BAC/PAC knihovny a jejich využití pro FISH techniku
Metody používané v Laboratoři molekulární cytologie a cytometrie BFU,
Brno
Co to je?
BAC (Bacterial Artificial Chromosome) PAC (P1 Artificial Chromosome) YAC (Yeast Artificial Chromosome)
uměle syntetizovaná plazmidová DNA, kterou lze vložit do „organizmu"
• vektor x klonovací vektor
podílely se na mapování lidského genomu
klonovací kapacita až 500 Kb, mohou nést celé lidské geny
v kvasince se udržují relativně stabilně v 1 nebo více kopiích
ale při manipulaci problémy (nestabilita, přeskupování DNA, tvorba chimér s cizorodou DNA, malé výtěžky), nižší účinnost transformace
BAC systémy
struktura odvozena od F-plazmidů bakterie Eschericha coli
klonovací kapacita 50-350 Kb
v buňce v nízkém počtu kopií (1 -2)
vysoká strukturální stabilita v buňce E. coli, schopnost udržet vloženou DNA, snadná manipulace s DNA
snadná izolace díky kruhové plazmidové struktuře (alkalická lyže, sloupcová chromatografie)
tvorba chimér méně častá než u YAC
BAC systémy - 2
dobrá izolace díky selekčním znakům (př. gen pro rezistenci na antibiotika, přítomnost lacZ)
vektory dále obsahují: místa pro reštrikční enzymy, geny pro regulaci parA a parB, klonovací místa {Hind\\\, BamYW)
Aa1»		
Sall^	pFOS1 parB           g.5 kb CMr	
	\ parA /	
v ono/ repE		
I plasmid and gene
Bacterial ľ plasrrid is cu: within tocľ gene with ^^^estrictior enzymes
ind gene of interest ligate A
Gene of interest is nit (»il using restriction enzyme
BAC
Rur k plŕrtTrtpnratŕd in1n f mArpIk
I
Cells are plated    X-gal/ PTG medium
White colonies arc composed o" trans:ormed locZ cells
Nevhodný vektor odvozen od bakteriofága A (nebyl vhodný pro mapování savčího genomu)
proto vyvinuty P1 vektory a PAC systémy (odvozeny od temperovaného fága P1)
P1 vektor se skládá ze 2 domén: adenovirový fragment (plní fágové kapsidy DNA) a P1 lytický replikon (spouští amplifikaci plazmidové DNA)
PAC systém má místo adenovirového fragmentu plazmid pUC povahy (zvyšuje výtěžek DNA)
je to kombinace P1 vektoru a bakteriálního vektoru
klonovací kapacita 130 - 150 Kb
menší stupeň chimérizmu (jako u BAC), vyšší účinnost transformace, ale složitější příprava vektorů
Využití klonovacích vektoru
fyzikální mapování, analýza a sekvenace nejen savčího genomu
příprava DNA sond
detekce různých poruch genetické informace (delece, inzerce, ...)       ,,..,.
x ' klinické
detekce nádorových buněk     <«— využitl studium struktury chromatinu v buňkách tvorba genomických knihoven
Genomické knihovny
zásobárny klonů s různými vloženými úseky sekvenované genomické DNA
konstrukce knihoven: různý postup v závislosti na typu vektoru
hledání v knihovnách: pomocí sond
a) pro vyhledávání sekvencí DNA
b) pro vyhledávání produktů hledaných genů
Konstrukce BAC knihoven
linearizace vektoru restrikčními enzymy a ligace s naštěpenou genomickou DNA
produkt elektroporací vnesen do E. coli a transformanty selektovány na plotnách s antibiotikem nebo IPTG a X-gal
vybrané transformanty jsou řazeny do mikrotitračních destiček
vektory pomnožovány v kmenech E. coli s poruchou rekombinace (DH5a, DH10B)
Klonování do BAC vektoru
asi nejpoužívanější je vektor pBeloBAC11
postup: linearizace vektoru, ligace s fragmenty genomické DNA, elektroporace nebo chemická transformace do E. coli
selekce a uchování (LB médium s antibiotikem a 30% glycerolem na -70 ^ nebo vpich do média při RT)
izolace DNA z transformantů její analýza (PFGE, PCR)
Vektor pBeloBACll
(klastr globinových genů)
5'HS:   5 4 3 2 1
-IS -10,9 214   -14,7 -6,1
PAC 4396 (ISO Kb) I-//-
5 HS: 1
-21 ž
1 1 . 1 E GY AT VP ä P 1 >_'___m_■_m_■_■_■_—
BAC 4396-44 (100 Kb) ,_
Sna BI
-M
Xliol
Xbal
EcoRV
Eco RV
Hostitelská buňka
Escherichia coli (G-, Enterobacteriaceae) vhodný modelový organismus protože:
- je dobře znám jeho genom
- nenáročně se kultivuje, rychle roste, produkuje početné potomstvo
- obsahuje F-faktor (konjugativní plazmid o velikosti 100 Kb, který odpovídá za přenos genetické informace z F+ do F- buňky), v> v buňce je ve 2 formách (plazmid a Hfr)
F +
F
f-■■
f-~\ť-A
ŕ-V-%
F+ F+
ŕ-\ ŕ-%
<_/ v._J
Příprava DNA sondy
nejprve izolace DNA z příslušného BAC nebo PAC vektoru pomnoženého v E. coli
izolace klasickou metodou s vlastními roztoky nebo izolačním kitem
izolace kitem je výhodnější (větší výtěžek, odstranění bakteriální DNA)
Schéma izolace DNA pomocí QIAGEN
Large Construct Kit
lyzační pufry rozruší buňky isopropanol vysráží DNA etanol přesráží DNA kolonky odstraní bateriální DNA a RNA
následuje měření velikosti a čistoty DNA pomocí gelové elektroforézy a spektrofotometrie
QIAGEN Large-Construct Kit Proceduře
Pelleted bacteria
I
Alkaline lysáte
I
Clear lysáte
Isopropanol precipitate
Collect DNA by centrif ligation
l=J    Exonuc lease digestion
1
1
Isopropanol precipitate
Collect DNA by centrifug a ti on
Genomic DNA-free ultra pure plasm id DNA
Bind DNA
Wash
Elute
Nick-translace
vlastní příprava sondy inkorporací např. digoxigeninu do DNA
nick-translační kit obsahuje 2 enzymy:
- DNáza I
3'
i
200-500 bp
- E. coli polymeráza I
každý 20.-25. nukleotid je modifikován DIG-dUTP vznik fragmentů o velikosti 200-500 bp
Nick translation
Fig i
ONuse fi I eft 15 I he double rrtran-d'cd ON A E.Col I Pot I    has 5*~3" exonuclesse activity has S'-3' polymerizing activity
End Uj-LkH Iri-rr »1 Iryyuie-MiJ
Fig 2
I a(] j.ml Incorporates nuclecjtJdea along Lho en LI re length of I Ml- DMA
_--1■ ■ i '.mi hp
J 00-S,000 bp
This process is called nick translation because the DNA to be processed is treated with DNase to produce single-stranded "nicks." This is followed by replacement in nicked sites by DNA polymerase I, which elongates the 3' hydroxyl terminus, removing nucleotides by 5'-3' exonuclease activity, replacing them with dNTPs.
