Bi6270c Cvičení z cytogenetiky
Vladimíra Vranová
Odd. genetiky a molekulární biologie
Ústav experimentální biologie
PřF MU
Organizační záležitosti
• dr. Vladimíra Vranová, e-mail: vlavra@mail.muni.cz
• Integrované laboratoře molekulární cytogenetiky
• Odd. genetiky a molekulární biologie
Ústav experimentální biologie PřF MU
• Oddělení lékařské genetiky FN Brno
• Babákova myelomová skupina, Ústav
patologické fyziologie LF MU
http://www.cba.muni.cz/cytogenlab/
Organizační záležitosti
• jarní semestr 2012 – 13 vyučovacích týdnů (12 týdnů - 9.4.
Velikonoční pondělí)
• 3 skupiny – A, B, C; cvičení každý třetí týden
• A: 20.2., 12.3., 2.4., 30.4.
• B: 27.2., 19.3., 16.4., 7.5.
• C: 5.3., 26.3., 23.4., 14.5.
• Univerzitní kampus, A13, Bohunice – Kamenice
• ILBIT, pavilon A3, 3. poschodí, pracoviště
Molekulární cytogenetiky
Organizační záležitosti
• Podmínky pro udělení zápočtu:
• přítomnost na každém cvičení
• soustředěné pracování a základní znalosti na
každém cvičení
• Literatura
• Kuglík, P.: Vybrané kapitoly z cytogenetiky, Masarykova
univerzita, Brno
• Kuglík, P.: Základy molekulární cytogenetiky člověka,
Masarykova univerzita, Brno
• Michalová, K.: Úvod do lidské cytogenetiky, Institut pro další
vzdělávaní, Brno
• Nussbaum R. L., McInnes R. R., Willard H. F.: Thompson &
Thompson – Klinická genetika. Triton, Praha, 2004
Poučení o bezpečnosti při práci
1) Do laboratoře vstupujeme jen se souhlasem vyučujícího a v pracovním oděvu.
2) Před začátkem vlastní práce se seznámíme s pracovním návodem a během práce jej dodržujeme.
Smíme provádět pouze práce, které jsou nařízeny a povoleny vyučujícím a pod jeho dohledem.
3) Před začátkem vlastní práce zkontrolujeme stav pracoviště, pracovních pomůcek a přístrojů.
Veškeré závady a nedostatky (a to i během vyučování) jsme povinni nahlásit vyučujícímu.
4) Se zařízením učebny, pomůckami a přístroji zacházíme opatrně a šetrně dle pokynů vyučujícího.
5) V učebně je zakázáno jíst a pít, zachováváme zde klid a pořádek.
6) Na pracovišti udržujeme pořádek a čistotu, chováme se ukázněně, pracujeme soustředěně podle
návodu a pokynů vyučujícího a používáme potřebné osobní ochranné pracovní prostředky na ochranu
života a zdraví.
9) Každou mimořádnou událost (vysypání či vylití látky, zasažení očí a kůže, požití, nadýchání, úraz
aj.) okamžitě hlásíme vyučujícímu, který zajistí potřebná opatření.
11) Po skončení práce pomůcky omyjeme a uklidíme na stanovené místo, uklidíme pracoviště,
vypneme elektrické přístroje, nepoužité chemikálie vrátíme vyučujícímu k uložení.
• 1. Základy mikroskopické techniky - světelná mikroskopie.
Seřízení mikroskopu dle Kohlerova principu, práce se suchým a
imerzním objektivem. Pozorování chromozomů Vicia faba, živočišních
a lidských chromozomů.
• 2. Klasická cytogenetika člověka.
Příprava cytogenetických preparátů z periferní krve, kostní dřeně.
Barvení chromozomů. Identifikace chromozomů. Karyotyp člověka,
numerické a strukturní změny chromozomů člověka. Nomenklatura
ISCN.
• 3. Molekulární cytogenetika.
Principy fluorescenční hybridizace in situ (FISH) a její využití
v prenatální, postnatální a nádorové cytogenetice. Základy využití
počítačové analýzy obrazu v cytogenetice.
• 4. Pokročilé metody molekulární cytogenetiky.
Technika CGH, SKY, array-CGH.
Cvičení z cytogenetiky - osnova
Cvičení 1
Základy mikroskopické techniky světelná
mikroskopie.
Transport mikroskopu
Při jakémkoli přemisťování je nutné mikroskop držet oběma rukama na dvou
určených místech (1, 2). Jakýkoli jiný způsob přemisťování či posunování po
pracovní desce stolu může vést k vážnému poškození mikroskopu!
http://www.sci.muni.cz/~anatomy/mikroskop/olympus_cx31.htm
okulár
objektiv
stolek
kondenzor
stativ
makrometrický
šroub
mikrometrický
šroub
Popis světelného mikroskopu
tubus
světelný zdroj
Objektiv
http://kfrserver.natur.cuni.cz/studium/prednasky/mikro
Úkol 1:
Seřízení mikroskopu dle Köhlerova
principu
Uvedení mikroskopu do provozu
Před zapnutím mikroskopu kolébkovým spínačem
(1) se přesvědčte, že napětí přiváděné ke
světelnému zdroji je staženo na minimum, tedy že
otočný potenciometr (2) je nastaven na hodnotu
1. Teprve po zapnutí spínače je možné zvyšovat
napětí (otáčení potenciometru ve směru šipky) a
tedy intenzitu emitovaného světla. Otočný
potenciometr používejte i v průběhu mikroskopování
k úpravě světelné intenzity, např. vždy při změně
objektivu.
