Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie RNDr. Jakub Neradil, Ph.D. Ústav experimentální biologie PřF MU FERTILIZACE A EMBRYOGENEZE Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2012 - 05 / 21.3. Program přednášky: • meióza a gametogeneze • mechanismy fertilizace • časná embryogeneze • hybridi a chiméry Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2012 - 05 / 21.3. Způsoby rozmnožování eukaryot Nepohlavní rozmnožování • potomstvo geneticky identické s rodičovským organismem Pohlavní rozmnožování • původní kombinace genů zanikají a vznikají nové → každý organismus je geneticky jedinečný • kompetitivní selekční výhoda pro organismy v nepředvídatelně variabilním prostředí Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2012 - 05 / 21.3. HAPLOIDIEDIPLOIDIE FÚZE GAMET MEIÓZA Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2012 - 05 / 21.3. MEIÓZA Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2012 - 05 / 21.3. MEIÓZA • dvě po sobě jdoucí dělení: I. meiotické (heterotypické, redukční) II. meiotické (homeotypické, ekvační) Genetický význam meiózy: • redukce počtu chromozomů při tvorbě pohlavních buněk • v gametách 2n (223 = 8.388.608) možných kombinací chromosomů (pak ještě zvýšeno crossing-overem) • párování homologických chromosomů, které umožňuje crossing-over a tím i rekombinaci genů Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2012 - 05 / 21.3. Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2012 - 05 / 21.3. Schéma kombinace chromozomů v gametách Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2012 - 05 / 21.3. Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2012 - 05 / 21.3. Stádia meiotického dělení • Premeiotická interfáze • Meióza I: profáze I: leptotene zygotene pachytene diplotene diakineze metafáze I, anafáze I, telofáze I • Meióza II: profáze II, metafáze II, anafáze II, telofáze II Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2012 - 05 / 21.3. Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2012 - 05 / 21.3. Tvorba bivalentů a crossing-over Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2012 - 05 / 21.3. Chromatidy v průběhu I.profáze Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2012 - 05 / 21.3. SYCP (synaptonemal complex protein ) 1 - 3 Synaptonemální komplex Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2012 - 05 / 21.3. Synaptonemální komplex Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2012 - 05 / 21.3. Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2012 - 05 / 21.3. Poruchy meiózy a jejich genetické důsledky a) Nerovnoměrný crossing-over • v profázi I • důsledek: delece a duplikace daného chromozomu v polovině gamet Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2012 - 05 / 21.3. Poruchy meiózy a jejich genetické důsledky b) Neoddělení (nondisjunkce) • sesterské chromatidy v anafázi II • porucha centromer nebo porucha mitotického aparátu • důsledek: aneuploidie Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2012 - 05 / 21.3. GAMETOGENEZE Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2012 - 05 / 21.3. Porovnání spermatogeneze a oogeneze Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2012 - 05 / 21.3. GAMETOGENEZE: SPERMATOGENEZE • primordiální zárodečná buňka (spermatogonie) (46, soustavně se mitoticky dělí) • spermatocyt I. řádu (46, probíhá meióza I.) • spermatocyt II. řádu (23, probíhá meióza II.) • spermatida (23, dozrává bez dalšího dělení) • spermie (23, uvolňují se do lumina semenných kanálků) 1 spermatogonie   4 haploidní rovnocenné spermie Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2012 - 05 / 21.3. Průběh spermatogeneze Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2012 - 05 / 21.3. Morfologie spermie Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2012 - 05 / 21.3. GAMETOGENEZE: OOGENEZE • primordiální zárodečná buňka (46, mitotické dělení) • oogonium (46, mitóza, ve 3.měsíci po oplození vývoj v oocyty) počet zárodečných buněk v ovariu během života Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2012 - 05 / 21.3. GAMETOGENEZE: OOGENEZE • oocyt I. řádu (46, začne meióza I, zastavení v profázi ještě před narozením, při dozrávání se dělící vřeténko přesunuje k periferii buňky – nerovnoměrné dělení) • oocyt II. řádu (+ pólocyt) (23, vstupuje do meiózy II, zastavení v metafázi II.) • ovum (+ pólocyt) (23, meióza dokončena v případě oplození) Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2012 - 05 / 21.3. Průběh oogeneze 1 oogonium  1 zralé vajíčko + 2-3 pólocyty Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2012 - 05 / 21.3. Stádia folikulu Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2012 - 05 / 21.3. REGULACE OOGENEZE 1. regulační bod = diplotene meiózy I • dlouhodobé zablokování buněčného cyklu (u člověka až 50 let); u některých živočišných druhů až do fertilizace • dekondenzace chromosomů, počet = 4n • transkripční aktivita → akumulace materiálu pro časnou embryogenezi, růst oocytu Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2012 - 05 / 21.3. REGULACE OOGENEZE 1. regulační bod = diplotene meiózy I • hormonální stimulace (LH) → Cdk1/cyklin B (MPF = maturation promoting factor) → kondenzace chromosomů, rozpad jaderné membrány, formování spindlu • anaphase - promoting complex → spouští anafázi • pouze částečná deaktivace Cdk1 přetrvávající M-fáze (kondenzovaný chromatin, bez jaderné membrány) Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2012 - 05 / 21.3. REGULACE OOGENEZE 2. regulační bod = metafáze meiózy II • u většiny obratlovců až do fertilizace • po cytokinezi I.meiózy - zvýšení aktivity MPF • anaphase-promoting komplex syntetizován až po fertilizaci (do té doby blokován) Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2012 - 05 / 21.3. MECHANISMY FERTILIZACE Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2012 - 05 / 21.3. Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2012 - 05 / 21.3. Kapacitace • 5-6 hodin (člověk) • změny lipidů a glykoproteinů plazmatické membrány (ztráta cholesterou → zvýšení fluidity) • změna membránového potenciálu (efflux K+) • influx Ca+ a HCO3 - → aktivace adenylátcyklázy → syntéza cAMP → indukce kapacitace • zvýšení metabolismu a pohyblivosti spermie Kontakt spermie a oocytu • 300 miliónů spermií v ejakulátu → 200 spermií v místě fertilizace ve vejcovodu • termotaxe, změna teploty až o +2°C • chemoatraktanty uvolňované folikulárními buňkami Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2012 - 05 / 21.3. Zona pellucida • extracelulární matrix oocytu (specifické složení) • 3 typy glykoproteinů (ZP2+ZP3, ZP1) • bariéra mezidruhové fertilizace • ZP3 - receptor druhově specifické vazby, na něj se váže GalT (galaktosyl transferáza) spermie Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2012 - 05 / 21.3. Akrosomální reakce • obsah akrosomu uvolněn exocytózou • vazba na ZP3 - indukuje zvýšení koncentrace Ca2+ v cytoplazmě spermií → exocytóza • hydrolytické enzymy → průchod zonou pellucidou • vazba proteinů vnitřní akrozomální membrány spermie na ZP2 Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2012 - 05 / 21.3. Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2012 - 05 / 21.3. Mechanismus fúze spermie a oocytu • u většiny druhů nejasný • u myši: vazba proteinů ADAM na intergriny oocytu • Fertiliny (α, β) – patří do skupiny ADAM, transmembránové proteiny spermií s vazebnou doménou pro integriny oocytu • CD9 nutný pro fúzi plazmatických membrán • po fúzi exocytóza kortikálních granulí Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2012 - 05 / 21.3. Průběh fertilizace vznik polárního tělíska změna konc. Ca2+ Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2012 - 05 / 21.3. Fúze prvojader • u nižších živočichů ihned po fúzi gamet • u savců pouze prostorové přiblížení prvojader • dekondenzace chromatinu, replikace DNA • přiblížení prvojader pomocí MT z centriolu spermie • rozpad jaderných membrán až při prvním mitotickém dělení zygoty • navázání chromozomů na spindl tvořený z centriolu spermie Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2012 - 05 / 21.3. Mechanismy blokující polyspermii • primární blok: depolarizace plazmatické membrány oocytu po fúzi s první