1 Bi8120 A lik á b ěč á bi l i 22 2 2012Bi8120 A lik á b ěč á bi l i 22 2 2012Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie – 22.2.2012Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie – 22.2.2012 Studium buněk v podmínkách in vitro Studium buněk v podmínkách in vitrov podmínkách in vitrov podmínkách in vitro doc. RNDr. Renata Veselská, Ph.D., M.Sc. Ústav experimentální biologie Přírodovědecká fakulta MU doc. RNDr. Renata Veselská, Ph.D., M.Sc. Ústav experimentální biologie Přírodovědecká fakulta MUPřírodovědecká fakulta MUPřírodovědecká fakulta MU Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 22.2.2012Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 22.2.2012 2 10 m10 m fibroblasty v buněčné kultuřefibroblasty v buněčné kultuře Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 22.2.2012Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 22.2.2012 3 Program přednášky:Program přednášky: • vývoj kultivací buněk in vitro• vývoj kultivací buněk in vitro Program přednášky:Program přednášky: vývoj kultivací buněk in vitro • podmínky kultivace eukaryontních buněk in vitro vývoj kultivací buněk in vitro • podmínky kultivace eukaryontních buněk in vitroin vitro • typy kultivací (terminologie) • vlastnosti normálních a transformovaných in vitro • typy kultivací (terminologie) • vlastnosti normálních a transformovaných• vlastnosti normálních a transformovaných buněčných linií • praktické aplikace • vlastnosti normálních a transformovaných buněčných linií • praktické aplikace• praktické aplikace • archivace, sbírková pracoviště • praktické aplikace • archivace, sbírková pracoviště Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 22.2.2012Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 22.2.2012 4 VÝVOJ KULTIVACÍ BUNĚK IN VITRO VÝVOJ KULTIVACÍ BUNĚK IN VITROBUNĚK IN VITROBUNĚK IN VITRO Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 22.2.2012Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 22.2.2012 5 • 1907: kultivace nervových vláken izolovaných ž bí h b í ( ) • 1907: kultivace nervových vláken izolovaných ž bí h b í ( )z žabích embryí (Harrison) • 1912: explantáty kuřecí pojivové tkáně a d č í l i (C l B ) z žabích embryí (Harrison) • 1912: explantáty kuřecí pojivové tkáně a d č í l i (C l B )srdeční svaloviny (Carrel; Burrows) • 1916: trypsinizace a pasážování (Rous & Jones) srdeční svaloviny (Carrel; Burrows) • 1916: trypsinizace a pasážování (Rous & Jones) • 1943: stabilizace první buněčné linie -myší fibroblasty: L-cells (Earle et al.) • 1943: stabilizace první buněčné linie -myší fibroblasty: L-cells (Earle et al.) • 1948: první buněčný klon - L929 (Sanford et al.) • 1952: stabilizace první lidské linie - karcinom • 1948: první buněčný klon - L929 (Sanford et al.) • 1952: stabilizace první lidské linie - karcinomp děložního krčku: HeLa (Gey et al.) p děložního krčku: HeLa (Gey et al.) Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 22.2.2012Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 22.2.2012 6 Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 22.2.2012Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 22.2.2012 7 1952 - stabilizace první lidské linie HeLa (Gey et al.) k děl ž íh k čk 1952 - stabilizace první lidské linie HeLa (Gey et al.) k děl ž íh k čk• karcinom děložního krčku • Henrietta Lacks (1920-1951) Johns Hopkins University Hospital (Baltimore USA) • karcinom děložního krčku • Henrietta Lacks (1920-1951) Johns Hopkins University Hospital (Baltimore USA)• Johns Hopkins University Hospital (Baltimore, USA)• Johns Hopkins University Hospital (Baltimore, USA) Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 22.2.2012Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 22.2.2012 8 Linie HeLa:Linie HeLa: Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 22.2.2012Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 22.2.2012 9 Linie HeLa:Linie HeLa: mikrotubuly (anti-Tu) mikrofilamenta (phalloidin) mikrotubuly (anti-Tu) mikrofilamenta (phalloidin) Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 22.2.2012Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 22.2.2012 mikrofilamenta (phalloidin) jádra (DAPI) mikrofilamenta (phalloidin) jádra (DAPI) 10 Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 22.2.2012Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 22.2.2012 11 KULTIVAČNÍ PODMÍNKYKULTIVAČNÍ PODMÍNKYKULTIVAČNÍ PODMÍNKYKULTIVAČNÍ PODMÍNKY Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 22.2.2012Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 22.2.2012 