Funkce proteinů Lubomír Janda 1 Co potřebujeme k tomu, abychom mohli studovat funkci proteinů? •Dostatek informací •Vhodné metody •Počítat se všemi možnostmi •Nespokojit se s již publikovanými informacemi •Počítat s existence více-funkčních proteinů etody studia funkce proteinů Dostatek znalostí o proteinu Funkční protein Zviditelnění proteinu ..... Kvalita proteinu Hledání interakčního partnera Kvantifikace interakce Detailní popis interakce Bioinformatika (analýza proteinu, práce s literaturou) Exprese a purifikace proteinů SDS-PAGE/Western bloť fluorescenční a elektronová mikroskopie/detekce aktivity enzymu na gelu/MALDI/2D-PAGE CD spektroskopie/měření turbidity/DLS Dvojhybridní kvasinkový systém/vrstevní značení/ imunoprecipitace/TAP tag technologie/ substrátová specificita/ Měření kinetických parametrů pomocí spřažených enzymových reakcí/radioaktivně značených látek/ kosedimentace/nepřímá ELISA Krystalizace/NMR analýza/cílená mutageneze/ řízená evoluce/modifikace proteinů (fosforylace, nitrosylace, glykosylace)/molekulární modelování proteinů. 3 •Glykos Postranslační modifikace proteinu. (S5T5Y,H5D5k5r) (pentosy, deoxyhexosy, hexosaminy, hexosy, N-acetylhexosaminy, kyselina sialová) astnými kyselinami (myristoylace, stearoylace,farnesylace, palmitoylace, geranylgeranylace, kyselina lipoová). Nitrosylace (C) ) (C) - disulfidové můstky Methylace, formylace, acetylace •Deamidace (Q,N)/carboxylace (E/D) -p •Biotinylace Pyroglutamová kyselina (QQ) -p Chemická stabilita fosforylovaných aminokyselin Fosfoaminokyseliny Stabilita - prostředí Kyselé Zásadité Fosfoserine + - Fosfothreonine + + Fosfotyrosine + + Fosfoarginine - - Fosfohistidine - + Fosfolysin - + Fosfát kyseliny asparagové - - Klumpp, S.; Krieglstein, J. Eur. J. Biochem. 2002, 269, 1067. Table i: Selected examples of catalytic promiscuity in a single enzyme. En zy m e Enzyme class Normal activity Promi5cuou5 activity proline am in opeptid ase metallohydrola5e (two Mn2+ centers) C— N hydrolysis in proline amides P— F hydrolysis in diisopropyl fluorophosphate imi nopeptidase [pyruvate kinase metallohydrolase [two Zni + centers) m etalloenzyme [Vln", K+, Mg*+ centers} metalloenzyme (Mn** center) non-heme di iron non-hem e di iron C—N hydrolysis in amides P— O hydrolysis in bis-p-n itrophenylphosphate phosphoryl transfer Trom phosphoe-nol pyruvate dehydration of 2-hydroxy-G-succinyl-2,4-cyclohexadiene carboxylate hyd roxylation of methane desatu ration of the C9-C10 link in stearic acid to give oleic acid sulTuryl transTer trom 5ultoenolpyruvate; also phosphoryl transfer to fl uoride, hydroxylamin e, or a-hyd roxycarboxylic acids racemization of N-acylami no acids epoxidation, JV-oxideformation, d ehalogen ati on, desaturation of benzylic substrates sulfoxidation of9-thiaor 10-thia analogues of stearate