spermií • sekundární blok - kortikální reakce oocytu: uvolnění obsahu kortikálních granulí → enzymy měnící vlastnosti zony pellucidy (štěpení ZP2, hydrolýza cukerných zbytků na ZP3) • intracelulární zvýšení koncentrace Ca2+ (vede k dokončení II. meiotického dělění) Důsledky polyspermie: více centriolů → multipolární spindl → porucha segregace chromosomů → nondisjunkce → aneuploidie → zástava vývoje Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2012 - 05 / 21.3. ČASNÁ EMBRYOGENEZE Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2012 - 05 / 21.3. Časná embryogeneze u obojživelníků: • velmi krátký buněčný cyklus (30 min) • zmenšování objemu dceřinných buněk Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2012 - 05 / 21.3. Časná embryogeneze u obojživelníků: • 3 fáze vývoje: rýhování, gastrulace, neurulace • celkem 24h • 1. a 2. dělení vertikálně, 3. ekvatoriálně • 5. dělení = 32 buněk = blastula • 12. dělení = ±4000 buněk = midblastula • dělení už nejsou synchronizována, zpomalují se Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2012 - 05 / 21.3. Časná embryogeneze u savců: • zygota – 1. dělení po 24h, 2. a 3. po dalších 12h • vznik blastomer • morula - do 32 buněk • blastocysta – od 64 buněk, trofoektoderm (3/4), inner cell mass = ICM (1/4), blastocoel, zona pelucida Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2012 - 05 / 21.3. Gustav Klimt – Danae (1908) Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2012 - 05 / 21.3. Časná embryogeneze u savců: • diferenciace trofoektodermu a) polární část – přiléhá k ECM, proliferuje b) murální část – kolem blastocoelu, velké polyploidní b. • diferenciace ECM a) epiblast – základ pro 3 zárodečné vrstvy b) hypoblast – extraembryonální tkáň • Hatching – opuštění zony pelucidy, v děloze, proteolytické enzymy produkované trofoblastem Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2012 - 05 / 21.3. Průběh časné embryogeneze u myši Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2012 - 05 / 21.3. Průběh časné embryogeneze u člověka Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2012 - 05 / 21.3. Tvorba a umístění zárodečných listů u lidského embrya Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2012 - 05 / 21.3. Inaktivace chromozomu X • v časné blastocystě inaktivace paternálního X • zůstává inaktivován v extraembryonálních tkáních • v ICM se inaktivace ztrácí - později náhodná inaktivace Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2012 - 05 / 21.3. TVORBA HYBRIDŮ A CHIMÉR Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2012 - 05 / 21.3. HYBRID • z genetického pohledu potomek vzniklý pohlavním rozmnožováním dvou odlišných homozygotů stejného druhu =>heterozygot • z taxonomického pohledu potomek vzniklý z křížení mezi 2 jedinci odlišného taxonu  v rámci druhu (poddruhy)-tygr bengálský x sibiřský  mezi druhy - tygr x lev  mezi rody - ovce x koza  mezi čeleděmi - výjimečně  mezi řády - u živočichů není známo Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2012 - 05 / 21.3. MEZIDRUHOVÝ HYBRID • křížení v rámci rodu • potomek fenotypově podobný rodičům • často infertilní (různý počet chromosomů) • odlišnosti v námluvních rituálech, páření a chování • jiná sezóna páření • antigenní reakce na spermie Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2012 - 05 / 21.3. mul, mezek (63 chr.) osel (62 chr.) x kůň (64 chr.) klisna x osel oslice x hřebec Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2012 - 05 / 21.3. zeedonk, zonkey osel (62 chr.) x zebra (32- 46 chr.) Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2012 - 05 / 21.3. liger, tigon lev (38 chr.) x tygr (38 chr.) Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2012 - 05 / 21.3. MEZIRODOVÝ HYBRID • křížení odlišných rodů • přirozeně výjimečný výskyt (Toast of Botswana) • možnost (nutnost) asistované inseminace (cama) Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2012 - 05 / 21.3. „Toast of Botswana“ (57 chr.) r.2000 ovce (54 chr.) x koza (60 chr.) odliš Geep = chiméra Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2012 - 05 / 21.3. cama velbloud (74 chr.) x lama (74 chr.) Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2012 - 05 / 21.3. CHIMÉRA řecky Χίμαιρα (Chímaira); latinsky Chimaera Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2012 - 05 / 21.3. CHIMÉRA organismus obsahující alespoň 2 geneticky odlišné buněčné populace původem z odlišných zygot Vznik: • ze 4 buněk- dvě zygoty (tetragametická ch.) • ze 3 buněk – (partenogenetická ch.) • transplantací kostní dřeně (přenos kmenových buněk) • spojením cévních oběhů (anastomózy) u dvojvaječných dvojčat • z časného embrya a diploidních buněk (fůzí, injekcí) Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2012 - 05 / 21.3. Tetragametický chimerismus • vrozený chimerismus - u lidí výjimečně (běžné u primátů) • spojením dvou zygot (časných embryí) • riziko i při asistované reprodukci • organismus obsahuje dvě odlišné sady chomozomů • orgány a tkáně mají jiný původ • viditelné rozdíly: barva očí, vlasů, „Hitchhiker's thumb„ (AR), Blaschkovy linie, pohlaví může být hermafroditní (46,XX/46,XY), 2 populace krvinek (imunologická tolerance obou skupin) Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2012 - 05 / 21.3. Hitchhiker's thumb Blaschkovy linie Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2012 - 05 / 21.3. Tetragametický chimerismus Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2012 - 05 / 21.3. Partenogenetický chimerismus • oocyt podléhá partenogenezi a rozdělí se • vznik 2 haploidních buněk • oplozeny 2 spermiemi Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2012 - 05 / 21.3. Androgenetický chimerismus • standardní fertilizace oocytu spermií (23,X) • vznik sekundárního polárního tělíska • endoreplikace parentálního prvojádra • vznik 1 diploidní buňky (46,XX) a 1haploidní (23,X) • haploidní buňka podléhá endoreplikaci ->androgenetická linie Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2012 - 05 / 21.3. VYUŽITÍ CHIMÉR VE VÝZKUMU • studium vývoje savčího embryogeneze • ověření podílu kmenových buněk na vývoji embrya • tvorba „nových druhů“ • medicínský význam • příprava - agregačně - injikačně Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2012 - 05 / 21.3. D6 D9,5 srdce chimerické myši Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2012 - 05 / 21.3. počet: cca 0,02% BM MNC definice: Sca-1+ (stem cell antigen-marker HSC) lin- (lineage-negative) CD45- (Leukocyte Common Antigen) exprimují: SSEA-1, Oct-4, Nanog, Rex-1 velikost: 2-4 µm schopnost diferenciace do různých linií 3 zárodečných vrstev Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2012 - 05 / 21.3. KARDIOMYOCYTY NEURONY OLIGODENDROCYTY PANKREATICKÉ BUŇKY Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2012 - 05 / 21.3. Schéma experimentu VSEL (GFP+) 8-cell embryo 24 h 3-4 dny Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2012 - 05 / 21.3. Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2012 - 05 / 21.3. Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2012 - 05 / 21.3. Chiméry: tvorba „nových druhů“ geep (kovce?) chiméra kozy a ovce (ne hybrid) poprvé v roce 1978 Austrálie, Dr R.S. White Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2012 - 05 / 21.3. Chiméry: medicínský význam Výzkum krvetvorby a krevních chorob: • hematopoetické kmenové b. z lidských fetálních jater • intraperitoneální injekce do fetu ovce • lymfoidní prekurzory přetrvávaly až 3,5 roku po transplantaci Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2012 - 05 / 21.3. Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2012 - 05 / 21.3. Náhrada orgánů • prekurzorové ledvinové b. z lidské fetální tkáně • transplantace do myšího embrya • diferenciace ve funkční nefrony a podpůrné tkáně • tvorba miniaturního funkčního orgánu - produkce moči Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2012 - 05 / 21.3. Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2012 - 05 / 21.3. Výzkum neurodegenerativních chorob: • hESCs implantovány do myšího fetálního mozku • diferenciace ve funkční linie neurálních buněk Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2012 - 05 / 21.3. 2 dny po injekci D 8,5