12 Kultivační podmínky pro savčí a lidské buňkyKultivační podmínky pro savčí a lidské buňky • co nejpodobnější podmínkám v původním organismu: • co nejpodobnější podmínkám v původním organismu:  teplota 37oC,  maximální vlhkost vzduchu, 5% CO2  neutrální pH (6 8 až 7 2)  teplota 37oC,  maximální vlhkost vzduchu, 5% CO2  neutrální pH (6 8 až 7 2) neutrální pH (6,8 až 7,2)  živiny • sterilní prostředí  neutrální pH (6,8 až 7,2)  živiny • sterilní prostředísterilní prostředísterilní prostředí Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 22.2.2012Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 22.2.2012 13 Stabilní prostředí pro kultivacep p CO2 inkubátoryCO2 inkubátoryCO2 inkubátory • definovaná stabilní teplota (37oC) • maximální vlhkost vzduchu CO2 inkubátory • definovaná stabilní teplota (37oC) • maximální vlhkost vzduchu • definovaný stabilní obsah CO2 (5%), příp. i O2 (řízená hypoxie) • definovaný stabilní obsah CO2 (5%), příp. i O2 (řízená hypoxie) • vodní nebo vzduchový plášť • vnitřní povrch: měď nebo nerez • připojení tlakových lahví přes redukční ventily • vodní nebo vzduchový plášť • vnitřní povrch: měď nebo nerez • připojení tlakových lahví přes redukční ventily• připojení tlakových lahví přes redukční ventily• připojení tlakových lahví přes redukční ventily Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 22.2.2012Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 22.2.2012 14 Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 22.2.2012Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 22.2.2012 15 ŽIVNÉ MÉDIUM Bazální médiumBazální médiumBazální médium • tekuté nebo práškové • soli, aminokyseliny, vitamíny, lipidy, zdroj Bazální médium • tekuté nebo práškové • soli, aminokyseliny, vitamíny, lipidy, zdrojy y y p y j energie, indikátor pH + krevní sérum / růstové faktory y y y p y j energie, indikátor pH + krevní sérum / růstové faktory+ krevní sérum / růstové faktory+ krevní sérum / růstové faktory Kompletní médiumKompletní médium Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 22.2.2012Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 22.2.2012 16 SLOŽENÍ BAZÁLNÍHO MÉDIA:SLOŽENÍ BAZÁLNÍHO MÉDIA: Voda pro tkáňové kultury:Voda pro tkáňové kultury: • ultrapure type I - resistivita < 18 MΩ/cm • TOC (total organic carbon) < 10 ppb (parts per bilion) • ultrapure type I - resistivita < 18 MΩ/cm • TOC (total organic carbon) < 10 ppb (parts per bilion)(parts per bilion) Úprava vody pro tkáňové kultury: (parts per bilion) Úprava vody pro tkáňové kultury: • reverzní osmóza • absorbce na aktivní uhlík • iontoměniče • reverzní osmóza • absorbce na aktivní uhlík • iontoměniče• iontoměniče • elektrodeionizace • UV záření • iontoměniče • elektrodeionizace • UV záření Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 22.2.2012Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 22.2.2012 17 SLOŽENÍ BAZÁLNÍHO MÉDIA:SLOŽENÍ BAZÁLNÍHO MÉDIA: Vyvážené solné roztoky (BSS, balanced salt solutions): • udržování pH a osmolality d ž á í b á éh t iál b ěk Vyvážené solné roztoky (BSS, balanced salt solutions): • udržování pH a osmolality d ž á í b á éh t iál b ěk• udržování membránového potenciálu buněk • kofaktory enzymů • tvorba fokálních adhezí (růst na pevném substrátu) • udržování membránového potenciálu buněk • kofaktory enzymů • tvorba fokálních adhezí (růst na pevném substrátu)( p ) • ionty: Na+, K+, Mg2+, Ca2+, Cl-, SO4 2-, PO4 3-, HCO3 • stopové prvky: Fe, Zn, Cu, Se … ( p ) • ionty: Na+, K+, Mg2+, Ca2+, Cl-, SO4 2-, PO4 3-, HCO3 • stopové prvky: Fe, Zn, Cu, Se … Hlavní typy BSS: DPBS (Dulbecco's phosphate-buffered saline) HBSS (Hank's balanced salt solution) Hlavní typy BSS: DPBS (Dulbecco's phosphate-buffered saline) HBSS (Hank's balanced salt solution)HBSS (Hank s balanced salt solution) EBSS (Earle's balanced salt solution) ESSS (Eagle's spinner salt solution) HBSS (Hank s balanced salt solution) EBSS (Earle's balanced salt solution) ESSS (Eagle's spinner salt solution) Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 22.2.2012Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 22.2.2012 ( g p )( g p ) 18 SLOŽENÍ BAZÁLNÍHO MÉDIA:SLOŽENÍ BAZÁLNÍHO MÉDIA: Pufrovací systém: • NaHCO3, HEPES (N-2-hydroxyethylpiperazine-N’-2th l h i id) Pufrovací systém: • NaHCO3, HEPES (N-2-hydroxyethylpiperazine-N’-2th l h i id)-ethanesulphonic acid) Aminokyseliny: • esenciální resp vzácné (člověk myš): -ethanesulphonic acid) Aminokyseliny: • esenciální resp vzácné (člověk myš):• esenciální, resp. vzácné (člověk, myš): arginin, histidin, isoleucin, leucin, lysin, methionin, fenylalanin, threonin, tryptofan, valin • esenciální, resp. vzácné (člověk, myš): arginin, histidin, isoleucin, leucin, lysin, methionin, fenylalanin, threonin, tryptofan, valiny , , yp , • in vivo syntetizované ve specifických orgánech (játra, resp. ledviny): l y , , yp , • in vivo syntetizované ve specifických orgánech (játra, resp. ledviny): lcystein, glutamin, tyrosin • lze nahradit hydrolyzátem z proteinů (krátké peptidy) cystein, glutamin, tyrosin • lze nahradit hydrolyzátem z proteinů (krátké peptidy) Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 22.2.2012Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 22.2.2012 peptidy)peptidy) 19 SLOŽENÍ BAZÁLNÍHO MÉDIA:SLOŽENÍ BAZÁLNÍHO MÉDIA: • voda • anorganické sloučeniny (ionty, stopové prvky) • voda • anorganické sloučeniny (ionty, stopové prvky)anorganické sloučeniny (ionty, stopové prvky) • aminokyseliny ---------------------------------------------------------------- anorganické sloučeniny (ionty, stopové prvky) • aminokyseliny ---------------------------------------------------------------- • vitamíny (zejména skupina B) • lipidy (esenciální mastné kyseliny, cholesterol…) hormony růstové faktory (inzulín hydrokortizol) • vitamíny (zejména skupina B) • lipidy (esenciální mastné kyseliny, cholesterol…) hormony růstové faktory (inzulín hydrokortizol)• hormony, růstové faktory (inzulín, hydrokortizol) • glukóza (zdroj energie) • fenolová červeň (indikátor pH) • hormony, růstové faktory (inzulín, hydrokortizol) • glukóza (zdroj energie) • fenolová červeň (indikátor pH)fenolová červeň (indikátor pH) • antibiotika (penicilin + streptomycin) fenolová červeň (indikátor pH) • antibiotika (penicilin + streptomycin) Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 22.2.2012Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 22.2.2012 20 Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 22.2.2012Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 22.2.2012 21 Sérum: • fetální telecí/hovězí - FCS/FBS, koňské, lidské... Sérum: • fetální telecí/hovězí - FCS/FBS, koňské, lidské... • nedefinovaná směs růstových faktorů a dalších složek b h édi 5 20% dl t b ěk • nedefinovaná směs růstových faktorů a dalších složek b h édi 5 20% dl t b ěk• obsah v médiu 5 - 20% podle typu buněk • bezsérová média pro speciální aplikace (definovaná směs růstových faktorů - tzv. serum • obsah v médiu 5 - 20% podle typu buněk • bezsérová média pro speciální aplikace (definovaná směs růstových faktorů - tzv. serum(definovaná směs růstových faktorů tzv. serum replacement) Nejdůležitější látky obsažené v séru: (definovaná směs růstových faktorů tzv. serum replacement) Nejdůležitější látky obsažené v séru:Nejdůležitější látky obsažené v séru: • růstové faktory • albumin • transferrin Nejdůležitější látky obsažené v séru: • růstové faktory • albumin • transferrin• transferrin • anti-proteázy (antitrypsin, macroglobulin) • attachment factors (fibronectin, laminin, f t i ) • transferrin • anti-proteázy (antitrypsin, macroglobulin) • attachment factors (fibronectin, laminin, f t i ) Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 22.2.2012Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 22.2.2012 fetuin)fetuin) 22 Výhody použití séra: • směs nejdůležitějších faktorů pro přežívání a Výhody použití séra: • směs nejdůležitějších faktorů pro přežívání a• směs nejdůležitějších faktorů pro přežívání a proliferaci buněk • univerzální použití pro kultivaci většiny buněčných ů • směs nejdůležitějších faktorů pro přežívání a proliferaci buněk • univerzální použití pro kultivaci většiny buněčných ůtypů • ochrana buněčné kultury před výkyvy prostředí a toxickými vlivy (změny pH ionty těžkých kovů typů • ochrana buněčné kultury před výkyvy prostředí a toxickými vlivy (změny pH ionty těžkých kovůtoxickými vlivy (změny pH, ionty těžkých kovů, endotoxiny, proteolytické enzymy) Nevýhody použití séra : toxickými vlivy (změny pH, ionty těžkých kovů, endotoxiny, proteolytické enzymy) Nevýhody použití séra :Nevýhody použití séra : • potíže s reprodukovatelností (původ zvířat, krmení, roční doba…) riziko kontaminace Nevýhody použití séra : • potíže s reprodukovatelností (původ zvířat, krmení, roční doba…) riziko kontaminace• riziko kontaminace • dostupnost a cena • vliv na produkci proteinů do média • riziko kontaminace • dostupnost a cena • vliv na produkci proteinů do média Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 22.2.2012Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 22.2.2012 23 Typy médií