitro Centre International, Nizozemí horizontální proudění filtrovaného vzduchu (Fatran, Gelaire) chrání materiál, ale ne pracovníka a prostředí HEPA-filtr = „High Efficiency Particulate Air“ Očkovací box 1. bezpečnostní třída (lepší digestoř) box nezajišťuje podmínky pro sterilní práci chrání jen životní prostředí Očkovací box 2. bezpečnostní třída AURA, Holten – je možné pracovat i s GMO = ochrana materiálu, pracovníka i prostředí Očkovací box 3. bezpečnostní třída užití pro práci s vysoce infekčními, toxickými nebo radioaktivními materiály apod. Velikost filtrem zadržených částic < 0,1μm Mechanismy zadržení částic 1. efekt síta = velké částice 2. menší částice = inertní k proudění 3. nejmenší částice = Brownův pohyb = vlákna filtru Sterilizace teplem normální tlak zvýšený tlak suché teplo 120 - 170°C sklo nástroje - horkovzdušné sušárny - kahan - sterilizační přístroj vodou chlazený plášť vlhké teplo - zavařovací hrnec - Kochův sterilační přístroj - tlakový hrnec - autokláv voda, živná média, roztoky, filtrační papír 100kPa, 121°C Sterilizace při zvýšeném tlaku vztah mezi teplotou a tlakem 30020010070kPa 143134120115°C (autokláv Chirana, PS 20) Minimální doba pro sterilizace médií v autoklávu (katalog Sigma) objem média /ml/ doba /min/ teplota /°C/ 20 – 50 20 121 50 – 500 25 121 500 – 5 000 35 121 prázdné sklo filtr. papír 30 130 Změny v médiu při autoklávování (Pierik 1987) • snižování pH o 0,3 - 0,5 • rozklad termolabilních látek • štěpení sacharózy glukóza a fruktóza • při dlouhé době precipitace solí depolymerace agaru zeatin, GA, etylén kolchicin antibiotika rostlinné extrakty Sterilizace a desinfekce B. Chemická Oxidace - látky uvolňující: a) kyslík (H2O2, Persteril) b) element. halogeny (chlorové vápno, chlornany Chloramin B, SAVO, Ajatin, Decidin) Koagulace bílkovin ionty kovů - Hg, Sn, Ag Sublimát HgCl2, Famosept SPOFA Detergencia - snížení povrch. napětí, smáčení hydrofóbních povrchů a poškození membrán (70% EtOH, Citowet, Tween, Triton-X100, Jar) Živná média přirozená třepačky rolery bioreaktory skleněné perly můstky: papír PE,PP tekutá Agar Gelrite Heweten ztužená média umělásložení konzistence způsoby kultivace Fyzikální podmínky kultivace osvětlení intenzita, vlnová délka, fotoperioda tma teplota konstantní kolísavá (den x noc) klimatizace koncentrace plynů: CO2, etylén těsnost uzavírání kultivačních nádob vlhkost vzduchu Různé možnosti kultivace in vitro kultivační regály pro kultury na agarem ztuženém médiu horizontální třepačky pro kultivace v tekutém médiu Hark Orchideen GmbHC Lipstaadt, Německo Katalog Duchefa rotační kultivační systém pro kultivace v tekutém médiu Komerční kultivační místnost InVitro, Nizozemí z katologu Duchefa Kultivační nádoby s ventilací víčka na plastové krabičky se speciální membránou propustnou pro plyny kultivační sáčky se speciální membránou propustnou pro plyny (Sun bag, Sigma) původně pro kultivaci hub na jedno použití sterilizace γ zářením velikost pórů 0.02 μm, autoklávovatelný Polypropylenová membrána (můstek) tekuté médium podle katalogu Sigma Magenta box Bioreaktory laboratorní objem 