titl CZ OPVK_MU_vlevo_2 Analýza obrazu Jana Buršíková Oddělení funkční genomiky a proteomiky ÚEB PřF MU www.sci.muni.cz/pVpKnb/ „Rozvoj týmu pro výuku, výzkum a aplikace v oblasti funkční genomiky a proteomiky“ (CZ.1.07/2.3.00/09.0132) zahlavi CZ Analýza obrazu Ø •Srovnání a vyhodnocení 2D gelů (vizuálně nemožné) • •Převedení zobrazení do formy digitálních dat (pomocí skeneru nebo kamery) • •Analýza pomocí speciálního SW * zahlavi CZ Cíle experimentu * •Definice jasně stanovených otázek – cílů (potvrzení hypotézy, soustředění se na úzce vymezený problém) •Stanovení počtu a typu replik (umožňují statistické zpracování experimentálních údajů) •Typ barvení •Kontrolní vzorky, standard zahlavi CZ Experiment •Cíle experimentu •Příprava vzorku •2 DE •Barvení •Snímaní obrazu •Analýza obrazu - vyhodnocení •Vyřezání vybraných spotů •Digesce •Identifikace •(Zdroje chyb, variability) zahlavi CZ Biologické a technické repliky * •Biologické – vzorky z různých organismů téhož druhu, stejný „treatment“ • (x rostlinek Arabidopsis, x různých pacientů se stejným typem nádoru apod.), stanovení biologické diverzity - rozmanitosti • •Technické – stejný vzorek, stejný „treatment“ (reprodukovatelnost) • •Rozhodnutí o použití je nutné udělat před přípravou vzorku zahlavi CZ Dvourozměrná elektroforéza * * •1.rozměr – izoelektrická fokusace (pI) • •2.rozměr – elektroforéza v polyakryamidovém gelu v přítomnosti dodecylsulfátu sodného (Mr) zahlavi CZ Barvení proteinů • •Viditelné barvení – Coomassie briliant blue, stříbro •Fluorescenční barvení – Sypro Ruby, Flamingo Pink, Deep Purple, Oriole, Lumitein •Radioaktivní značení zahlavi CZ Barvení proteinů • •Obecné požadavky na vizualizaci proteinů • •vysoká citlivost •široký lineární rozsah závislosti intenzity • barvičky na množství proteinu v gelu •kompatibilita s následnými analýzami zahlavi CZ Barvení – rozsah lineární závislosti intenzity barvičky na koncentraci proteinu •Barvení stříbrem – lineární závislost pouze •v rozmezí do 100 ng proteinu. •Při vyšších množstvích odklon od linearity. •Lineární dynamický rozsah •= graf závislosti intenzity barvičky (osa y) •na koncentraci proteinu (osa x) * zahlavi CZ Snímání obrazu • • •Vizuální vyhodnocení gelu není možné (pouze orientační u viditelných barviček) • •Po obarvení gelu je nutné převést zobrazení na gelu do podoby digitálních dat zahlavi CZ Snímání obrazu •Viditelné barvičky • - denzitometry (GS-800) •Fluorescenční barvičky • - skenery (FLA 7000) •Kamery • •(Ex/Em spektrum se musí shodovat s Ex/Em charakteristikami přístroje) * zahlavi CZ Snímaní obrazu •Signály z biologických vzorků jsou konvertovány do digitálních dat v odstínech šedé barvy • •Načtení ve formátu TIFF, nejčastěji 16 bitový, rozlišení 65 536 • •Transformace skenovaných „images“ do „spot volumes“ - tento úvodní proces analýzy obrazu je důležitým krokem (často kritickým) – zvolená možnost může mít velký vliv na kvantifikaci dat * zahlavi CZ Analýza obrazu •Konečný cíl řady experimentů = identifikace množství proteinových spotů a interpretace důležitosti těchto spotů – v biologickém, fyzikálním nebo chemickém kontextu •Výběr spotů, které se významně liší podle daného „designu“ experimentu •Výběr pouze několika velmi významných spotů, které budou případně použity jako budoucí marker •Pro odpovídající odpovědi na zvolené otázky jsou