DNA po izolaci (pBeloBACH)
DNA po nick-translaci
pBeloBAC11 PAC825K22
bakteriální DNA plazmidová DNA
Cot-1 DNA
v lidském genomu jsou rozptýlené repetitivní sekvence SINEs, LINEs (např. Alu-elementy, L1-elementy)
tyto repetice jsou obsaženy i v DNA sondě
competitor DNA - lidská placentální DNA obohacená repetitivními sekvencemi
repetitivní elementy sondy hybridizují s přebytkem repetic na COT-1 DNA
nejvíce specifická místa na sondě zůstanou volná (jednořetězcová) pro hybridizaci na cílovou DNA
potlačuje hybridizaci sondy na repetitivní sekvence Dři FISH a zvýší se tak specifičnost (přesnost) lybridizace
Stručný návod k použití Cot-1
DNA
ke 120 ng značené DNA přidat 6 |jg Cot-1
doplnit salmon sperm DNA do mn. 20 ug
přidat 1/10 objemu 3M octanu sodného a 2 objemy 96% etanolu (-20^)
promíchat, inkubovat 30 min při -70 °C
centrifugovat 15min/13000 rpm, slit supernatant
promýt DNA 400 pi 70% etanolu (-20^)
centrifugovat 5min/13000 rpm, slit supernatant
sušit pelet a rozpustit ve 20 ljI hybrizolu (50% formamid a 2xSSC)
FISH
(Fluorescenční In Situ Hybridizace)
metoda stanovení lokalizace specifických sekvencí DNA nebo i celých chromozomů v buněčných preparátech
princip spočívá v navázání značené denaturované DNA sondy na komplementární místo cílové denaturované DNA
druhy DNA sond: místně specifické (genové), celochromozomové, telomerické, centromerické
typy DNA sond:
- oligonukleotidové (chemicky syntetizované)
- jednořetězcové (RT-PCR, PCR)
- dvouřetězcové (BAC, PAC, YAC klony)
- RNA sondy
přímé a nepřímé fluorescenční značení
duální barvení, SKY (spectral karyotyping), multicolour FISH, opakovaná hybridizace
rozsáhlé klinické využití (prenatální diagnostika, cytogenetika nádorů)
DOP-PCR
semi-degenerate oligonucleotides (CGACTCGAGNNNNNNATGTGG)
that bind at a low annealing temperature.
N: A,T,G, C
R: A,G,
Y: C,T
M: A, C
K: G, T
S: G, C
W: A,T V: G, A, C D: G, A, T H: A, T, C B:G,T,C
fragments that are in average 400-500 bp, with a maximum size of 3 kb, although Kittler and coworkers reported a DOP-PCR method that was able to produce fragments up to 10 kb.
Schema FISH
ť'luorosconce in-situ Hybridization (FISH)
cílová DNA
I  I M i I I I
I I I I I I 1 j I  I  I  T I III
I I I I I
T K A T
TTT
C C T
hallst
I   I   I   I   I   I   I I
□htoirascane
-EliliilL.—>
H'
T
DNA sonda
[■■;■ "■!!>■» latírllci'i with f lucreicmit jY«.rVi*r
*
I   I   I I
*
TT
JL... >
T fi. G ň T C CT I I I I I I I I ATtThtíň
111.....
nepřímé značení - sekundární protilátka
Nejčastěji používané látky
nepřímé značení DNA sondy:
ligandy typu digoxigenin, biotin
sekundární protilátky:
Rhodamin-anti-DIG, Fluorescein-avidin, FITC-avidin
barvení jádra:
DAPI (4',6-diamidin-2'-fenylindol), TO-PRO®-3 iodide, PI (propidium iodide)
přímé značení DNA sondy:
Spectrum Orange, Green, Red, ...
SKY technika
www.genome.gov
Duální barvení
	
	
«1 *	
umístění (3-globinového genu (červené signály) v rámci chromozomálního teritoria chromozomu 11 (zelené signály) u lidských leukemických buněk K562
Opakovaná DNA/DNA
hybridizace
klastr globinových genů      chromozom 11      centromera chromozomu 11
Axiovert 10