Regulace exprese Úvod (tok genetické informace, skladba lidského genomu, velikost - porovnání s jinými organismy, úrovně regulace) Porovnání regulace transkripce u pro- a eukaryot Regulace transkripce na úrovni genetického kódu Regulace na úrovni chromatinu a jádra Úroveň sestřihu, translace, degradace RNA a proteinu Genetický kód a tok genetické informace Počty genů u různých organismů Mycoplasma (600) člověk + vyšší organismy (30 000) Escherichia coli (4000) Skladba genů u pro- a eukaryot Genom eukaryot obsahuje mezi kodujícími sekvencemi řadu nekódujících oblastí - intronů Geny : prům. velikost 10-15 kb ale variabilní od stovek bp- Mb (tRNA – Dys); exony činí od 100% až po 0.6% (Dys) Introny jsou velmi variabilní: 0-118 na gen (u colagenu); délka 0.5 kb pro β-globin až po 30 kb pro dystrofin • Exprese u prokaryot je typicky regulována v rámci operonu – souboru kontrolních sekvencí v bezprostřední blízkosti proteinkódující sekvence • Eukaryotické geny jsou rovněž regulovány souborem kontrolních sekvencí, které se nacházejí poblíž protein-kódující sekvence, ale operony zde neexistují. • V eukaryotických buňkách je jádro – regulace je komplexnější (transkripce a translace jsou odděleny). • Introny se u bakterií téměř nevyskytují a regulace sestřihem se uplatňuje pouze u eukaryot • Existuje krátkodobá a dlouhodobá regulace transkripce. Rozdíly v regulaci u pro- a eukaryot Regulace transkripce u prokaryot Vypnutá transkripce Regulace transkripce u prokaryot Zapnutá transkripce Mitochondriální a jaderný genom Mitochondriální (MCH) genom člověka(Anderson 1981) 14.5 kb, 0.5% celého genomu, dědí se výhradně od matky, při dělení buňky MCH DNA segreguje náhodně, 37 genů – syntéza na MCH ribosomech (vlastní rRNA a tRNA); MCH genom je kompaktní - kódující Jaderný genom u člověka 24 různých molekul, 22 autosomů, 2 pohlavní chr., velikost 50-250 Mb, 30 000 genů 70% tvoří sekvence mající určitý vztah ke kódující DNA (včetně intronů a regulačních oblastí) 10% tvoří repetice (např. Alu sekvence) 10% tvoří transpozony Možnosti regulace exprese u eukaryot DNA RNA transkript mRNA mRNA inaktivní mRNA protein inactive protein regulace transkripce regulace sestřihu regulace transportu a lokalizace regulace translace regulace degradace mRNA regulace degradace a aktivity proteinu Jádro Cytoplasma Regulace transkripce u eukaryot Regulace na úrovni prvotního kódu DNA vazba trankripčních faktorů a aktivačních elementů k DNA Regulace na úrovni chromatinu - reverzibilní modifikace struktury - modifikace DNA, event. histonů dědičně přenášená z buňky na buňku Regulace na úrovni globální struktury chromosomová teritoria a genom jako celek mají určité uspořádání, které modifikuje transkripci Regulace transkripce u eukaryot Regulace krátkodobá exprese se mění rychle jako reakce na potřeby buňky nebo na vnější faktory Regulace dlouhodobá geny důležité z hlediska vývoje nebo diferenciace Základem regulace je vazba proteinů na DNA Vazba se uskutečńuje prostřednictvím interakce proteinu s DNA. Jsou známy různé strukturní motivy proteinů, které specificky vážou na DNA -Homeodoména -Motiv zinkového palce -Leucinový zip Promotor a transkripční kompex TFIID (TBP)TFIIB TFIIF - Promotor se nachází před počátkem transkripce - Některé promotory určují kde začne transkripce (např. TATA), jiné toto místo neurčují - Specifické TF se vážou na specifické promotory - Gen může mít jeden nebo více promotorů - Promotory mohou být pozitivně nebo negativně ovlivněny Regulace na úrovni prvotního kódu DNA - promotoru Transkripční kompex Regulace na úrovni prvotního kódu DNA D – TFIID je multi-komponentní faktor, který rozpozná a váže se k promotoru DNA. Obsahuje TBP (TATA binding protein), který se váže k TATA sekvenci. Vazba TFIID k DNA je prvním krokem při iniciaci transkripce TBP protein navázaný k DNA Transkripční kompex Regulace na úrovni prvotního kódu DNA B – TFIIB – váže se k TBP a k RNA polymeráze II stabilizuje vazbu TBP k TATA elementu, nutný pro asociaci RNA polymerázy II k iniciačnímu komplexu Struktura TFIIB proteinu navázaného k TBP-TATA komplexu Transkripční kompex Regulace na úrovni prvotního kódu DNA TFIIF má dvě podjednotky a váže se k RNA polymerase II – je potřebný pro stabilní vazbu polymerázy k promotorovému komplexu TFIIH má 6 nebo více podjednotek, váže se k DNA prostřednictvím TFIIE a umožňuje polymeráze opustit promotor (přejít do elongačního režimu) Enhancery a aktivátory transkripce Některé proteiny mohou mít dvě nebo více úrovní exprese, přičemž vyšší úroveň zajišťují aktivační proteiny, které mají dvě domény – vazebnou k DNA a aktivační. Vazebná sekvence se může nacházet daleko od regulovaného genu Enhancery Enhancery jsou krátké sekvence regulující transkripci na větší vzdálenost - mohou se nacházet před i za místem transkripce - aktivační proteiny mají doménu pomocí níž se vážou specificky na enhancer a doménu aktivační - DNA může vytvářet smyčky, které umožní interakci aktivačního proteinu s transkripčním komplexem - interakce regulačních proteinů určuje zda bude transkripce aktivována (může být také utlumena) Enhancery - příklad Příkladem jednoduché regulace u eukaryot je regulace steroidními hormony kdy jeden typ buněk organismu indukuje transkripci u jiných buněk - geny regulované steroidními hormony mají enhancery HRE – hormone response elements - HRE se nacházejí v mnoha kopiích - při absenci hormonu je jaderný receptor vázán na chaperon - přítomností hormonu se odstraní chaperon, změněný receptor se váže na enhancer Enhancery - příklad Role chromatinu při regulaci transkripce Histony blokují přístup k DNA – histony a proteiny, jež se specificky vážou k promotorům vzájemně soutěží o místo na promotorech Problém je řešen pomocí aktivačních proteinů a „remodeling factors“ - aktivační proteiny blokují histony a umožňují tak TF vazbu k promotorům - přítomnost „remodeling“ proteinů nebo acetylace histonů vede ke snížení vazby histonů na DNA „Remodeling factors“ 1) faktory ovlivňující konformaci nukleosomů a jejich polohu 2) faktory chemicky modifikující histony (na N-koncích) a DNA – mohou regulovat transkripci dědičně Role chromatinu při regulaci transkripce „Remodeling factors“ 1) faktory ovlivňující konformaci nukleosomů a jejich polohu Zde patří Swi/Snf komplex, který využívá energii ATP, aby rozrušil vazbu histonů na DNA. Příklad – transkripce genů HTA1 a HTB1 u kvasinek vyžaduje vazbu proteinů Swi/Snf, jež způsobují odtržení nukleosomů Role chromatinu při regulaci transkripce „Remodeling factors“ 2) faktory chemicky modifikující histony (na N-koncích) a DNA – mohou regulovat transkripci dědičně Zde patří HAT (histon acetylázy) a HDAC (histon deacetylázy). Acetylace histonů vede k zastínění jejich kladného náboje a tím k rozvolnění kondensované struktury chromatinu. Je známo několik skupin HAT i HADAC. Modifikace histonů Modifikace