Bi6270c Cvičení z cytogenetiky
Cvičení 2: Klasická cytogenetika
Vladimíra Vranová
Odd. genetiky a mlekulární biologie
Ústav experimentální biologie
PřF MU
1. Genetické pracoviště a možnosti
cytogenetických vyšetření.
2. Chromozomy, možnosti jejich kultivace a
barvení.
3. Stanovení karyotypu člověka,
chromozomové aberace a jejich rozdělení.
Klasická cytogenetika
Genetické pracoviště
Genetická
ambulance
Laboratoř DNA/RNA
diagnostiky
Cytogenetické
laboratoře
l. prenatální
cytogenetiky
l. onko-
cytogenetiky
l. molekulární
cytogenetiky
l. postnatální
cytogenetiky
Možnosti vyšetření
Genetická
ambulance
Laboratoř DNA/RNA
diagnostiky
Cytogenetické
laboratoře
genealogické
vyšetření
chromozomy
cytogenetické
vyšetření
pacient
molekulárně-
biologické
vyšetření
DNA
klasické molekulárně-
cytogenetické
Základem cytogenetického vyšetření je
analýza chromozomů.
Úkol 1. Kultivace a zpracování periferní
krve pro chromozomální vyšetření
plod
chorion
amnion
pupečník
Biopsie
choriových klků
(CVS)
Amniocentéza
Kordocentéza
10.
11.
12.
13.
14.
15.
16.
17.
18.
19.
20.
21.
22.
23.
24.
Závěr prenatálních
vyšetření
Týdny těhotenství
1. Prenatální vyšetření
http://camelot3.lf2.cuni.cz/turnovec/ublg/vyuka/index.php?adresar=prf
Prenatální vyšetření:
a) kultivace buněk plodové vody (buňky odloučené
z těla plodu)
• dlouhodobá kultivace (9-14 dnů)- buňky rostou přisedlé na dně
kultivační nádoby v koloniích
• před cytogenetickým zpracováním stažení buněk trypsinem
• ostatní postupy podobné (tj.hypotonie, fixace)
http://camelot3.lf2.cuni.cz/turnovec/ublg/vyuka/index.php?adresar=prf
přímá metoda nebo krátkodobá kultivace x dlouhodobá kultivace
rozstříhání očištěné tkáně (event.rozvolnění buněk trypsinem) a
nasazení do kultivačního media, kultivace a cytogenetické
zpracování
vyšetřuje se extraembryonální tkáň – určité riziko diskrepance
s karyotypem plodu
Prenatální vyšetření:
b) vyšetření buněk choriových klků
http://camelot3.lf2.cuni.cz/turnovec/ublg/vyuka/index.php?adresar=prf
podobné jako periferní krev
odběr krve z kličky pupečníku
krátkodobá kultivace a cytogenetické zpracování
Prenatální vyšetření:
c) kultivace buněk pupečníkové krve
http://camelot3.lf2.cuni.cz/turnovec/ublg/vyuka/index.php?adresar=prf
• nasazení plné krve (s heparinem) do kultivačního media se sérem
a PHA (phytohemaglutinin = mitogen)
- stimuluje především T lymfocyty
• kultivace 48 nebo 72 hodin při 37°C v CO2 termostatu
• zastavení mitotického dělení kolchicinem (působí na dělící
vřeténko), centrifugace
• sediment resuspendován v hypotonickém roztoku (0,075M KCl,
centrifugace
• sediment resuspendován ve fixačním roztoku (metanol:kys.
octová)
• centrifugace a opakování fixace
• konečný sediment kápnut na podložní sklo-sušení
2. Postnatální vyšetření:
kultivace periferních lymfocytů
3. Hemato-onkologické vyšetření:
kultivace kostní dřeně
nasazení kostní dřeně do kultivačního media
kultivace 24 hodin při 37°C v CO2 termostatu
zastavení mitotického dělení kolchicinem (působí na
dělící vřeténko), centrifugace
sediment resuspendován v hypotonickém roztoku
(0,075M KCl, centrifugace
sediment resuspendován ve fixačním roztoku
(metanol:kys. octová)
centrifugace a opakování fixace
konečný sediment kápnut na podložní sklo-sušení
Medium
Serum
PHA
Krev
Antib.
Kultivace
72hod
Kolchicin
Hypotonie
0,075MKCl-lyze
centrifugace
centrifugace
Fixace
metanol/octová
Fixace-centrifugace
celkem 3x - promytí něk.kapek na podl.sklo
Postnatální vyšetření: kultivace periferních
lymfocytů
Úkol 2. Barvení a pozorování
chromozomů
1. KLASICKÉ
- obarvení Giemsou
• neodliší jednotlivé
chromozomy
• vhodné pro mutagenní
studie
• používáme roztok GiemsaRomanowski
(eventuálně
Wrightovo barvivo)
5 – 6
minut
4,5 ml Giemsova roztoku
15 ml Gurrova pufru
do 50 ml dest. H2O
http://camelot3.lf2.cuni.cz/turnovec/ublg/vyuka/index.php?adresar=prf
Chromozomy lze rozdělit do
morfologických skupin
6 – 12
13 – 15
19 – 20 21 – 22
4 – 5
K detekci získaných chrom. aberací
Dicentrický chromozom + difragment
2.DIFERENCIAČNÍ (pruhovací metody)
• odliší jednotlivé chromozomy dle charakteristických pruhů
• vhodné pro studium vrozených chromozomálních abnormalit
numerických i strukturních, chromozomálních změn u nádorů
Metoda G pruhů
působení roztoku trypsinu (enzymatická metoda) nebo solných
roztoků před vlastním obarvením – různé chromozomální části
různě denaturovány trypsinem se odlišně barví Giemsou
Metoda R-pruhů
působení solných roztoků za vyšší teploty a vyššího pH →
pruhování opačné k G pruhům (tmavé G pruhy jsou v R pruzích
světlé)
G-pruhy
R-pruhy
silná denaturace euchromatinových částí:
HCl, BA(OH)2 + solné rotoky za vyšší
teploty, Giemsou se pak barví pouze
heterochromatinové bloky včetně centromer
(jsou resistentnější) – vhodné pro studium
heterochromatinových variant
Barvení heterochromatinu – C-pruhy
Úkol 2a: Barvení chromozomů pomocí
klasického barvení
Úkol 2b: Pozorování chromozomů
Pozorujte chromozomy barvené klasicky, pomocí Gpruhování
a C-pruhování. Pokuste se najít chromozom
Y.
