Primární a sekundární struktura DNA Nukleosom a chromatinové vlákno Chromosomy a genom Základní poznatky o struktuře genomu Primární a sekundární struktura DNA DNA je tvořena nukleotidy (báze+cukr+fostátová skupina), které jsou uspořádány do řetězce. Dva řetězce pak tvoří dvoušroubovici. Báze nukleotidů jsou odvozeny od pyrimidinů nebo od purinů. Jsou to nenasycené sloučeniny s dvojitými vazbami, struktura je plošná, absorbují UV světlo. Hlavní pyrimidiny a puriny obsažené v nukleotidech jsou: Pyrimidiny a puriny v DNA Supercoiled DNA Reálná DNA může mít větší nebo menší počet otáček než odpovídá její přirozené struktuře. To je kompenzováno vytvořením vyšší šroubovice (DNA supercoiling). Kruhové genomy bakteriální DNA tvoří nadšroubovici (5 otáčet na 1000 bp. Lineární chromosomy mohou mít také oblasti se supercoiled DNA. Komplementarita DNA umožňuje replikaci DNA koduje aminokyseliny Genetický kód je systém pravidel, které přiřazují posloupnost nukleotidů v DNA aminokyselinám. Tento kód je využit v živých buňkách a je universální. Vznik kódu je předmětem teorií: 1) afinita aminokyselin k jejich tripletům – možná se dříve syntéza děla přímo, tj. bez tRNA 2) vývoj prostřednictvím selekce tak, aby byl co nejmenší počet chyb (mutací) Od DNA k proteinu Transkripce DNA DNA RNA Protein Syntéza mRNA Syntéza proteinu aminokyseliny mRNA koduje aminokyseliny Kód je -degenerovaný (existuje 43=64 komb.) -skryté mutace -stop kodon (UAG, UGA, UAA) -důležitá je fáze čtení -variace: -mykoplasma (UGA je tryptofan) -bičíkovci (UAG je glutamin) -candida (CUG – Serin) Genetická informace v DNA Gen A Gen B Gen C Protein A Protein B Protein C Exprese genů dvojšroubovice DNA Sestřih – u eukaryot DNA jako součást chromatinu V eukaryotických jádrech – chromatin=DNA + histony + další proteiny. Histony (H2A a H2B) a (H3 a H4) tvoří dimery, ty tvoří tetramery a dohromady pak vzniká oktamer – kolem se vine DNA (146 bp) a vytváří tak nukleosom. Spojnice = 56 bp. Histony jsou zásadité proteiny, bohaté na lysin a arginin (R-skupiny mají kladný náboj, který interaguje se záporným nábojem fosfátových skupin DNA). Histony jsou vysoce konzervovány u eukaryot. Denaturace DNA Je to oddělení komplementárních řetězců. Může nastat teplotou (95oC – kompletní). Denaturační teplota (Tm) – teplota, při které je polovina DNA oddělená. Denaturace je doprovázená zvýšením absorpce UV. Denaturační křivka – závislost absorbance na T. Tm závisí na obsahu GC párů. Chromatinové vlákno 6-8 nukleos. Histon H1 30 nm 11 nm 6 nm Spojovací DNA Nukleosom Nukleosomové jadro Chromatinové vlákno Sekvenčně specifické proteiny Nukleosomy 30-nm chromatinové vlákno s nukleosomy a navázanými proteiny Struktura chromatinu Roztažená a částěčně roztažená Kondensováná forma forma chromatinu forma chromatinu DNA Buňka Chromosom Genom v jádře DNA, nukleosomy, chromatin, chromosom a genom Nukleosomy Chromatinové vlákno RNA v buňce Ribosomální RNA (rRNA) 80% celkové RNA, část ribosomů Transferová RNA (tRNA) – nese aktivovanou aminokyselinu na ribosom Messengerová RNA (mRNA) – nese info z DNA na ribosomy pro odpovídající protein Malá RNA – regulace exprese Chromosomy Úvod - mitotické a interfázní chromosomy Barvení chromosomů (klasika, FISH) Významné elementy chromosomů CT a jejich části jsou disjunktní Subdomény CT Chromosom jako náhodný polymer Nenáhodná vnitřní struktura CT Chromosomy-složení Chromosom obsahuje jedinou molekulu DNA spojenou s proteiny: a) 5 druhů molekul histonů – proteiny bohaté na lysina a arginin – proto s pozitivním nábojem. Proto se vážou silně s negativně nabitými fosfátovými skupinami DNA b) různé proteiny nehistonové povahy- většinou jsou to transkripční faktory Chromosomy-struktura Interfáze