histonů Modifikace N-konce H3 význam nemodifikován umlčení genu? acetylován (14) aktivní gen acetylován (9) ztráta funkce metylován (9) umlčení genu (vznik heterochromatinu) fosforylován (9, 28) v mitóze nebo meioze fosforylován (9)+ acetylován (14) gen je aktivní metylován+ acetylován+ fosforylován ??? Modifikace N-konce H4 význam nemodifikován umlčení genu? acetylován (8, 16) gen je aktivní Variantní forma histonu H2A.Z umožňuje transkripci a znemožňuje formování heterochromatinu (Meneghini, 2003) Úloha acetylace histonů při regulaci transkripce Histon Acetyl Transferázy – vztah mezi acetylací histonů a transkripční aktivitou je znám už 30 let, mechanismy jsou objevovány v průběhu několika posledních let. Dělí se do několika skupin dle vysoce zakonzervovaných strukturních motivů. Acetylace není náhodná – HAT pracují v součinnosti s aktivátory a TF, což vede k tomu, že jsou acetylovány jen určité geny. Úloha acetylace histonů při regulaci transkripce Histone DeAcetylation Complexes – 3 skupiny, zmenšují stupeň acetylace, což má za následek změny ve struktuře chromatinu, a to vede k utlumení trankripce, které může být funkčně specifické. Např. HDAC4 a HDAC5 (nikoliv však HADAC1 nebo HDAC3) inhibují myogenesi (přes asociaci s MEF2) Úloha acetylace histonů při regulaci transkripce Acetylace u nádorů je změněná HAT – změněny u nádorů, např. p300 u kolorektálních a epiteliálních nádorů, CBP mutován u Rubinsteinova syndromu, kde je zvýšené riziko zhoubných nádorů, ztráta heterozygosity byla nalezena u glioblastomů, translokace byly nalezeny u hematoblastóz. HDAC mohou zprostředkovat funkci onkogenního produktu translokace u leukémií a lymfomů. Např. PML-RARa onkoprotein tlumí transkripci řady genů asociací s HDAC komplexem. Podobně u non-Hodginova lymfomu a AML M2. HDAC +TF se sekvenčně specificky vážou k určitým promotorům, což znemožňuje transkripci. Inhibice HDACu pak vede k acetylaci a expresi daného genu. Úloha acetylace histonů při regulaci transkripce Příklad mechanismu protinádorového působení TSA: Inhibitor HDAC, TSA, indukuje expresi inhibitoru cyklin dependentní kinázy (p21) a ta blokuje kinázovou aktivitu a způsobuje blok buněk v G1 fázi cyklu, což vede k diferenciaci buněk. Změna exprese po přidání TSA u nádorových buněk se týká pouze 2% genů – účinek je vysoce specifický. Úloha acetylace histonů při regulaci transkripce Geny indukované TSA nebo SAHA funkce CDKN1A, p21 inhibitor kinázy p21, blok v G1 CDKN2A, p16 regulátor proliferace TBP2 regulátor proliferace gelsolin tumor supresor TERT katalytická podjednotka telomerásy Komplexní regulace transkripce u eukaryot Regulace na úrovni chromatinu - enhancery Enhancery jsou relativně krátké úseky DNA obsahující vazebná místa pro aktivátory. Ty pak pomáhají vázat komplex RNA polymerasy II a proteiny modifikující chromatin cílového genu. Enhancery ovlivňují transkripci na velkou vzdálenost, před i za promotorem cílového genu, aktivátory jsou často omezeny na specifické buněčné typy, jsou aktivní pouze během určitých fází vývoje a přesně reagují na vlivy prostředí. Existují 2 typy enhancerů: 1) modulární, kde každý aktivátor působí sám za sebe – to umožňuje různorodost regulace exprese, evoluční flexibilitu apod. 2) synergické, kde je potřebná přítomnost všech složek pro aktivaci transkripce – tento soubor aktivátorů se nazývá „enhanceosome“ a umožňuje reakci typu ano-ne Komplexní regulace transkripce u eukaryot