pro savčí buňky: • Eagleovo médium (BME) a jeho modifikace Typy médií pro savčí buňky: • Eagleovo médium (BME) a jeho modifikace• Eagleovo médium (BME) a jeho modifikace (např. EMEM, AMEM, DMEM, GMEM, JMEM) • RPMI média • Eagleovo médium (BME) a jeho modifikace (např. EMEM, AMEM, DMEM, GMEM, JMEM) • RPMI média• RPMI média (např. RPMI 1629, RPMI 1630, RPMI 1640) • další média užívaná se sérem • RPMI média (např. RPMI 1629, RPMI 1630, RPMI 1640) • další média užívaná se sérem• další média užívaná se sérem (např. Fischerovo, Williamsovo) • média užívaná bez séra • další média užívaná se sérem (např. Fischerovo, Williamsovo) • média užívaná bez séra• média užívaná bez séra (TC199, MCDB) • média užívaná bez séra (TC199, MCDB) Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 22.2.2012Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 22.2.2012 24 Sterilní prostředíSterilní prostředíp • práce v tzv. laminárních boxech (HEPA filtry) - typ podle úrovně Biosafety Level (BSL) p • práce v tzv. laminárních boxech (HEPA filtry) - typ podle úrovně Biosafety Level (BSL)yp p y ( ) • jednorázový plastik (sterilizováno radiací) yp p y ( ) • jednorázový plastik (sterilizováno radiací)(sterilizováno radiací) • sterilní sklo, nástroje a roztoky š á á á í (sterilizováno radiací) • sterilní sklo, nástroje a roztoky š á á á í(horkovzdušná sterilizace, autoklávování) • antibiotika (horkovzdušná sterilizace, autoklávování) • antibiotika (běžně směs Pen/Str, případně gentamycin, amphotericin, nystatin) (běžně směs Pen/Str, případně gentamycin, amphotericin, nystatin) Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 22.2.2012Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 22.2.2012 25 BSL 1BSL 1 BIOSAFETY LEVELS (BSLs) BSL-1 • mikroorganismy, které nezpůsobují onemocnění u zdravých dospělých; standardizované lidské a BSL-1 • mikroorganismy, které nezpůsobují onemocnění u zdravých dospělých; standardizované lidské aý p ý ; živočišné buněčné linie BSL-2 ý p ý ; živočišné buněčné linie BSL-2BSL 2 • běžné patogeny středního rizika, mohou způsobovat různě závažná onemocnění, která lze dobře léčit (HBV Salmonella Toxoplasma klinický BSL 2 • běžné patogeny středního rizika, mohou způsobovat různě závažná onemocnění, která lze dobře léčit (HBV Salmonella Toxoplasma klinickýdobře léčit (HBV, Salmonella, Toxoplasma, klinický materiál - krev, tělní tekutiny, tkáně; některé sbírkové linie - např. HeLa) dobře léčit (HBV, Salmonella, Toxoplasma, klinický materiál - krev, tělní tekutiny, tkáně; některé sbírkové linie - např. HeLa) Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 22.2.2012Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 22.2.2012 26 Laminární box - biohazard třída I horizontálníhorizontální vertikálnívertikální Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 22.2.2012Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 22.2.2012 27 Laminární box - biohazard třída II HEPA filtry (částice > 0 3 mm) HEPA filtry (částice > 0 3 mm) Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 22.2.2012Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 22.2.2012 (částice > 0,3 mm)(částice > 0,3 mm) 28 Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 22.2.2012Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 22.2.2012 29 Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 22.2.2012Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 22.2.2012 30 Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 22.2.2012Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 22.2.2012 31 Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 22.2.2012Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 22.2.2012 32 BIOSAFETY LEVELS (BSLs) BSL-3BSL-3 BIOSAFETY LEVELS (BSLs) • lokální nebo exotické patogeny vysokého rizika, respiračně přenosné, způsobují závažná a potenciálně letální onemocnění která jsou obtížně • lokální nebo exotické patogeny vysokého rizika, respiračně přenosné, způsobují závažná a potenciálně letální onemocnění která jsou obtížněpotenciálně letální onemocnění, která jsou obtížně léčitelná • Mycobacterium tuberculosis, virus encefalitidy St. Louis antrax potenciálně letální onemocnění, která jsou obtížně léčitelná • Mycobacterium tuberculosis, virus encefalitidy St. Louis antraxLouis, antrax BSL-4 • extrémně rizikové patogeny respiračně přenosné Louis, antrax BSL-4 • extrémně rizikové patogeny respiračně přenosné• extrémně rizikové patogeny, respiračně přenosné, způsobují letální onemocnění, proti nimž neexistuje léčba ani vakcinace hemorrhagické viry (Ebola