3 litry objem 15 litrů objem 80 litrů RITA® - občasně zaplavovaný systém Fáze 1 - nejdelší trvání, pletiva bez imerze médiem Fáze 2 - začíná imerze, médiem, tlak vzduchu, který vstupuje přes filtr, vytlačuje tekuté médium k explantátůmFáze 3 – výměna vzduchu uvnitř reaktoru Fáze 4 – cyklus končí ukončením přetlaku medium stéká do spodní části nádoby www.vitropic.fr Bioreaktory produkční v roce 2005 největší automatický provzdušňovaný bioreaktor pro pěstování rostlinných buněk a orgánů na světě pracovní objem každého tanku 20 000 l (20 tun) celkový objem 160 000 l (160 tun) Foto: Sung Ho Son VitroSys Inc., Korea Povrchová desinfekce semen Uzavření semen do epruvety nebo gázy 1. roztok: 50 ml sterilní destil. vody 1 minuta 50 ml 96% EtOH 10 ml 30% peroxidu vodíku Oplach sterilní destil. vodou 2. roztok 20% SAVO (v/v) 15 - 20 minut 3x oplach sterilní destil. vodou vždy 3 - 5 minut Výsev na Petriho misky buničitá vata, skleněné perly + voda, médium Nicotiana tabacum L. – výsev semen kontrola SR1 na MS médiu s MTX heterozygotní 1-3AI-7 na MS médiu s MTX heterozygotní 1-3AI-7 na MS médiu bez MTX Živná média Složení živných médií kultury jsou většinou heterotrofní • anorganické sloučeniny (minerální výživa) makroelementy: N, P, K, Ca, Mg, S mikroelementy: Fe, B, Cu, Mn, Ni, Co, I, • organické sloučeniny (organická výživa) zdroje organického uhlíku: mono- a disacharidy (sacharóza) zdroje organického dusíku: aminokyseliny, polyaminy vitamíny inositol (cyklický šestisytný alkohol) • růstové regulátory (hlavně auxiny a cytokininy, dříve přírodní látky) • ztužování médií (agar, Gelrite®) • regulace pH (MES, PIPES) Makroelementy N, P, K, Ca, Mg, S • důležité jak kationty, tak anionty • živná média obsahují řádově mM koncentrace Gamborg et Phillips (1995): anorganický dusík a draslík alespoň 30mM NO3- K+ amonné soli NH4+ 2-20 mM sulfáty, fosfáty, vápník a hořčík 1-3 mM SO4 2- PO4 3- Ca2+ Mg2+ Dusík Hlavní složkou všech médií je anorganický dusík, používá se ve dvou formách: • nitráty • amonné ionty KNO3, NH4NO3, Ca(NO3)2.4H2O Dusičnany (nitráty) • mohou být transportovány xylémem do jiných částí rostliny, kde probíhá jejich asimilace • nemohou být použity k syntéze organických molekul přímo, ale musí být postupně redukovány (ve dvou krocích) - napřed na dusitany a pak až na amonné ionty • mohou být skladovány ve vakuolách buněk a plní důležitou funkci osmoregulace a rovnováhy mezi kationty a anionty. Asimilace dusíku 1. krok – konverze nitrátu na nitrit nitrátreduktáza (v cytoplazmě) katalyzuje přenos e- z NADPH FAD cytochrom Fe (II / III) Mo (V/VI) NO3 -/ NO2 - 2. krok – redukce nitritu na čpavek nitritreduktáza (v plastidech) katalyzuje redukci NO2 - NH3 elektrony pro tuto redukci se získávají ve fotosystému I přenašečem je feredoxin Amonné ionty • volný čpavek nebo amonné ionty jsou pro rostliny toxické i v nízkých koncentracích (inhibice tvorby ATP) • jsou rychle převáděny na nízkomolekulární organické sloučeniny (glutamin, glutamát, asparagin, arginin, alantoin…) • skladování v kořenech rostlin a zásobních orgánech Fosfor • je přijímán jako