vs mitóza – stupeň kondenzace, v mitóze dobře viditelné V S-fázi dochází k syntéze DNA, a proto v mitóze pozorujeme chromosomy duplikované, složené ze dvou sesterských chromatid spojených v centromerické oblasti V oblasti centromery jsou přítomny proteiny kinetochory, které se vážou na vlákna dělícího vřeténka Ramena se označují p-raménko (kratší) a q-raménko Barvení Giemsou zviditelní sérii pruhů (tzv. G-pruhy) Chromosomy-počty Všechna zvířata mají charakteristický počet chromosomů ve svém těle, tzv. diploidní počet (2n) Ty se vyskytují jako homologní páry, každý z páru byl získán od jednoho z rodičů Pohlavní buňky obsahují haploidní počet chromosomů 216Přeslička rolní Equisetum arvense 200Rak Cambarus clarkii 2Červ Parascaris equorum 2Mravenec Myrmecia pilosula 20Pšenice 78Kuře 78Pes 36Žába Xenopus laevis (jižní Afrika) 10Arabidopsis thaliana (rostlina) 32Kvasinky (Sacharomyces cerevisie) 12Mikroskopický červ Caenorhabditis elegans 8Drosofila melanogaster 40Myš 46Člověk Chromosomy-počty R-pruhy Klasické barvení chromosomů Chromosom 11 barvený Giemsou G-pruhy Barvení chromosomů - G-banding Lidské chromosomy obarvené pomocí multicolor FISH Lidské chromosomy obarvené pomocí multicolor FISH Translokace detekovaná pomocí m-FISH Významné sekvence na chromosomech Na chromosomech rozlišujeme: telomery (konce chromosomů obsahující sekvence zajišťující zachování délky chromosomu) centromery (účastní se při segregaci chromosomů v mitóze) počátky replikace (více míst, kde začíná replikace) telomera počátek replikace centromera interfáze mitóza interfáze mitotické vřeténko duplikované chromosomy Typy chromosomů podle umístění centromery Centromery – identifikovatelné jako místa konstrikce, v nichž jsou chromatidy spojeny k sobě, odpovědné za segregaci CT, fixovány na určité místo v CT, mají určitou sekvenci. Tyto sekvence mohou být stejné nebo podobné pro více CT. Centromery mají odlišné histony Centromery – jsou tvořeny alfa-satelitní DNA, obsahují kinetochorové proteiny, zajišťují připojení chromosomu k vřeténku a dělení chromosomu do dceřiných buněk. Centromery obsahují specifický histon CENPA, mají schopnost vytvářet chromocentra a účastní se regulace exprese. Na obr. pericentromerické satelity (šipky). Bloky repetic obsahují občas LINEs a SINEs (interspersed elements). Orientace mohou být stejné nebo opačné. Centromerické oblasti obsahují alfa satelity (obsahují 5 monomerů) – modře. Struktura centromery higher order repeat centromere DNA α satelite DNA monomer 17 nucleotide pairs Centric heterochromatin kinetochore on centromereSpindle microtubules kinetochore outer plate formed from special proteins Heterochromatin formed on α satelite DNA Kinetochore inner plate formed by kinetochore proteins bound a satelite DNA Významné sekvence na chromosomech Telomery – problém při replikaci na konci lineárních molekul DNA se řeší speciální sekvencí (tandem GGGTTA – až 10 kbp), která váže enzym telomerázu, tj. enzym, který funguje v komplexu s krátkým úsekem RNA, podle kterého syntetizuje (jako reverzní transkriptáza) malé úseky DNA na koncích chromosomů. Významné sekvence na chromosomech Počátky replikace – replikace běží v obou směrech od společného počátku (50 bp/s), který je charakterizován určitým typem sekvence; v lidském genomu je mnoho počátků replikace (103). Replikace je aktivována v klastrech a probíhá nejdříve pro méně kondensovaný chromatin. Vizualizace více DNA sekvencíVizualizace více DNA sekvencí inin vivovivo pomocí GFPpomocí GFP Sadoni et al., JCB 2000 Chromosomová teritoria (CT) První experimenty, které vedly k závěru, že chromosomy se nacházejí v jádře v podobě ohraničených domén, byly pokusy T. Cremera v létech 1982-1984. Zavedení