and the hyd roxyl ati on of 9-fluoro analogs es one of the two normal activities fi-lactam hydrolysis aldol addition or Michael addition sulfinamide hydrolysis oli gomerizati on of [S i (CHi J^JOEtJi), dimeriza-tion of Si fCHiJjOCHi sulfite hydrolysis C=tSl hydrolysis in [Vcyanoalanine to give aspartate hydrolysis of epoxides with retention of configuration addition of cyanide to imines Kemp elimination threonine retroaldol reaction, decarboxylation of am in omalonate, racemization of al an ine, tran s- amination of alanine and pyruvate acyloin condensation of acetaldehyde and ben- zaldehyde Id-succí nyl benzoate synthase methane monooxyge-nase plant steroyi acyl carrier protein desatu rase cephalosporin C synthase metalloenzyme (non- oxidative ring expansion of the five- heme Fe center, 2-oxo- membered ring to a six-membered, glutarate-d epend ant) hyd roxylation of a methyl group lipase, esterase serin e hydrolase ester hydrolysis lipase, chymotrypsin serin e hydrolase triglyceride or peptide hydrolysis 5 u bti 1 i 5 i n serin e hydrolase peptide hydrolysis lipase, trypsin serin e esterase triglyceride or peptide hydrolysis pepsin aspartate hydrolase amide hydrolysis asparaginase Thr-Lys-Asp triad C—N hydrolysis in asparagine to give aspartate epoxide hydrolase A5p-H is-Asp triad hydrolysis of epoxides with inversion of confi gu rati on oxynitri lase Ser-Hi s-As p triad addition of cyanide to aldehydes aldolase catalytic anti- Lys al dol reaction body serine hyd roxym ethyl- pyridoxal -dependent transfer of Cp of serine to tetrahydrop transferase teroylglutam ate pyruvate decarboxylase thiam in e-d epend ent decarboxylation of pyruvate Funkce proteinů 1. Enzymatická/ / 2. Receptorová/ 3. Přepravní/ / 4. Strukturní/ pevňovací/ / 5. Aktivní pohyb/kontrakční/motor-proteiny 6. Hormonální/hormony/regulace 7. Obranná/specializovaná/imunitní systém/transkripční regulace 8. Zásobní Enzymy Protein-interakce s ligandem Protein-interakce s dalším proteinem nebo DNA IV. Zásobní. 7 i. ii. i Systematická klasifikace enzymů dle enzymové komise (EC): • EC x. y. z. p. čtyřciferný kód (Enzyme commission) • Příklad: Alkoholdehydrogenasa, EC 1.1.1.1 • Systematický název: Alkohol:NAD+ oxidoreduktasa • 1. oxidoreduktasy (oxidačně-redukční reakce) • 1.1 Působí na CH-OH skupinu donoru • 1.1.1 Akceptor NAD+ nebo NADP+ • 1.1.1.1 (pořadí enzymu v podpodtřídě) )xidoreduktázy Transferázy EC3.X.X.X Hydrolázy EC4.x.x.x Lyázy EC5.X.X.X Isomerázy EC6.x.x.x Ligázy atalyzovaná reakce fypická oxidační/redukční; ah + b a + bh (redukce) přenáší atom H nebo O a + O ao (oxidace) z jedné sloučeniny na druhou Přenáší funkční skupinu z jedné sloučeniny na druhou. Skupina může být methyl-, acyl-, amino-nebo fosfátová skupina Vytváří hydrolýzou ze substrátu dva produkty. AB + C A + BC ab + h20 —> aoh + bh