Seřízení mikroskopu
• pro optimalizaci osvětlení v mikroskopu
• optimální využití optického potenciálu
mikroskopu, numerické apertury objektivu a
tím i jeho rozlišení
• Výsledkem Köhlerova nastavení by mělo být
rovnoměrné a maximální osvětlení
průhledného preparátu, ležícího v
předmětové rovině. Současně by měla být
dosažena nejlepší kombinace mezi
rozlišovací schopností a kontrastem.
Seřízení mikroskopu podle Köhlerova
principu
August Köhler (1866 -1948)
http://kfrserver.natur.cuni.cz/studium/prednasky/mikro
Musíme mít preparát – trvalé preparáty Vicia faba
(dobře kontrastní)
Na pracovní stolek mikroskopu
vložte připravený preparát tak,
že pomocí páčky (1) odkloníte
držák preparátu (3). Zaostřete
na preparát pomocí ostřícího
šroubu (2).
Seřízení mikroskopu podle Köhlerova
principu
Seřízení mikroskopu podle Köhlerova principu
Nastavte objektiv 10x (případně očistěte objektiv od
imerze) a zaostřete buňky preparátu.
Zavřete polní clonku tak, až uvidíte její obrys v
zorném poli. Obraz polní clonky (světlý kotouček) v této
fázi nemusí být ve středu zorného pole a nemusí mít
zaostřené okraje.
Zaostřete obraz polní clonky tím, že snižujete nebo
zvyšujete polohu kondenzoru.
Vycentrujte obraz polní clonky tak, aby byl přesně
ve středu zorního pole použitím centrovacích šroubů
na obvodu kondenzoru.
Otevřete clonu; při správném vycentrování se
okraje budou krýt s okrajem zorného pole.
- zaostřený preparát s
přivřenou polní clonou...
- polní clona po
zaostření... - .. a vycentrování
http://kfrserver.natur.cuni.cz/studium/prednasky/mikro
Seřízení mikroskopu podle Köhlerova
principu
http://kfrserver.natur.cuni.cz/studium/prednasky/mikro
Aperturní clonka - umístěná na kondenzoru. Její
otevřenost nastavte pomocí páčky maximálně na
hodnotu NA objektivu, který právě používáte.
Nejlepších výsledků bývá dosaženo při nastavení
aperturní clony na 70 až 80 % NA.
S postupným uzavíráním aperturní clony se zvyšuje
hloubka ostrosti a zvyšuje kontrast, postupně však
vystupují i různé nečistoty nebo nežádoucí vrstvy
buněk.
Co když na kondenzore není stupnice?
Vyjměte okulár a přivřete aperturní clonu, až ji uvidíte na zadní
straně čočky objektivu. Otevřete aperturní clonu tak, aby
odpovídala 70 – 80% plochy maximálního zorného pole.
Máme seřízený mikroskop!
…ale pouze pro danou kombinaci objektivu
a okuláru.
Teď už se bude měnit jenom aperturní clonka –
při každé výměně objektivu ji musíme nastavit na
70 – 80% hodnoty NA daného objektivu.
Úkol 2:
Pozorování chromozomů Vicia faba, práce se
suchým a imerzním objektivem
• preparát uložíme tak, aby prohlížená část byla ve středu
• kondenzor snížíme dle použitého objektivu (čím je
zvětšení menší, tím je kondenzor níže), aperturní clonu
otevřeme (na velikost numerické apertury objektivu)
• makrošroubem snižujeme tubus a v okuláru
sledujeme, kdy se objeví záblesk obrazu a doostříme
mikrošroubem
Postup při práci se suchým objektivem
Pozorování chromozomů V. faba
suchým objektivem
Sklo položte (buňkami nahoru!) na stolek
mikroskopu a prohlížejte objektivem o
malém zvětšení (4x–10x).
Spočítejte 100 buněk a určete mitotický
index.
Po zaostření na vhodnou mitózu použijte
objektiv s vyšším zvětšením (nejlépe 40x-
45x) – pozor při zaostřování (nebezpečí
poškození preparátu a znehodnocení
objektivu!)
Najděte jednotlivé fázy buněčného cyklu
v preparátech V. faba.