Příklad enhanceosomu: IFH-b enhanceosome umožňuje rychlé přepnutí transkripce typu ano-ne. A – aktivátory, HMG proteiny a HAT komplex se seskupí mezi nukleosomy B – stabilizovaný enhanceosome – acetylace HMG na 71 lysinu a histonů (modře) – váže CBP a Pol II, a dále Swi/Snf faktor modifikující nukleosomy C – Swi/Snf odsunou nukleosomy, naváže se TFIID faktor a gen může být intenzívně transkribován. Epigenetická regulace exprese Epigenetika zahrnuje jevy související s dědičnou modifikací struktury a transkripce chromatinu jež navazuje zejména na: - modifikace histonů - metylaci DNA Patří zde PEV, umlčování genů heterochromatinem, regulace vývoje a diferenciace Polycom and trithorax proteiny, imprinting a další jevy. Nepatří zde vliv vnějších faktorů na expresi buněk. „Position effect“ u kvasinek a Drosophily Po ozáření se u Drosophily objevila mutace při niž se červené facety očí změnily zčásti na bílé. Cytogenetická analýza ukázala, že došlo k inverzi chromosomu, kdy se gen označeny jako „white“ přesunul do blízkosti heterochromatinu. Jev bylo možno potlačit nebo naopak zesílit. Časem bylo nalezeno 50 genů modifikujících tento fenomén – Su(var) nebo E(var). Nejlépe charakterizovaným modifikátorem je HP1 protein. HP1 obsahuje evolučně stálou chromo doménu, která se vyskytuje také u vývojového regulátoru Polycom (PC) proteinu. Dalším je pak SUV39H1, který je příbuzný trithorax (TRX) proteinům a zajišťuje metylaci H3-K9. Úloha heterochromatinu při řízení exprese Heterochromatin - tmavě zbarvená část chromatinu, - kondensovaná po dobu buněčného cyklu - nachází se hlavně v centromerických a telomerických oblastech - je genově chudý, - obsahuje repetitivní sekvence - nachází se většinou na okraji jádra - DNA v heterochromatinu je špatně přístupná pro transkripční faktory, - histony jsou málo acetylovány a hodně metylovány na H3-K9 - obsahuje HP1 protein vázaný na metylovaný H3-K9 BrUTP – late S phaseDAPI Me9H3 Dvoustupňová regulace exprese (Francastel et al., 1999) Úloha heterochromatinu při řízení exprese Měřena vzdálenost genu od nejbližší oblasti heterochromatinu pro 3 typy buně T-MEL – exprese umlčená gen je blízko heterochrom atinu Struktura se může otevřít - dole a k expresi ještě nemusí dojít N-MEL – struktura je otevřená, gen je aktivní Buňky HL-60 Granulocyty Vzdálenost Rb genů k chromocentrům (Bártová et al.,2000) Úloha heterochromatinu při řízení exprese Metylace DNA - Existují enzymy metylující de novo (DNMT3a a DNMT3b) - Existují enzymy, které metylují druhý řetězec DNA podle prvního („maintenance methylaes“) – ty jsou odpovědné za dědičnost metylace - Existuje demetyláza, která odstraní metylaci z DNA. - Metylace DNA nastává nejčastěji v symetrických CG sekvencích (CpG islands), které se nacházejí u poloviny lidských genů transfer metylové skupiny S-adenosylmethioninu na 5-tou pozici cytosinu Zachování metylace při replikaci „udržovací metylázou“ CH3 CH3CH3 CH3 CH3 CH3 CH3 CH3 Replikace Metylace DNMT1 Metylace DNA je důležitá - Metylace DNA se nachází hojně u zhoubných nádorů (jak u onkogenů tak i u tumor supresorových genů) - Poškození metyláz (mutací) vede k těžkým onemocněním (bez methyltransferáz se embryo nevyvine) Úloha metylace při řízení transkripce - Transkripčně aktivní geny obsahují podstatně menší hladinu metylované DNA ve srovnání s inaktivními geny, - Inaktivní chromatin je obvykle metylován (např. inaktivní Xchromosom nebo inaktivované