Marburg) • extrémně rizikové patogeny, respiračně přenosné, způsobují letální onemocnění, proti nimž neexistuje léčba ani vakcinace hemorrhagické viry (Ebola Marburg) Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 22.2.2012Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 22.2.2012 • hemorrhagické viry (Ebola, Marburg)• hemorrhagické viry (Ebola, Marburg) 33 BIOSAFETY LEVEL 3 (BSL-3) Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 22.2.2012Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 22.2.2012 34 BIOSAFETY LEVEL 4 (BSL-4) Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 22.2.2012Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 22.2.2012 35 Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 22.2.2012Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 22.2.2012 36 Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 22.2.2012Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 22.2.2012 37 Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 22.2.2012Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 22.2.2012 38 Typy kontaminací • mykoplazmata Typy kontaminací • mykoplazmata• mykoplazmata • viry • bakterie, plísně, kvasinky k t i ji b ěč li ií • mykoplazmata • viry • bakterie, plísně, kvasinky k t i ji b ěč li ií• kontaminace jinou buněčnou linií (cross=contamination) • kontaminace jinou buněčnou linií (cross=contamination) Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 22.2.2012Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 22.2.2012 39 Kontaminace – mykoplazmataKontaminace – mykoplazmata Detekce mykoplazmat: a) fluorescencenční mikroskopie Detekce mykoplazmat: a) fluorescencenční mikroskopie) p (značení DNA) b) PCR ) p (značení DNA) b) PCR Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 22.2.2012Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 22.2.2012 40 KULTIVAČNÍ POSTUPYKULTIVAČNÍ POSTUPYKULTIVAČNÍ POSTUPYKULTIVAČNÍ POSTUPY Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 22.2.2012Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 22.2.2012 41 invertovaný mikroskopinvertovaný mikroskop Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 22.2.2012Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 22.2.2012 42 Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 22.2.2012Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 22.2.2012 43 Typy buněčných kultur:Typy buněčných kultur:Typy buněčných kultur: • adherované: rostou přichycené na pevném podkladu Typy buněčných kultur: • adherované: rostou přichycené na pevném podkladurostou přichycené na pevném podkladu • suspenzní: rostou volně v médiu rostou přichycené na pevném podkladu • suspenzní: rostou volně v médiurostou volně v médiu Kultivace na živné vrstvě (feeder-layer): rostou volně v médiu Kultivace na živné vrstvě (feeder-layer):Kultivace na živné vrstvě (feeder layer): • obvykle inaktivované myší buňky (fibroblasty, peritoneální makrofágy) Kultivace na živné vrstvě (feeder layer): • obvykle inaktivované myší buňky (fibroblasty, peritoneální makrofágy) • hybridomy, embryonální kmenové buňky• hybridomy, embryonální kmenové buňky Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 22.2.2012Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 22.2.2012 44 Suspenzní kulturySuspenzní kultury SUBKULTIVACE (PASÁŽOVÁNÍ) Suspenzní kultury • odstranění starého média centrifugací • naředění buněk v čerstvém médiu ř í d é k lti č í l h ičk č t ý Suspenzní kultury • odstranění starého média centrifugací • naředění buněk v čerstvém médiu ř í d é k lti č í l h ičk č t ý• přenesení do nové kultivační lahvičky s čerstvým médiem Adherované buňky • přenesení do nové kultivační lahvičky s čerstvým médiem Adherované buňkyAdherované buňky • odstranění starého média, oplach v pufru • uvolnění buněk z podkladu proteolýzou fokálních dh í (t i ) Adherované buňky • odstranění starého média, oplach v pufru • uvolnění buněk z podkladu proteolýzou fokálních dh í (t i )adhezí (trypsin) • inaktivace trypsinu přidáním séra • alternativa: mechanické uvolnění (škrabky) adhezí (trypsin) • inaktivace trypsinu přidáním séra • alternativa: mechanické uvolnění (škrabky)( y) • centrifugace, naředění buněk v čerstvém médiu • přenesení do nové kultivační lahvičky s čerstvým médiem ( y) • centrifugace, naředění buněk v čerstvém médiu • přenesení do nové kultivační lahvičky s čerstvým médiem Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 22.2.2012Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 22.2.2012 médiemmédiem 45 Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 