Pozorování chromozomů V. faba
suchým objektivem
• preparát uložíme tak, aby prohlížená část byla ve středu
• upravíme hodnotu aperturní clony otevřeme
• na preparát kápneme imerzní olej (pokud pracujeme s dvojitou
imerzí, kápneme olej také na čočku kondenzoru – ještě než ho
zvedneme nahoru)
• makrošroubem snižujeme tubus a pozorováním ze strany
sledujeme, kdy se čočka objektivu spojí s olejovou kapkou
(záblesk na hraně podložního skla), dále objektiv nesnižujeme
díváme se do okulárů a jemným otáčením makrošroubu
zvedáme tubus, jakmile se objeví preparát, doostříme
mikrošroubem
• po skončení pozorování zvedneme tubus, preparát odsuneme a
pokud nepokračujeme v práci s imerzí, ihned řádně očistíme
objektiv (i kondenzor, pokud pracujeme s dvojitou imerzí).
Postup při práci s imerzním objektivem
Po zaostření na vhodnou mitózu použijte objektiv se
zvětšením 100x – pozor při zaostřování (nebezpečí
poškození preparátu a znehodnocení objektivu!)
Kolik chromozomů má bob?
Pozorování chromozomů V. faba
imerzním objektivem
Správná odpověď je:
12 (nebo 6 párů)
• nedostatečně osvětlené zorné pole – špatně seřízené
světlo, snížený kondenzor, zúžená clona
• přesvětlené zorné pole – zvýšený kondenzor, příliš
otevřená clona a intenzivní světlo
• objektiv není přetočen přesně do optické osy
• čočky objektivu nebo okuláru jsou znečištěny
• preparát není zcela suchý – i malé zbytky vody vytvářejí s
imerzním olejem neprůhlednou emulzi.
Nejčastější závady
Úkol 3:
Pozorování živočišních a lidských
chromozomů
Pozorujte pod mikroskopem chromozomy býka, žirafy,
nosorožce, sitatungy, kudu velkého, hyeny, orangutana a pokuste
se přiřadit jednotlivé preparáty danému živočišnímu druhu.
Tur domácí
(Bos taurus)
2n = 60
(akrocentrické
chromozomy)
Žirafa síťovaná
(Giraffa camelopardalis
reticulata)
2n = 30
Sitatunga
(Lesoň bahenní)
(Tragelaphus spekeii)
2n = 30
Kudu velký
(Tragelaphus
strepsiceros)
2n = 32 ♀, 31♂ (t(13;Y))
Hyena skvrnitá
(Crocuta crocuta)
2n = 40
Nosorožec bílý
(tuponosý)
(Ceratotherium simum)
2n = 82
Nosorožec černý
(Diceros bicornis)
2n = 84
Orangutan
(Pongo pygmaeus)
2n = 48
Tur domácí
(Bos taurus)
2n = 60 (akrocentrické chromozomy)
VÚVL, Brno
1
Sitatunga (Lesoň bahenní)
(Tragelaphus spekeii)
2n = 30
VÚVL, Brno
2
Hyena skvrnitá
(Crocuta crocuta)
2n = 40
Karyotypes of spotted hyenas from Hsu & Benirschke, 1968.http://placentation.ucsd.edu/spottedhyenafs.htm
3
Žirafa síťovaná
(Giraffa camelopardalis reticulata)
2n = 30
VÚVL, Brno
4
Kudu velký
(Tragelaphus strepsiceros)
2n = 32 ♀, 31♂ (t(13;Y))
VÚVL, Brno
5
Orangutan
(Pongo pygmaeus)
Orangutan bornejský (P.p.pygmaeus)
Orangutan sumaterský (P.p.abelii)
2n = 48
http://www.carolguze.com/text/442-4-chromosome_analysis.shtml
6
Nosorožec černý
(Diceros bicornis)
2n = 84
Nosorožec bílý (tuponosý)
(Ceratotherium simum)
2n = 82
http://www.jstor.org/pss/2458963
White Rhinoceros original range [orange: Northern (C. s.
cottoni), green: Southern (C. s. simum)].
http://en.wikipedia.org/wiki/White_Rhinoceros
Black Rhinoceros range
7
8
Typy barvení lidských chromozomů
Klasické barvení
G-pruhování
R-pruhování
C-pruhování
Preparáty byly získány z dělících se lymfocytů
lidské periferní krve.
Krev jsme po odběru kultivovali v médiu, kde byly
buňky přinuceny k mitotickému dělení.
Vzniklou suspenzi jsme fixovali, nakapali na skla a
napruhovali pomocí G-pruhů (bližší postup v dalším
cvičení)
Pozorování lidských chromozomů pod
mikroskopem
Sklo položte (buňkami nahoru!) na stolek
mikroskopu a prohlížejte objektivem o malém
zvětšení (10x).
Po vyhledání vhodné mitózy použijte objektiv
s vyšším zvětšením (nejlépe 100x) a pozorujte
chromozomy barvené G-pruhováním.
Vhodnou mitózu zakreslete a zkuste spočítat
chromozomy.
Pozorování lidských chromozomů pod
mikroskopem
9
9
8
20
velké metacentry
malé metacentry
velké akrocentry
malé akrocentry
zbytek -
submetacentry