supresorové geny u nádorů) - Chromatin v místě metylace DNA je kondensovanější a brání přístupu TF - Promotory, které nemají CpG ostrůvky, mohou být citlivé na methylaci jednotlivých cytosinů – TF mohou být metylačně závislé (např. AP-2), existují však proteiny, které se vážou pouze na metylovanou DNA Mechanismus jak metylace DNA vede ke kondensovanému chromatinu DNA metylace usnadňuje vazbu HDAC komplexů (přes MBP – methyl binding proteins) a histon metylázy (HMT). Tyto enzymy odstrani Ac skupinu a přidají M skupinu na H3-K9, která je rozpoznána HP1 proteinem. Tento stav je dále šířen vazbou histon metyltransferáza na HP1. Umlčení exprese genu metylací de novo Úloha PcG a trxG proteinů při řízení vývoje Ontogeneze je kontrolována důmyslnou kaskádou genů, jež zahrnují transkripční faktory nejprve rozdělující embryo do větších domén a následně do jemnějších podjednotek. Identita jednotlivých částí těla je dána určitým TF. U Drosophily tyto TF tvoři tzv. HOM-C komplex, u obratlovců je to Hox komplex. Stabilní expresi těchto TF zajišťují PcG proteiny (udržují geny v reprimovaném stavu) a trxG proteiny (udržují aktivní stav). Mechanismus, kterým se tak děje zahrnuje modulaci struktury chromatinu. Existují významné paralely mezi regulací vývoje a umlčováním genů prostřednictvím modifikace chromatinu. Některé PcG proteiny mají HDAC aktivitu a naopak trxG proteiny mají HAT aktivitu. Molekulární gradienty v anteriorposteriorálním a dorso-ventrálním směru vedou k formování parasegmentů a poté segmentů u embrya i dospělého jedince V každém segmentu je exprimován jiný řídící protein Segmentace u embrya a dospělého jedince Úloha PcG a trxG proteinů při řízení vývoje Imprinting – geny označené DNA metylací V některých případe může exprese genů záviset na tom, zda je gen zděděn od otce nebo od matky (př. růstový faktor IGF2 je exprimován pouze podle alely otce; je-li mutovaná – zakrslý jedinec, je-li mutovaná alela matky, růst je normální). female male meiosa – zrušení metylace nastaven maternální imprint nastaven paternální imprint vajíčka spermie Insulator – hraniční element Vzhledem k působení aktivátorů na velkou vzdálenost, musí být jejich vliv oddělen (aby si nepřekážely). To zprostředkovávaní insulatory – elementy jež vážou proteiny, které 1) chrání geny před šířením heterochromatinu (jejich přenos společně s genem do blízkosti heterochromatinu vyloučí PEV) 2) blokují funkci enhancerů (pokud se nacházejí mezi enhancerem a cílovým genem) gen A gen B gen A insulator enhancer insulator heterochromatin gen A není ovlivněn blízkým heterochromatinem gen A není ovlivněn enhancerem, zatímco gen B je Regulace exprese lidského genomu Úvod (tok genetické informace, skladba lidského genomu, velikost - porovnání s jinými organismy, úrovně regulace) Porovnání regulace transkripce u pro- a eukaryot Regulace transkripce na úrovni genetického kódu Regulace na úrovni chromatinu a jádra Úroveň sestřihu, translace, degradace RNA a proteinu Transkripční mapa genomu (Caron et al., 2001) Average expression [tags/105 tags] 2 4 6 8 10 Centretodomaindistances[%] 40 50 60 70 80 90 4 18 3 148 10 9 1 11 22 17 20 16 19 Lymphocytes Positions of all chromosomes in nuclei of different cell types Distance in % of radius 0 20 40 60 80 100 Probability 0.000 0.005 0.010 0.015 0.020 0.025 0.030 0 20 40 60 80 100 0.000 0.005 0.010 0.015 0.020 0.025 0.030 0.035 0 20 40 60 80 100 0.000 0.005 0.010 0.015 