dihydrogenfosforečnan • může být přítomen v rostlinách jako anorganický fosfát (Pi), po vstupu do cytoplazmy je rychle esterifikován na ATP • je nezbytný: – pro stavbu DNA, RNA, fosfolipidů biomembrán – pro energetický metabolismus - energie uvolněná glykolýzou nebo získaná fotosyntézou nebo oxidativní fosforylací se ukládá do ATP a může být později uvolňována hydrolýzou na ADP a Pi Draslík • má velkou pohyblivost - jak na buněčné úrovni, tak na dlouhé vzdálenosti ve floému a xylému, je iontem s nejvyšší koncentrací v buňce (100 - 200 mM v cytopl.). • význam pro osmoregulaci • funguje jako protiváha při udržování optimálního pH • aktivuje mnoho enzymů (vazba K+ indukuje konformační změny proteinů), aktivuje membrány pro vazbu ATPáz Vápník • většinou vázán na buněčné stěny (Ca pektáty) a buněčné membrány • transport Ca2+ floémem i z buňky do buňky je velmi omezený • Ca2+ ovlivňuje stabilitu buněčné membrány interakcí s fosfáty, karboxylovými skupinami fosfolipidů a proteinů • Ca vazebný protein kalmodulin – role v regulaci intracelulární koncentrace Ca2+ Hořčík • velmi mobilní, schopný tvořit komplexy • je nezbytný pro – pro četné enzymatické reakce – fotosyntéza, regulace pH a rovnováhu iontů – syntéza proteinů (tvoří můstek mezi podjednotkami ribozómů – při jeho nedostatku se podjednotky rozpadnou a proteosyntéza je zastavena) – energetický metabolismus Mikroelementy • bór B • chlór, jód Cl, I • železo Fe • kobalt Co • měď Cu • mangan Mn • molybden Mo • zinek Zn používají se mikromolární koncentrace mají význam především jako kofaktory Fe ve formě chelátu s EDTA nebo EDDHA Organické sloučeniny - „vitamíny“ • B1 thiamin • B6 pyridoxin • kyselina nikotinová (biotin, kyselina listová, D, pantotenát vápenatý…) • myo-inositol - stavební jednotka inositolfosfatidů role při tvorbě a metabolismu membrán, u rostlin i jako fytinová kyselina = se 6 zbytky kys. fosforečné Organické sloučeniny uhlíku sacharidy • metabolizovatelné cukry: zdroj organického uhlíku – sacharosa – glukosa – fruktosa • nemetabolizovatelné cukry: změny osmotické hodnoty média – manitol – sorbitol Organické sloučeniny dusíku aminokyseliny • směsi – kvasničný hydrolyzát („yeast extract“) – hydrolyzát kaseinu (aminokyseliny mléčného – proteinu) • čisté aminokyseliny L-formy L-glycin Dusíkaté organické sloučeniny - polyaminy • putrescin • spermidin • spermin mají nejen funkci nutriční, ale hlavně regulační: 1. podpora tvorby adventivních kořenů 2. podpora tvorby prýtů 3. podpora somatické embryogeneze Růstové regulátory růst stimulující – auxiny (NAA, IBA, 2,4-D, Picloram) – cytokininy (kinetin, BAP, 2-iP, TDZ) – gibereliny (GA3) růst ihhibující – kyselina abscisová (ABA) Ztužování médií • agar – polysacharid extrahovaný z různých druhů mořských řas (často obsahuje velké množství solí) • karagenan – polysacharidy z ruduch, po ochlazení tvoří dvojitý helix v přítomnosti kationtů (Kappa typ tvoří gel v přítomnosti K+, Iota typ geluje v přítomnosti Ca2+ ) • Gelrite® – přírodní anionický polysacharid produkovaný mikrobiální fermentací (glukosa, glukuron. kyselina, glukosa a rhamnosa). Poskytuje