Pozorujte chromozomy získané z periferní krve, kostní
dřeně a tumoru.
Pokuste se sejmout mitózu pomocí programu LUCIA
KARYO.
6 – 12
13 – 15
19 – 20 21 – 22
4 – 5
Úkol 3. Sestavení karyotypu
člověka
Ultrastruktura chromozomů
Morfologie chromozomu
krátké (p-) raménko
dlouhé (q-) raménko
centromera
chromatida
telomera
telomera
repetitivní
(satelitní)
sekvence
DNA
repetitivní
sekvence
(TTAGGG)n
repetitivní
sekvence
(TTAGGG)n
DNA
http://camelot3.lf2.cuni.cz/turnovec/ublg/vyuka/index.php?adresar=prf
Velikost, poloha centromery a pruhy
Lidská somatická buňka obsahuje:
23 párů, tj. 46 chromozomů
– 22 párů autozomů
– 1 pár gonozomů (XX nebo XY)
7 velikostně a morfologicky odlišných skupin
chromozomů (A, B, C, D, E, F, G)
Karyotyp člověka
A B
C
D E
F G
Chromozomové složení buňky udává karyotyp
Karyotyp lidské somatické buňky
Idiogram lidských chromozomů
http://camelot3.lf2.cuni.cz/turnovec/ublg/vyuka/index.php?adresar=prf
Úkol 3a: Sestavte karyotyp člověka
http://learn.genetics.utah.edu/content/begin/traits/karyotype/
LUCIA KARYO
LUCIA KARYO umožňuje:
– nasnímání obrazů z mikroskopu
– úpravu obrazů (kontrast, pruhování, barvení)
– oddělování dotýkajících se chromosomů
– „inteligentní“ klasifikaci chromosomů
– tvorbu karyogramů
– tvorbu zpráv-reportů (RTF formát)
LUCIA KARYO
Úkol 3b: Práce s LUCIA KARYO
• Segmentace, oddělení jednotlivých chromosomů
• Odstranění buněk a překřížených chromosomů
• Karyotypování
• Posouzení karyotypu, možné odchylky od
standartu
Chromozomové aberace a jejich
rozdělení
Chromozomové mutace - poškození chromozomů
jako příčina genetických onemocnění
a) změny v počtu chromozomů (
aneuploidie, polyploidie)
b) změny ve struktuře
chromozomů – chromozomové
aberace (delece, duplikace …)
Písmenka označují jednotlivé úseky, * označuje centromeru.
ABCDEF*GHIJKL - normální chromosom
1. ABEF*GHIJKL -
2. ABBCDEF*GHIJKL -
3. CBADEF*GHIJKL -
4. ABCDHG*FEIJKL -
5. DEF*GHIJKL -
6. ABCDEF*FEDCBA -
7. ABCDEF*GHIXYZJKL Úkol
3d: Pojmenujte následující
chromosomové aberace.
Intersticiální delece úseku CD
Duplikace úseku B
Paracentrická inverze (úsek ABC)
Pericentrická inverze (úsek EF*GH)
Terminální delece úseku ABC
Isochromomosom (raménko ABCDEF)
Inzerce úseku XYZ
http://genetika.wz.cz
Zápis karyotypu podle mezinárodní
cytogenetické nomenklatury (ISCN)
Udáváme celkový počet všech chromozomů a pak konstituci gonozomů
muž … 46,XY, žena … 46,XX
Udáváme jednotlivé aberace v pořadí: numerické a strukturní aberace
Numerické: -, +
Strukturní: del - delece
dup - duplikace
inv - inverse
i - isochromozom
r - ring chromozom (kruhový chromozom)
t - translokace
der - derivovaný, pozměnený chromozom
45, X / 46, XX - mosaika
Zdravý muž
Zdravá žena
Žena s Turner syndromem
Muž s Klinefelter syndromem
Holčička s Patau syndromem
Chlapeček s Down syndromem
Muž s translokací 14;21
Dále zapište diagnózu dle následujících karyotypů.
45,X
47,XXX
46,XX, t(14;21)
46,XY,del(5p)
Úkol 3c: Zapište karyotypy u uvedených
jedinců.
http://learn.genetics.utah.edu/content/begin/traits/predictdisorder/
- 46,XY
- 46,XX
- 45,X
- 47,XXY
- 47,XX,+13
- 47,XY,+21
- 46,XY,t(14;21)
Žena s Turnerovým syndromem (monosomie X
chromosomu)
Žena s trisomií X ("Superfemale")
Žena s translokací 14;21
Muž s delecí krátkého raménka 5. chromosomu (Cri du
chat syndrom)
http://genetika.wz.cz