FISH podstatně urychlilo poznání chromosomů jak v mitóze, tak v interfázi. Chromosomová teritoria se nepřekrývají; ani jejich části Funkční uspořádání genomu v jádře Chromosom Jadérko Proteinový komplex Jaderné pory Chromatinová vlákna Transkripce Chromosomy Úvod - mitotické a interfázní chromosomy Barvení chromosomů (klasika, FISH) Významné elementy chromosomů CT a jejich části jsou disjunktní Subdomény CT Chromosom jako náhodný polymer Nenáhodná vnitřní struktura CT Struktura CT – CT je tvořeno subdoménami Verschure et al., 1999 – H2B+GFP a nascentní mRNA (BrUTP) + Cy3 ukazuje, že mRNA se nachází mezi chromatinem vizualizovaným pomoci GFP. Struktura CT - schéma Chromosomy Úvod - mitotické a interfázní chromosomy Barvení chromosomů (klasika, FISH) Významné elementy chromosomů CT a jejich části jsou disjunktní Subdomény CT Chromosom jako náhodný polymer Nenáhodná vnitřní struktura CT Náhodný (Gausovský) polymer v jádře buňky (jsou zobrazeny 2 body polymeru R a R´) 〈L2〉 ≈ n L Střední vzdálenosti mezi genetickými elementy v závislosti na jejich molekulárních vzdálenostech (H. Yokota et al., 1995) Genomic separation [Mbp] Genomic separation [Mbp] Meansquareddistances[µm2] Meansquareddistances[µm2] A random-walk/giant-loop model Interfázního jádra (Sachs et al., 1995) flexible backbone" straight for visual clarity only "gian" loops" Multi-loop subcompartment model (Münkel et al., 1999) Existence disjunktních CT Existence subdomén uvnitř CT Schéma modelu L2(n) závislsot pro velké molekulární vzdálenosti podle MLS modelu Genomic separation [Mbp] Meansquareddistances[µm2] Nárůst do 50 Mbp lze vysvětlit buď náhodným polymerem (exponent 0.5 v log-log měřítku) nebo MLS modelem. Pro větší vzdálenosti odpovídá exponent 0.3 spíše globulární struktuře popsané v MLS modelu. Chromosomy Úvod - mitotické a interfázní chromosomy Barvení chromosomů (klasika, FISH) Významné elementy chromosomů CT a jejich části jsou disjunktní Subdomény CT Chromosom jako náhodný polymer Nenáhodná vnitřní struktura CT Použití více DNA prob pro tentýž chromosom Signály z první hybridizace lze rozlišit v druhé 1st hybridization – 6 probes 2nd hybridization – 3 probes p-arm: red 1 yellow 1 green 1 p-arm: red 1 yellow 1 green 1 q-arm: green 2 yellow 2 red 2 Cytometrie s vysokým rozlišením – nalezení signálů Topografické parametry jsou vypočteny pro každý signál – souřadnice x, y, z v těžišťovém systému jádra, intensita, výška, velikost apod. Zpracování dat Souřadnice a další parametry lze uložit do textového souboru a exportovat z programu FISH 2.0 V průběhu další analýzy CT lze vzájemně porovnat a zkoumat míru podobnosti: • Podobnostní funkce – definice a výpočet pro sérii CT • Jsou vypočtena těžiště CT a posunuta do jednoho bodu • CT jsou rotována v 3D prostoru tak, abychom dostali co nejlepší hodnotu podobnostní funkce • Definice klastrů genetických lokusů a výpočet jejich disperze CT jsou vzájemně porovnány CT jsou stejná CT se velmi liší Definice podobnostní funkce pro 2 teritoria Podobnost je definována jako minimální možná hodnota funkce S2 S2= Σ(Σ(Σ(Σ(∆∆∆∆xyellow)2 +Σ(+Σ(+Σ(+Σ(∆∆∆∆xgreen)2 + +Σ(+Σ(+Σ(+Σ(∆∆∆∆xblack)2+Σ(+Σ(+Σ(+Σ(∆∆∆∆xblue)2 ∆∆∆∆x Použijeme translace a rotace pro superponování CT Definice míry podobnosti pro více CT Superposice teritorií jedné na druhou metodou nejmenších čtverců S2=Σ(Σ(Σ(Σ(∆∆∆∆xyellow)2 + +Σ(+Σ(+Σ(+Σ(∆∆∆∆xgreen)2 +Σ(+Σ(+Σ(+Σ(∆∆∆∆xblack)2 +Σ(+Σ(+Σ(+Σ(∆∆∆∆xblue)2 ∆∆∆∆x1 ∆∆∆∆x2 ∆∆∆∆x3 ∆∆∆∆x4 Ukážeme metodu na příkladu 2 lokusů CT se 2 lokusy 2 CT se 2 lokusy každá Křížkem jsou označená těžiště Těžiště lze posunout do stejného bodu a CT lze rotovat tak, abychom dostali lokusy na stejnou osu, červené k sobě a bílé k sobě. Bin 