pevný průhledný gel v přítomnosti Mg2+ , Ca2+ . Používá se v poloviční koncentraci ve srovnání s agarem. • alginát sodný – směs polyuronových kyselin, extrahován z hnědých řas. Tvoří zastudena gely rozpustné vodou, geluje v přítomnosti Ca2+ Plant Biotechnology – Sigma Aldrich http://www.sigmaaldrich.com/Area_of_Interest/Life_Science /Plant_Biotechnology/Tissue_Culture_Protocols.html The Plant Tissue Culture Protocols are part of Sigma's growing offer in Plant Biotechnology. · Media Preparation · Media Formulation · Sterilization Techniques · Storage Plant Biotechnology – Sigma Aldrich Plant Tissue Culture Protocols Antibiotics Classic Plant Media Gelling Agents Iron Chelate Solution Murashige and Skoog Media Variations Orchid Culture Media Phycology and Aquatic Plant Media Plant Growth Regulators Plant Pathology Media Plant Tissue Culture Media Silver Thiosulfate Solution Sterilization of Culture Media Sunbag Vessels Vitamin Mixtures Surface Sterilization of Plant Explants and Orchid Seed Nejčastěji používaná média •Murashige et Skoog (1962) MS • Gamborg, Miller et Ojima (1968) B5 • Schenk et Hildebrandt (1972) SH • White (1963) • Nitsch (1951), Nitsch et Nitsch (1967) • Lloyd et McCown (1981) WPM • Kao et Michayluk (1975) • Chu (1975) N6 http://www.hos.ufl.edu/mooreweb/TissueCulture/tcclass.htm Murashige - Skoogovo základní médium (1962) Inorganics (mg/L) M 0404 • Potassium nitrate 1900.0 • Sodium nitrate 1751.0 • Ammonium nitrate 1650.0 • Magnesium sulphate 180.7 • Potassium phosphate monobasic 170.0 • Calcium chloride anhydrous 332.2 • Na2-EDTA 37.26 • Ferrous sulphate •7H2O 27.8 • Cobalt chloride • 6H2O 0.025 • Cupric sulphate •5H2O 0.025 • Boric acid 6.2 • Manganese sulphate • H2O 16.9 • Molybdic acid (sodium salt) • 2H2O 0.25 • Potassium iodide 0.83 • Zinc sulphate • 7H2O 8.6 Vitamíny podle Gamborga (B5) Organics (mg/L) M 0404 • myo-Inositol 100.0 • Nicotinic acid (free acid) 1.0 • Pyridoxine • HCl 1.0 • Thiamine • HCl 10.0 Příprava živného média (1 l) 1. 6,5 g agaru vsypeme do 300 ml destilované vody v SIMAX láhvi a rozvaříme v autoklávu. 2. Do Erlenmeyerovy baňky odměříme 500 ml destilované vody. 3. Přidáme koncentráty makroelementů (100 ml), mikroelementů (10ml) a chelát železa (5 ml). 4. Přidáme vitamíny (1 ml zamražené směsi). 5. Navážíme 100 mg inositolu. 6. Navážíme 20 g sacharózy. Příprava živného média (1 l) 7. Podle potřeby doplníme další látky jako aktivní uhlí, růstové regulátory a pod. 8. Slijeme rozvařený agar s roztokem v EM baňce a doplníme v odměrném válci na 1000 ml. 9. Pomocí Phan papírků změříme pH a upravíme na 5,7 pomocí 0,1 M KOH nebo 0,1 M HCl. 10. Médium dobře promícháme přeléváním z válce do EM baňky a rozlijeme asi po 40 ml do kultivačních nádob. Příprava živného média (1 l) 11. Kultivační nádoby s médiem uzavřeme vhodným uzávěrem 12. Následující den sterilizujeme při 121°C v autoklávu po dobu 20 minut 13. Krátkodobě média uchováváme při laboratorní teplotě, při skladování po delší dobu používáme lednici při kultivaci v Petriho miskách rozléváme médium sterilně v očkovacím boxu až po sterilizaci