0.020 0.025 TP53 cen17 RARA Distance in % of radius 0 20 40 60 80 100 Probability 0.000 0.005 0.010 0.015 0.020 0.025 0.030 Iso-q Distance in % of radius 0 20 40 60 80 100 Probability 0.000 0.005 0.010 0.015 0.020 0.025 0.030 0.035 0.040 0.045 Iso-p Distance in % of radius Distance in % of radius Umístění genetických elementů HSA 17 vzhledem ke středu jádra a jejich umístění na transkripční mapě TP53 ISO-p RARA ISO-q centromere p11.2 p13.1 q12-q22.1 q21.3-q32 Umístění genetických elementů HSA 17 a HSA 12 na transkripčních mapách chromosomů TP53 Cen17Iso p RARα Iso q 206, 97, 116 73, 103, 189, 197 108, 140, 190 C12, 185 77, 71, 156 Okumura et al., 2000Lukášová et al., 2002 Vliv genové exprese na strukturu chromosomových teritorií Volpi et al., JCS, 2000 Chromosomy jsou polární s aktivní (dekondensovanou) doménou uvnitř a neaktivní (kondensovanou) doménou na okraji jádra. Toto uspořádání se v zásadě vytvoří v telofázi/G1 fázi a zůstává v průběhu cyklu neměnné. Tím se nastaví expresní profil buňky. Je dáno metylací DNA??? Chromosome backboneChromatin loopes (shown short for clarity) Schéma interfázního chromosomu Regulace exprese lidského genomu Úvod (tok genetické informace, skladba lidského genomu, velikost - porovnání s jinými organismy, úrovně regulace) Porovnání regulace transkripce u pro- a eukaryot Regulace transkripce na úrovni genetického kódu Regulace na úrovni chromatinu a jádra Úroveň sestřihu, translace, degradace RNA a proteinu Regulace exprese na úrovni zpracování mRNA se uplatňuje v různých tkáních Existuje několik regulačních mechanismů: Alternativní polyadenylace – podle toho kde se přidá polyA konec (jeden gen může dát proteiny zcela odlišné funkce) Alternativní sestřih – podle toho, který exon je začleněn do konečné mRNA Úprava kódu mRNA – např. začlenění odlišného kodonu (např. alipoprotein B v játrech a ve střevě) Tyto mechanismy mohou fungovat i současně Alternativní polyadenylace a sestřih u genu calcitoninu v buňkách štítné žlázy a v nervových buňkách Transport mRNA Transport mRNA v buňkách eukaryot je regulován Zhruba polovina mRNA je degradována ještě v jádře buňky Hotová mRNA prochází jadernými póry do cytoplasmy, ale mechanismus a jeho kontrola nejsou známy. Regulace na úrovni translace mRNA může být uskladněná (s krátkým polyA koncem) a translace může být indukovaná. Uskladněná mRNA je chráněná proteiny, které inhibují translaci. Polyadenylové konce navozují translaci. Specifické mRNA jsou označeny pro deadenylaci a pak „uskladněny“ s krátkými poly(A) konci. Aktivace začíná enzymatickým přidáním polyadenylového konce (150 jednotek) Kontrola degradace mRNA Všechny RNA v cytoplasmě jsou časem degradovány. tRNA a rRNA jsou relativně stabilní, mRNA má variabilní stabilitu (minuty až měsíce) Stabilita se může změnit jako odpověď na regulující signál. Různé sekvence a procesy ovlivňují poločas rozpadu mRNA: • AU-bohaté elementy • Sekundární struktura • Odstranění poly(A) konce • Odstranění čepičky na 5’ -konci • Rozštípnutí mRNA a degradace fragmentu Kontrola degradace proteinu Proteiny mohou být krátce nebo dlouze žijící (proteiny oční čočky) Degradaci proteinu předchází ubiquitinace – ubiquitin se naváže na proteiny určené k degradaci. Aminokyselina N-konce proteinu určuje jeho stabilitu (určuje pravděpodobnosti navázání ubiquitinu): • Arg, Lys, Phe, Leu, Trp 1/2 life ≤3 minutes • Cys, Ala, Ser, Thr, Gly, Val, Pro, Met 1/2 life ≥ 20 hours