Jméno:
Datum:


Téma 09:              Kultury izolovaných zygotických embryí

Izolace zygotických embryí a jejich kultivace in vitro se používá pro překonávání dormance semen,
při dopěstování hybridních embryí nebo jako zdroj ontogeneticky mladého materiálu při
mikropropagaci. Embrya izolovaná ze zralých semen lze pěstovat poměrně snadno na běžných médiích,
problémem při izolaci může být tvrdé osemení.


Materiál: semena a plody různých taxonů:

1.      Pinus nigra Arnold – borovice černá (Villars 2012)

2.      Abies sp. – jedle (Villars 2012)

3.      Picea abies (L.) Karst. – smrk ztepilý (Villars 2012, Dorfgastein 2011)

4.      Schizandra chinensis (Turcz.) Baill. – klanopraška čínská

5.      Zea mays L. – kukuřice setá


Média:      1. základní MS médium, 2% sacharosa, bez růstových regulátorů, 0,7% agar, pH 5,5

2. Van der Salmova modifikace MS média, 2% sacharosa, 0,5 mg.l^-1 BA, 0,1 mg.l^-1 IAA, 0,7% agar,
pH 5,5


Pomůcky: Preparační mikroskop, laminární box, sterilní nástroje a Petriho misky, aj.

Postup práce:

1.    Uzavření semen do skleněné epruvety nebo gázového váčku (podle velikosti semen)

2.    Desinfekce v 50% etanolu a 3% peroxidu vodíku                                 1 minuta

3.    Oplach sterilní destilovanou vodou (SDV)                                            1x

4.    Desinfekce ve 20% roztoku SAVO v SDV (v/v)                                  20 minut

5.    Oplachování SDV 3x po dobu 3 - 5 minut, po odlití poslední vody nechat semena uzavřena ve
sklenici v laminárním boxu.

6.    Bobtnání semen 24 hodin.

7.    Opakovaná desinfekce ve 20% roztoku SAVO v SDV (v/v)                20 minut

8.    Oplachování SDV 3x po dobu 3 - 5 minut oplach SDV

9.    Desinfikovaná semena nebo plody přeneseme sterilně do Petriho misky a preparujeme embrya,
která inokulujeme na povrch agarového média. U menších semen preparujeme embrya s pomocí
preparačního mikroskopu.

10. Zaznamenáme si složení živného média - především koncentrace makroelementů a sacharosy, formu
chelátu železa, přítomnost nebo absenci růstových regulátorů - a počet inokulovaných embryí.


Hodnocení:

V následujících týdnech kontrolujeme čistotu kultur a vyhodnotíme růst embryí.


Literatura:

1.             Tang W. et al. (2004): The effect of different plant growth regulators on
adventitious shoot formation from Virginia pine (Pinus virginiana) zygotic embryo explants. - Plant
Cell, Tissue and Organ Culture 78: 237–240.

2.             Viloria Z. et al. (2005): Immature embryo rescue, culture and seedling development
of acid citrus fruit derived from interploid hybridization. - Plant Cell, Tissue and Organ Culture
82: 159–167.