22.2.2012Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 22.2.2012 46 DĚLENÍ BUNĚKDĚLENÍ BUNĚKDĚLENÍ BUNĚK V PODMÍNKÁCH IN VITRO: DĚLENÍ BUNĚK V PODMÍNKÁCH IN VITRO: Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 22.2.2012Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 22.2.2012 47 TYPY KULTIVACÍ (TERMINOLOGIE) TYPY KULTIVACÍ (TERMINOLOGIE)(TERMINOLOGIE)(TERMINOLOGIE) Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 22.2.2012Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 22.2.2012 48 TKÁŇOVÉ KULTURY / CELL CULTURESTKÁŇOVÉ KULTURY / CELL CULTURES// • orgánová/tkáňová kultura (organ/tissue culture)• orgánová/tkáňová kultura (organ/tissue culture) trojrozměrná kultura nerozvolněné tkáně, která si uchovává histologické znaky a vlastnosti původní tkáně v prostředí in vivo trojrozměrná kultura nerozvolněné tkáně, která si uchovává histologické znaky a vlastnosti původní tkáně v prostředí in vivopůvodní tkáně v prostředí in vivo • buněčná kultura (cell culture) kultura odvozená z jednotlivých buněk, které už původní tkáně v prostředí in vivo • buněčná kultura (cell culture) kultura odvozená z jednotlivých buněk, které užkultura odvozená z jednotlivých buněk, které už nejsou spojeny do struktury tkáně • primokultura / primární kultura (primary culture) kultura odvozená z jednotlivých buněk, které už nejsou spojeny do struktury tkáně • primokultura / primární kultura (primary culture) buňky v kultuře jsou získány přímo z původní tkáně nebo fragmentu orgánu buňky v kultuře jsou získány přímo z původní tkáně nebo fragmentu orgánu Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 22.2.2012Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 22.2.2012 49 primokultura multiformního glioblastomu - 5. denprimokultura multiformního glioblastomu - 5. den Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 22.2.2012Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 22.2.2012 50 primokultura multiformního glioblastomu - 12. denprimokultura multiformního glioblastomu - 12. den Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 22.2.2012Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 22.2.2012 51 primokultura multiformního glioblastomu - 12. denprimokultura multiformního glioblastomu - 12. den Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 22.2.2012Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 22.2.2012 52 Buněčná linieBuněčná linie • populace buněk odvozená z primokultury při první pasáži a dále udržovaná v podmínkách in vitro • populace buněk odvozená z primokultury při první pasáži a dále udržovaná v podmínkách in vitrovitro (pasáž = přenos buněk z jedné kultivační nádobky do nádobky nové) vitro (pasáž = přenos buněk z jedné kultivační nádobky do nádobky nové)y y ) • diploidní (normální nenádorové buňky) • stabilizovaná (nádorově transformované buňky) y y ) • diploidní (normální nenádorové buňky) • stabilizovaná (nádorově transformované buňky)• stabilizovaná (nádorově transformované buňky) • charakterizace buněčné linie: označení (název) druh organismu pohlaví věk • stabilizovaná (nádorově transformované buňky) • charakterizace buněčné linie: označení (název) druh organismu pohlaví věkoznačení (název), druh organismu, pohlaví, věk, výchozí orgán, typ kultury, počet pasáží, růstové parametry, morfologie, karyotyp, markery označení (název), druh organismu, pohlaví, věk, výchozí orgán, typ kultury, počet pasáží, růstové parametry, morfologie, karyotyp, markery Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 22.2.2012Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 22.2.2012 p y, g , y yp, yp y, g , y yp, y 53 Buněčný kmenBuněčný kmenBuněčný kmen • buněčná populace, získaná subkultivací z původní linie vyselektována na základě Buněčný kmen • buněčná populace, získaná subkultivací z původní linie vyselektována na základěz původní linie - vyselektována na základě exprese určitého znaku z původní linie - vyselektována na základě exprese určitého znaku Buněčný klon • buněčná populace, vzniklá pomnožením jediné ň é ů í Buněčný klon • buněčná populace, vzniklá pomnožením jediné ň é ů íbuňky, izolované z původní linie • všechny buňky v buněčném klonu teoreticky id ti ké š k i čitý t ň buňky, izolované z původní linie • všechny buňky v buněčném klonu teoreticky id ti ké š k i čitý t ňidentické, avšak v praxi určitý stupeň heterogenity identické, avšak v praxi určitý stupeň heterogenity Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 22.2.2012Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 22.2.2012 