Dvoudimenzionální elektroforéza 2-DE Hana Konečná Středoevropský technologický institut CEITEC Centrální laboratoř - Proteomika ? proteinový vzorek komplexní směs peptidů komplexní proteinový vzorek jednoduchý směs peptidů jednoduchá databáze identifikace kvantifikace 2D GE proteinové čipy multiD-LC MS MS/MS charakterizace modifikace shotgun bottom-up Proteomický experiment extrakce fokusace SDS-PAGE digest MS identifikace neznámý protein HOMOGENIZACE • mechanicky • ultrazvukem • tlakem • zmražením / rozmražením • detergentovou lyzí PŘÍPRAVA VZORKU solubilizace močovina, thiomočovina, detergenty redukce DTT, TBP inhibice proteáz, fosfatáz, glykosyláz odstranění kontaminant  žádný celkový náboj  0.5 – 4%  použitelné ve vysokých koncentracích močoviny  neionogenní  zwitterointové  SDS jen v nízkých koncentracích (do 0.25%) DETERGENTY C7BzO 3-(4-Heptyl)phenyl-3-hydroxypropyl)dimethylammoniopropanesulfonate CHAPS 3-[(3-Cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-propanesulfonate hydrate CHAPS C7BzO E.coli CHAPS C7BzO E.coli ZÁKLADNÍ PRAVIDLA  zabránit proteolýze  jednoduchý postup  čerstvé reagencie  čerstvý vzorek  odstranit pevné částice - centrifugace  odstranit kontaminanty KONTAMINANTY  soli, zbytky pufrů  malé endogenní molekuly  iontové detergenty  nukleové kyseliny  polysacharidy  lipidy  fenolické látky 2-DE • první rozměr • druhý rozměr IEF SDS-PAGE 1. ROZMĚR IZOELEKTRICKÁ FOKUSACE migrace nabitých částic v gradientu pH v elektrickém poli IZOELEKTRICKÁ FOKUSACE • imobilizovaný pH gradient • amfolyty + + + - - - ROZSAH STRIPU ROZMĚR STRIPU ROZSAH STRIPU MW pI 3 - 10 NL pI 4 - 7 denaturace SDS  redukce DTT  alkylace IAA  EKVILIBRACE STRIPU 2. ROZMĚR SDS-PAGE migrace aniontů v elektrickém poli podle MW STRIP EQUILIBRATION GEL + - MW high low + FOCUSATION SDS-PAGE - 2-DE INSTRUMENTACE  Protean IEF  Protean Dodeca Cell  Densitometer GS-800  FLA-7000, STORM PDQuest, Quantity One Protean Plus Dodeca Cell Mini-Protean 3 Dodeca Cell Protean II xi Cell DETEKCE PROTEINU • gel x blot • visualizace barvení radioaktivita imunodetekce • barvení v gelu  po elektroforéze  před elektroforézou  specifické pro protein  specifické pro PTM  viditelné spektrum  fluorescence Coomassie Blue R-250, Coomassie Blue G-250 Stříbro: kompatibilní s MS nekompatibilní s MS Sypro Ruby, Flamingo Pink, Lucy, Deep Purple Pro-Q Diamond, Pro-Q Emerald BARVENÍ PROTEINU V GELU 0.6 ng (8 ng) 36 ng 1 - 4 ng Stříbro Coomassie Sypro Ruby BARVENÍ PROTEINU LINEARITA BARVENÍ PROTEINU – LINEARITA Sypro Ruby Ag Sypro Ruby • kvalitativní • kvantitativní ANALÝZA OBRAZU PDQuest 2D or not 2D ?  rozlišení  vizuální aspekty  multigelové jednotky  dynamický rozsah  extrémní proteiny (membránové,basické...)  reprodukovatelnost, image analýza  citlivost barvení  pracnost  nesnadná automatizace  postdigesční extrakce MULTIDIMENZIONÁLNÍ CHROMATOGRAFIE  velké objemy vzorku  možnost koncentrace na koloně  membránové proteiny, basické proteiny  není nutno barvit  peptidy – přímé napojení na MS  automatizace  vizuální aspekty ztraceny: pI a Mr  LC je sériová analýza  GE může běžet současně pro více vzorků PROTI PRO Difference Gel Electrophoresis DIGE DIGE BIOMARKERY … jehly v kupce sena prefrakcionace separace identifikace srovnání kontrola vs.vzorek • seno - proteiny bez vztahu k onemocnění (pozadí) • jehly - specifické proteiny pro onemocnění • potenciální jehly jsou obtížně validovatelné • nejsou pravidla, které jehly dále zkoumat • jehly často PTM, nejsou identifikovány MS • hledání biomarkerů obtížné a neefektivní Den 21 – před klinickým projevem Den 44 – po klinickém projevu Biomarkery v lidské plasmě separace identifikace depletovaná plasma Calcium-Depleted Human C-Reactive Protein Amyloid related serum protein BSA vesikly kmenových buněk DIGESCE • IN-GEL • IN-SOLUTIONtrypsin Glu-C Asp-N thermolysin MAVEPFPRRPITRPHASIEVDTSGTGGSAGSSE KVFCLIGQAEGGEPNTVYELRNYAQAKRLFR SGELLDAIELAWGSNPNYTAGRILAMRIEDAK PASAEIGGLKITSKIYGNVANNIQVGLEKNTLS DSLRLRVIFQDDRFNEVYDNIGNIFTIKYKGEE ANATFSVEHDEETQKASRLVLKVGDQEVKSY DLTGGAYDYTNAIITDINQLPDFEAKLSPFGD KNLESSKLDKIENANIKDKAVYVKAVFGDLE KQTAYNGIVSFEQLNAEGEVPSNVEVEAGEES ATVTATSPIKTIEPFELTKLKGGTNGEPPATWA DKLDKFAHEGGYYIVPLSSKQSVHAEVASFV KERSDAGEPMRAIVGGGFNESKEQLFGRQAS LSNPRVSLVANSGTFVMDDGRKNHVPAYMV AVALGGLASGLEIGESITFKPLRVSSLDQIYESI DLDELNENGIISIEFVRNRTNTFFRIVDDVTTFN DKSDPVKAEMAVGEANDFLVSELKVQLEDQF IGTRTINTSASIIKDFIQSYLGRKKRDNEIQDFP AEDVQVIVEGNEARISMTVYPIRSFKKISVSLV YKQQTLQA MS IDENTIFIKACE HMOTNOSTNÍ SPEKTROMETRIE • ionizátor, analyzátor, detektor • hmotnost/náboj • MALDI generuje ionty z pevné fáze • ESI generuje ionty z kapalné fáze databáze identifikace DIGEST BSA v gelu kompatibilní stříbro odbarvený gel gel bez odbarvení 1 20 0 17 00 2 20 0 m/ z 50 0 1 00 0 1 50 0 2 00 0 2 50 0 a. i. alpha-1-antiproteinase, antitrypsin Score 83 potvrzeno na MALDI-TOF/TOF MS Score 239 Neoznačené píky: keratiny nebo autolýza trypsinu KERATINY ! ! ! Potlačení ionizace G I G O GARBAGE IN - GARBAGE OUT G I G O • R.M. Twyman: Principles of Proteomics • R.Westermeier, T.Naven, H-R Höpker: Proteomics in Practice • A.J.Link: 2D Proteome Analysis Protocols • Current Protocols in Protein Science • R.J.Simpson: Proteins and Proteomics • T.Rabilloud: Proteome Research: Two-dimensional Gel • Electrophoresis and Identification Methods • A. Görg, W. Weiss, M.J.Dunn: Proteomics 2004, 4, 3665, rev. • I. Miller, J. Crawford, E. Gianazza: Proteomics 2006, 6, rev. • F.Chevalier: Proteome Science 2010, 8:23, review • R. Burgess, M. Deutscher: Guide to Protein Purification LITERATURA II. PREFRAKCIONACE 10 000km 100km 10km 10cm 1 000km 1km 100m 10m 1m 1cm vzorek solubilizace deplece/obohacení 2D GE prefrakcionace digesce in-gel směs peptidů odsolení MALDI-MS ESI-MS ESI-MS/MS separace RP-HPLC nebo CE PMF fragmentační spektrum PST identifikace proteinu odstranění abundantních proteinů afinitní chromatografií HSA IgG AFINITNÍ DEPLECE Apolipoprotein Immunoglobulin kappa light chain Immunoglobulin light chain albumin Lidská plazma - vázaná frakce po afinitní depleci ALBUMIN IgG Barvení: CB G-250 CPPL Combinatorial Peptide Ligand Library PROTEOMINERPREFRAKCIONACE PROTEOMINER PREFRAKCIONACE MicroRotofor OffGel Fractionator IEF • prefrakcionace v roztoku • prefrakcionace na IPG stripu OFFGEL IEF prefrakcionace proteinů nebo peptidů MICROROTOFOR PREFRAKCIONACE MIKRO ROZSAHY pI GELOVÁ CHROMATOGRAFIE INSPIRATIVNÍ LITERATURA PRO MÍRNĚ POKROČILÉ Two-dimensional gel electrophoresis in proteomics: A tutorial Thierry Rabilloud et al. Journal of Proteomics 2011 Two-dimensional gel electrophoresis in proteomics: past, present and future Thierry Rabilloud et al. Journal of Proteomics 2010 Proteomic biomarker discovery: It's more than just mass spectrometry Josip Blonder et al. Electrophoresis 2011 III. CENTRÁLNÍ LABORATOŘ - PROTEOMIKA CENTRÁLNÍ LABORATOŘ • přístup k pokročilým technologiím na bázi sdílené instrumentace a její kvalifikované obsluhy proteomické techniky genomické techniky • výuka - přednášky a praktické kurzy • členství v Association of Biomolecular Resource Facilities TECHNIKY V CENTRÁLNÍ LABORATOŘI • syntéza a purifikace oligonukleotidů • kapalinová chromatografie • gelová elektroforéza • analýza obrazu • digesce proteinů • hmotnostní spektrometrie • minisklad reagencií pro molekulární biologii http://www.sci.muni.cz/FGP Tato prezentace vznikla s podporou projektu OP VK „Rozvoj týmu pro výuku, výzkum a aplikace v oblasti funkční genomiky a proteomiky“ (CZ.1.07/2.3.00/09.0132) For all the complex problems and difficult questions there is always one simple, easily comprehensible w r o n g answer.