Nehydrolytické přidání a nebo odstranění skupiny ze substrátu. C-C, C-N, C-0 or C-S mohou být štěpeny Přeskupení uvnitř molekuly - isomerizace. AB^BA říklady enzymů s triviálními názvy Dehydrogenázy/ oxidázy Transamináza/ kináza Lipáza, amyláza, peptidáza rcocooh rcoh + c02 Dekarboxyláza Isomeráza/ mutáza Spojení dvou molekul spolu X + Y+ ATP pomocí syntézy vazeb C-O, C-S, C-N or C-C s paralelním uvolněním ATP XY + ADP + Pi Syntetáza Funkce proteinů i oteiny 1. Enzymatická/ / 2. Receptorová/ 3. Přepravní/ / 4. Strukturní/ pevňovací/ 5. Aktivní pohyb/kontrakční/motor-| 6. Hormonální/hormony/regulace 7. Obranná/specializovaná/imunitní systém/transkripční regulace 8. Zásobní Enzymy Protein-interakce s ligandem Protein-interakce s dalším proteinem nebo DNA Zásobní. 10 Signalizace u více-komponentního systému Současný model cytokininové signalizace přes více-komponentní systém rostliny Arabidopsis thaliana Interakce s efektorovými proteiny Regulace transkripce Funkce proteinů Enzymatická/ Receptorová/ Přepravní/ / / I oteiny Strukturní/ pevňovací/ Aktivní pohyb/kontrakční/motor-| Hormonální/hormony/regulace Obranná/specializovaná/imunitní systém/transkripční regulace Zásobní Enzymy Protein-interakce s ligandem Protein-interakce s dalším proteinem nebo DNA Zásobní. 12 Běžný hemoglobin dospělého člověka (HbA) se skládá ze 4 podjednotek, dvou alfa (a) a dvou beta (6). Každá podjednotka je tvořena bílkovinnou částí - qlobinem a prostetickou (nebílkovinnou) částí - hemem 13 1. Enzymatická/ 2. Receptorová/ 3. Přepravní/ / / 4. Strukturní/ / _ / 6. Hormonální/hormony/regulace 7. Obranná/specializovaná/imunitní systém/transkripční regulace 8. Zásobní Enzymy Protein-interakce s ligandem Protein-interakce s dalším proteinem nebo DNA Zásobní. 14 5. Aktivní pohyb/k ií/ -proteiny 15 Vimentin Funkce proteinů I. Enzymatická/ / 1. Receptorová/ 3. Přepravní/ / X. Strukturní/zpevňovacíA >nty/ 3. Aktivní pohvb/kontrakční/motor-proteiny 3. Hormonální/hormony/regulace 7. Obranná/specializovaná/imunitní systém/transkripční regulace 3. Zásobní Enzymy Protein-interakce s ligandem Protein-interakce s dalším proteinem nebo DNA IV. Zásobní. 18 Kinesin se pohybuje striktně podél mikrotubulů směrem k periferii buňky (anterográdní směr). Dyneh\má tendenci se otáčet kolem mikrotubulů po povrchu směrem od periferie buňky (retrográdní směr). Mni Hatwo ftouwwt | H RDs J J Linker Module 6 25 5 PlecMouse 'AAAQSSKGYYSPYSVSGSGSTAGSRTGSRTGSRAGSRRGSFDATGSGFSMTFSSSSYSSSGYGRRYASGPSASLGGPESAVA1 PlecHamst AAAQSSKGYYSPYSVSGSGSTTGSRTGSRTGSRAGSRRGSFDATGSGFSMTFSSSSYSSSGYGRRYASGPPASLGGPESAVA PlecHuman AAAQ5TKGYY5PYSVSGSG5TTG5RTGSRTGSRAGSRRG5FDATGSGF5MTFSSSSYSSSGYGRRYASSPPASLGGPESAVA Kd of Plectin (Ex 1 -24) for actin 320 nM Kd of Plectin (R5) for vimentin (IF) 100nM Kd of Plectin (Ex 2-8) for integrin beta 4 170 