54 Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 22.2.2012Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 22.2.2012 55 Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 22.2.2012Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 22.2.2012 56 NORMÁLNÍ A TRANSFORMOVANÉ BUNĚČNÉ LINIE NORMÁLNÍ A TRANSFORMOVANÉ BUNĚČNÉ LINIEBUNĚČNÉ LINIEBUNĚČNÉ LINIE Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 22.2.2012Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 22.2.2012 57 Růstové parametry buněčných linií:Růstové parametry buněčných linií: • generační doba období mezi dvěma mitózami = délka b ěč éh kl • generační doba období mezi dvěma mitózami = délka b ěč éh klbuněčného cyklu • population doubling time (PDT) čas potřebný ke zdvojnásobení počtu buněk v buněčného cyklu • population doubling time (PDT) čas potřebný ke zdvojnásobení počtu buněk včas, potřebný ke zdvojnásobení počtu buněk v populaci • lifespan (délka života) čas, potřebný ke zdvojnásobení počtu buněk v populaci • lifespan (délka života)lifespan (délka života) geneticky naprogramovaný počet dělení buňky • kontaktní inhibice lifespan (délka života) geneticky naprogramovaný počet dělení buňky • kontaktní inhibice zástava proliferace po dosažení určité limitní saturační density zástava proliferace po dosažení určité limitní saturační density Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 22.2.2012Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 22.2.2012 58 Kontaktní inhibiceKontaktní inhibice Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 22.2.2012Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 22.2.2012 59 Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 22.2.2012Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 22.2.2012 60 Diploidní buněčné linie:Diploidní buněčné linie: • normální nenádorové buňky • omezená délka života in vitro • normální nenádorové buňky • omezená délka života in vitro • standardní karyotyp (diploidní) • obvykle anchorage-dependent • standardní karyotyp (diploidní) • obvykle anchorage-dependenty g p (vyžadují substrát k přichycení) • schopnost kontaktní inhibice y g p (vyžadují substrát k přichycení) • schopnost kontaktní inhibice • tzv. "stárnutí kultury" = změna morfologie a růstových parametrů se vzrůstající dobou v d í ká h i it • tzv. "stárnutí kultury" = změna morfologie a růstových parametrů se vzrůstající dobou v d í ká h i itpodmínkách in vitro • LEP (lidské embryonální plíce) HPLC (lidské lymfocyty periferní krve) podmínkách in vitro • LEP (lidské embryonální plíce) HPLC (lidské lymfocyty periferní krve) Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 22.2.2012Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 22.2.2012 HPLC (lidské lymfocyty periferní krve)HPLC (lidské lymfocyty periferní krve) 61 Stabilizované buněčné linie: nádorově transformované buňky Stabilizované buněčné linie: nádorově transformované buňky• nádorově transformované buňky • neomezený generační potenciál = nesmrtelnost v podmínkách in vitro • nádorově transformované buňky • neomezený generační potenciál = nesmrtelnost v podmínkách in vitrov podmínkách in vitro • kratší PDT, redukovaná závislost na podkladu b kl h t l id í l id í v podmínkách in vitro • kratší PDT, redukovaná závislost na podkladu b kl h t l id í l id í• obvykle heteroploidní, resp. aneuploidní • často bez schopnosti kontaktní inhibice • obvykle heteroploidní, resp. aneuploidní • často bez schopnosti kontaktní inhibice • lidské adherované: HeLa, A431, MCF-7… lidské suspenzní: HL-60, Jurkat, HeLa-S… L929, 3T3 (myší fribroblasty), • lidské adherované: HeLa, A431, MCF-7… lidské suspenzní: HL-60, Jurkat, HeLa-S… L929, 3T3 (myší fribroblasty),L929, 3T3 (myší fribroblasty), CHO (chinese hamster ovary) MDCK (Madine-Darby canine kidney) VERO (African green monkey kidney) L929, 3T3 (myší fribroblasty), CHO (chinese hamster ovary) MDCK (Madine-Darby canine kidney) VERO (African green monkey kidney) Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 22.2.2012Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 22.2.2012 VERO (African green monkey kidney)VERO (African green monkey kidney) 62 Rozdíl v počtu chromosomů během kultivaceRozdíl v počtu chromosomů během kultivace ál í b ňkál í b ňknormální buňky (gliové buňky) normální buňky (gliové buňky) transformované buňky (maligní melanom) transformované buňky (maligní melanom)(maligní melanom)(maligní melanom) Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 22.2.2012Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 22.2.2012 