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 Frequency 0 2 4 6 8 10 12 14 Standard deviation/Mean = 0.48 Výsledky rotace vidíme pro reálné lokusy HSA 17 Col 2 vs Col 3 vs Col 4 Col 5 vs Col 6 vs Col 7 Bin 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 Frequency 0 2 4 6 8 10 Standard deviation/Mean = 0.38 AC09084 17q21.1 AC03616 17p13.3 Lze vypočítat rozdělení vzdáleností a poměr R=S.D./Mean Porovnání s náhodným modelem: 300 dvojic bodů byly náhodně generovány v prostoru podle Gaussovy distribuce Bin 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 Frequency 0 10 20 30 40 50 60 70 Standard deviation / Mean value = 0.5 Rayleigho rozdělení vede k závěru, že interfázní chromosom se chová jako volně plovoucí polymer Rayleigh distribution, R=0.5 Uvažujme nyní 3 genetické elementy • Vypočteme těžiště trojúhelníků, • Položíme je do jednoho bodu • Rotujeme trojúhelníky tak, abychom dostali signály stejné barvy co nejblíže k sobě • Genetické elementy stejného typu vytvoří klastry Polární struktura chromosomových teritorií CT 8 CT 8 CT 9 CT 9 CT 19 CT 19 Go-lymphocytes Stimulated lym CT 8 in Go-lymphocytes <45o Porovnání s náhodným modelem:Porovnání s náhodným modelem: 3 elementy3 elementy náhodně generovány po rotacináhodně generovány po rotaci Side view – elements are located in one plane 60o Porovnání s náhodnými modely:Porovnání s náhodnými modely: 3 elementy3 elementy náhodně generovány v prostoru po rotaci kolemnáhodně generovány v prostoru po rotaci kolem jednoho z nichjednoho z nich Podle náhodných modelů by úhly rovnostranného Trojúhelníku měly být 60o Menší hodnoty získané v experimentu představují důkaz nenáhodného uspořádání CT 60o Více genetických elementů:Více genetických elementů: 55 lokusůlokusů CT 17 uCT 17 u GoGo-- aa stimulovaných lymfocytůstimulovaných lymfocytů Go-lymphocytes Stimulated lymphocytes Porovnání s náhodnými modely:Porovnání s náhodnými modely: pro vícepro více elementů se zmenšuje jejich vzájemnáelementů se zmenšuje jejich vzájemná vzdálenost po rotacivzdálenost po rotaci Points restricted in a spatial volume Gaussian distribution Orientace CT v jádrech buněkOrientace CT v jádrech buněk Mean position 1) Buněčná jádra rotujeme tak, abychom dostali CT na jednu osu 2) Vypočte se střední poloha CT na této ose Transformace CT v jádře buňkyTransformace CT v jádře buňky 3) Těžiště CT posuneme podél osy do jednoho bodu – střední polohy 4) Vezmeme tenký řez jádrem kolem roviny vedoucí přes střed jádra a střed CT Mean position Mean position Distance along x-axis [µm] -5 -4 -3 -2 -1 0 1 2 3 4 5 Distancealongy-axis[µm] -5 -4 -3 -2 -1 0 1 2 3 4 5 TP53 RARa cen17 Orientace CT v jádře buňky Distance in % of radius 0 20 40 60 80 100 Probabilitydensity[x10-2] 0 1 2 3 4 cen17 TP-53 RARA Výše popsaným způsobem dostaneme reálné polohy genetických lokusů vzhledem k CT a také do značné míry vzhledem k jádru. Transformace odstraní fluktuace polohy genetických elementů jež jsou způsobené fluktuacemi CT uvnitř jádra Závěry o nenáhodném uspořádání chromosomových teritorií: 1) Poměr mezi standardní odchylkou a střední hodnotou vzdálenosti mezi dvěma genetickými lokusy je v mnoha případech menší než 0.5, což je hodnota typická pro Rayleigho distribuci. 2) Úhly trojúhelníku jež vznikne ze tří genetických elementů stejného CT v jádře jsou v mnoha případech menší než 60o, tj. hodnota, kterou lze očekávat pro náhodnou strukturu. 3) Pro větší počet genetických oblastí, polohy elementů ve 3D prostoru mají menší rozptyl než klastry vzniklé pro náhodně generovanou strukturu. 4) Orientace jader se zviditelněnými CT a jejich genetickými elementy poskytuje důkaz o orientaci a polaritě CT. Struktura chromosomových teritoriíStruktura chromosomových teritorií