nM (Ex 2-8) 25uM Kd for microtubules in case of MAP2 1-3uM plektinových konstruktů s s (microtubule associated proteins) Tubulin +GnHCI Tubulin s MAP +GnHCI GR 323 GR 329 GR 330 GR 331 GSTGR 326 GST GR 331 Coomassie blue barvení m m r«> Oi O — cn cC r\i (N m ro o m m ro ro ■ i_ . cC cC oc CL KSi ■ « k ■ - D K A L dri L. H H B ■ ¥ D 1 H Tre] IlU H 4 H ■ L ■ ■ - - L h L - - a h Y ■ - It ■ Y ¥ ■ L l h k ■ ■ 1 1 L ■ t t MU » T K ■ * H T A ■ ■ L H 1 ■ - a A L a ft nm ■ m MU 1» ItlIF T P - - L y ■ - - A A V. E H h L - - E V V K f L L E H ft ■ A H ft H V A MU 141 TEDIF T P - - L A V - - A Lift HH - - H V V A H L 1 H y ft ■ T K ft K MM 1» v R L p A - ■ l h 1 - - A A ■ H d T R t A A v l l ft H d ■ P H p d v l MU » t K T ft F T P - - L H 1 - - A A H V H L ■ - H V A 4 L L L H R ft ■ A • V H F T MU » p ft H ft 1 t P - - L h 1 - - A ■ r R H Y ■ - 1 ■ Y ■ l L l d R ft ■ A ft 1 E t K MU T K D E L T P - - L h[£ - h Y - - R 1 • E 1 L L d h ft ■ A P 1 4 A K AMI 101 t k H ft L t P - - 1 h ■ - - A A m h L ■ - d [by ■ l L l ft y d ■ A E 1 d D 1 M*r11 » t L d h L t P - - L h y ■ - A A h Ě hru - - R v A k v L l r k ft ■ A k p H 1 R Mfrlt ■t A L H ft f T P - - L h 1 - - A E It K h Y - - R V H E L L l K T ft ■ A ■ 1 Ü A y m4H* 4« t b i ft L t P - - L h v - - A * f ■ h L - - ř 1 v R H L L 4 R ft ■ A b t H v * MM4 H V H V E T p - - L H ■ - - A AHA h T ■ - E V A ■ y L L Q H K ■ A K y H- A K MÉrlB A K D E* 4 T P - - L hle - - A ABl h T - - H ■ y K L L L EHR ■ A H p H L A » T T A ft h T P - - L h 1 - - A A r E h Y ■ - E T V L A L L EKE ■ A b a A [b h Mtlľ t k ■ ft f t p - - L h v - ■ A 4|y ■ Y ■ - H v A e l L L BRD ■ a h p H a A hMl ■K Q K H a L T p . . L H v - - a Y H H ■ H L D 1 Y ■ l L L P R ft ■ ft ■ p H A p MfrW w* AHN IV t p - - L h i - - a a it q ■ q v ■ - ■ v A ■ ■ L l q t H ■ ■ ■ ana! Mtfl na ■ v q ■ v T p . . L h L ■ - IUI h A ■ ■val L L ■ ■ q ■ a ■ O H L ■ JWbAl n- H k m ■ L t p - - L h L - ■ «MI h Y p v A d v L 1 k h ■ ■ v ■ ¥ D a t MA T H ■ ■ T T p . . L h V ■ ■ a ■ m v H í MU| TSl T K L ■ T * p - - L h 4 - - a a o. q h T D 1 v T l L L K H ■ ■ a ■ p N ■ Y MUK ■ ■ D ■ T T p . . L a 1 ■ ■ aBBIl T 1 ■ - ■ ¥ ¥ D Y LftJ ¥ ¥ T M T ■ f Y &M.RBK - - 1 - m -* - - 1 k h - - ■ h - * 1 P " - - P h h P h 1 1 P - 1 ■ - p h l - - C-koncová doména Plektinu 58 Cytoskeleton Plectin Intermediate filaments Microtubules Actfn filaments Myosin filaments 59 Signalizace u více-komponentního systému Současný model cytokininové signalizace přes více-komponentní systém PM AHK sensorová histidin kináza • AHK2 • AHK3 • CRE1/AHK4/WOL HPt Proteins •AHP1-6 NUCLEUS Response Regulators ^P^^N^ ARR1 -24s Interakce s efektorovými proteiny Regulace transkripce Proteiny AH P z Arabidopsis thaliana AHPZM AHPR AHP2 AHP3 AHP5 AHP 4 1AHP AHP 6 AHPZM AHPR AHP2 AHP3 AHP5 AHP 4 1AHP AHP 6 HELIX 1 -7TT HELIX 2 L2 "TO HELIX 3 -5TT maaa---al |aaa---al mIal-iaqlq mdtl-iaqlq qlnallssmfasglv1eqfqqlqmlqedggtpgfva|vvtlfcddad qltallssmf|qglvHqfqqlqmlqdeggtpgfvsIvvtlfcd|a| qf|dytislyqqgflddqftelBlqddg-sp|fvsevlslffedcv cdftisly|qgflddqftelkklqdec-spIfvaIvvtlffedce mntivvaqlq|qfq§yivslyqqgflInqfsIlHlqdeg-tp|fvaIvvIlffddcs mtni--------------g|cmqgylfcqfm|leelqdda-npnfveevsalyf|dsa m|lv—-q|q|slqdyt|slfl|gil§sqflqlqqlqdes-np|fvsqvvtlffqdsd mlglgvJJ(lqa|in|llaslf|qgvl LINNIDQALE|-GSF iln|l s l s l1q-qvv|f QF LQLQQLQDEjT-SPNFVYDVINIYFDE SE LL|NL|LLLMD|EFSDY H4 | y u iiselaall1q-piv|fMv| iin1iatlleq-pvvnfHv| li s n ma|a lItt g tv|fs qv g li|nMa|al|q[GNV~ lintmsisle|p1nv m 1 HELIX 4 ■ L4 G 6D qf HELIX 5 iDTJ ayvíql gssasvgaq|v ft|mqf ayvIql gssasvgaqIv ftcmqf asvIql gssssvgaMv tlIvsf ssvIql gssssvgaHv glIvtl sgvIql gssssvgaHv nvIisf SYmIqF GSSTSIGASlv aecttf |v|ql gssssigaqIv naIvvf lnqlvgssssiganvcvaf lkGSS S6GA 4V4 C f4 2L LQd P FV V 65f d 466 6 vl5 1 QLCQDÍN DK. m T7TJ GCIMALAVVl HELIX 6 ] 160 qfcqdHsBdgclmalavv| ecceaínyegcv|clqqv| in- —rro— n|fqtmlql|qq-iqa----qq- n|fqtmlql|qq-iqay|p|qq-t|lqdmfnle|q-iiqaggivpqv1] eccdsqny|gcv|clqqvíi|yítl|aIlqIlfnlIqq-ivqagg|ipqvIi--eccdvqn|egcl|clqqvdyey|ml|t|lq|lfnlJq-ilqaggtipqv|in- eyc|agna[gcl|tfqql Je[stlJJle|yfqasq----------------- sfHqqnv|acMclqqvIqeyylvIn§letlf|leqq-ivasggmipav|lgf saselsn|pgcl§gl|w|||y|yl|nmm^lfql|qq|ilaagv|ypm----- c ngCrlôe 64 f leqq i AHP1 17.6 kDa AHP2 17.4 kDa AHP3 17.5 kDa AHP4 14.7 kDa AHP5 17.9 kDa AHP6 17.8 kDa Podobnost AHP proteinů se pohybuje mezi 60-80% 61 Výsledky exprese AHP proteinů v E. coli Procenta proteinu AHP v rozpustné formě t (V) růst/indukce AHP1 AHP2 AHP3 AHP4 AHP5 AHP6 37°C/28°C 8% 85% 100% 0 76% 0 37°C/22°C 82% 73% 100% 0 81 % 51 % 22°C/22°C 71 % 78% 100% 30% 81 % 73% 62 Radka Dopitová Purifikace 1. Afin it n í chromatografie- His trap kolona Výsledky purifikace AHP5 proteinu 50 mM Tris pH759 300mMNaCI, 10%glycerol, 3,5 m M mercapthoethanol 500 mM midazol 20 CV 20 mM imidazol Čistota: 78 % 65 Radka Dopitová etody studia funkce proteinů Dostatek znalostí o proteinu Funkční protein Zviditelnění proteinu ..... Kvalita proteinu Hledání interakčního partnera Kvantifikace interakce Detailní popis interakce Bioinformatika (analýza proteinu, práce s literaturou) Exprese a purifikace proteinů SDS-PAGE/Western bloť fluorescenční a elektronová mikroskopie/detekce aktivity enzymu na gelu/MALDI/2D-PAGE CD spektroskopie/měření turbidity/DLS Substrátová specificita/Dvojhybridní kvasinkový systém/vrstevní značení/imunoprecipitace/TAP tag technologie Měření kinetických parametrů pomocí spřažených enzymových reakcí/radioaktivně značených látek/ kosedimentace/nepřímá ELISA Krystalizace/NMR analýza/cílená mutageneze/ řízená evoluce/modifikace proteinů (fosforylace, nitrosylace, glykosylace)/molekulární modelování proteinů. 66