63 PRAKTICKÉ APLIKACEPRAKTICKÉ APLIKACEPRAKTICKÉ APLIKACEPRAKTICKÉ APLIKACE Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 22.2.2012Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 22.2.2012 64 • základní výzkum (buněčná biologie, cytogenetika onkologie imunologie biochemie • základní výzkum (buněčná biologie, cytogenetika onkologie imunologie biochemiecytogenetika, onkologie, imunologie, biochemie, molekulární biologie, virologie…) • prenatální diagnostika cytogenetika, onkologie, imunologie, biochemie, molekulární biologie, virologie…) • prenatální diagnostikap g • toxikologie (testy léčiv, kosmetických přípravků, implantátů d kč í di í (IVF) p g • toxikologie (testy léčiv, kosmetických přípravků, implantátů d kč í di í (IVF)• reprodukční medicína (IVF) • klinická onkologie (typizace nádorů, testování multidrug resistance hodnocení markerů) • reprodukční medicína (IVF) • klinická onkologie (typizace nádorů, testování multidrug resistance hodnocení markerů)multidrug resistance, hodnocení markerů) • výroba očkovacích látek (virové vakcíny) • průmyslová výroba specifických buněčných multidrug resistance, hodnocení markerů) • výroba očkovacích látek (virové vakcíny) • průmyslová výroba specifických buněčnýchp y ý p ý ý produktů (transgenní linie) • příprava buněčných a tkáňových derivátů (např. kůže) p y ý p ý ý produktů (transgenní linie) • příprava buněčných a tkáňových derivátů (např. kůže) Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 22.2.2012Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 22.2.2012 kůže)kůže) 65 Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 22.2.2012Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 22.2.2012 66 Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 22.2.2012Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 22.2.2012 67 KRYOKONZERVACE, ARCHIVACE, Í Á Š Ě KRYOKONZERVACE, ARCHIVACE, Í Á Š ĚSBÍRKOVÁ PRACOVIŠTĚSBÍRKOVÁ PRACOVIŠTĚ Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 22.2.2012Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 22.2.2012 68 Kryokonzervace živočišných buněk • kultura v exponenciální fázi růstu Kryokonzervace živočišných buněk • kultura v exponenciální fázi růstu• kultura v exponenciální fázi růstu • po trypsinizaci resuspendování v zamražovací směsi: • kultura v exponenciální fázi růstu • po trypsinizaci resuspendování v zamražovací směsi: 90% sérum (FCS) + 10% kryoprotektivum (DMSO, glycerol) • dvoustupňové zamražování: 90% sérum (FCS) + 10% kryoprotektivum (DMSO, glycerol) • dvoustupňové zamražování:• dvoustupňové zamražování: "pomalý krok" (optimální pokles o 1oC za minutu) "rychlý krok" (přemístění kryoampulí z -8OoC do • dvoustupňové zamražování: "pomalý krok" (optimální pokles o 1oC za minutu) "rychlý krok" (přemístění kryoampulí z -8OoC do -yc ý o (p e stě yoa pu 8O C do 15OoC (hlubokomrazící boxy) nebo do -196oC (kontejnery s tekutým dusíkem) • rozmražování: yc ý o (p e stě yoa pu 8O C do 15OoC (hlubokomrazící boxy) nebo do -196oC (kontejnery s tekutým dusíkem) • rozmražování:• rozmražování: nejprve rychlé ohřátí (rozmražení směsi), pak pomalé přidávání vychlazeného média (cca 1ml za i ) • rozmražování: nejprve rychlé ohřátí (rozmražení směsi), pak pomalé přidávání vychlazeného média (cca 1ml za i ) Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 22.2.2012Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 22.2.2012 minutu)minutu) 69 PříkladyPříklady kryoprotektiv:kryoprotektiv: glyceroldimethylsulfoxid (DMSO) Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 22.2.2012Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 22.2.2012 70 ž á í ř ž í ěž á í ř ž í ěVliv rychlosti zamražování na přežití buněk:Vliv rychlosti zamražování na přežití buněk: Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 22.2.2012Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 22.2.2012 71 Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 22.2.2012Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 22.2.2012 72 American Type Culture Collection (ATCC)American Type Culture Collection (ATCC) Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 22.2.2012Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 22.2.2012 73 European Collection of Cell Cultures (ECACC)European Collection of Cell Cultures (ECACC) Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 22.2.2012Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 22.2.2012 74 Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 22.2.2012Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 22.2.2012