často nutné rozdílné přístupy •Cíl – zabránit ztrátě významných spotů = najít všechny spoty, které vykazují významné rozdíly (s vědomím, že mohou být zvoleny také irelevantní spoty – falešná pozitivita) • zahlavi CZ Analýza obrazu – cíle, očekávání •Vychází z cíle experimentu •srovnání gelů „treated“ a non-treated“ vzorků, •detekce „up and down regulated proteins“ •interpolace izoelektrických bodů a MW, •detekce nových, chybějících nebo modifikovaných proteinů, •kvantifikace spotů, •určení pozice spotu pro následné vyřezání, •detekce a charakterizace skupin proteinů, drah a řetězců, •statistická analýza experimentálních dat. • zahlavi CZ 2 koncepty 2DE •jeden gel – jeden vzorek •mnohonásobná separace – DIGE gely •Princip: • proteiny v různých vzorcích značeny různými spektrálně odlišnými fluorescenčními barvičkami; směsný vzorek analyzován na jednom gelu; jiný způsob vyhodnocování, plně automatické, odpadá variabilita mezi gely * zahlavi CZ DIGE gel zahlavi CZ SW •Vývoj - kontinuální proces •Spolehlivost •Reprodukovatelnost •Automatizace •Srovnání gelů různých velikostí, tvarů, poškozených gelů •Nesmí modifikovat „raw“ data zahlavi CZ SW •Přesná a správná práce v laboratoři je základem experimentu. • •Sebelepší SW nedovede ze špatných podkladů vytvořit dobré výsledky. • •Špatné vyhodnocení může zmařit předchozí dobrou práci. • • zahlavi CZ SW – přehled dostupných programů •Delta 2D •ImageMaster •Melanie •Progenesis •PDQuest •Redfin Ludesi • Různá filozofie, různý stupeň možností zasahovat do vyhodnocení, různá cena, možnosti statistických vyhodnocení. * zahlavi CZ Melanie - SW zahlavi CZ Ludesi zahlavi CZ Nejkritičtější části analýzy obrazu * •Správná detekce spotů •Odečet pozadí •Nesmí být modifikována základní data • •Výsledky analýzy jsou ovlivněny kvalitou a filosofií daného programu, manuální editování je vždy ovlivněno uživatelem. zahlavi CZ Vyhodnocování pomocí PDQuestu •Skenování gelu •Úprava obrázku - rotace, redukce, transform, cropping •Experiment Wizard •Načtení upravených obrázků •Vytvoření skupin •Zadání parametrů (faint spot, small spot, largest cluster) •Detekce spotů a analýza pozadí •Vytvoření „master“ gelu a přiřazení spotů •Editace •Normalizace •Analytické sety •Výběr spotů pro další analýzu zahlavi CZ PDQuest – načtení gelu ve formátu TIFF nacteni tiff zahlavi CZ Redukce obrázků zahlavi CZ Úprava * •Vertical/horizontal • flip • •Transform • •Rotation • •Image cropping * * zahlavi CZ Úprava obrázku - cropping zahlavi CZ Úprava obrázku - cropping zahlavi CZ Detekce spotů a filtrace pozadí •Spot detection wizard – průvodce nastavením parametrů (step by step) •Nastavení parametrů pro vyhledání spotů a odfiltrování pozadí •Různé gely – různé parametry nastavení zahlavi CZ Detekce spotů a filtrace pozadí •Faint spot – sensitivity and minimun peak value parameters •Small spot – size scale parameter •Large spot cluster - radius of the background substration rolling ball and the streak removal rolling disk •Background substraction is required for spot detection, method used – floating ball, the default radius size is calculated automatically based on the largest spot cluster you want to detect zahlavi CZ Detekce spotů a filtrace pozadí zahlavi CZ Detekce spotů a filtrace pozadí •Scanset •3 zobrazení každého gelu • • •Raw 2D image Gaussian * •původní (Raw 2-D scan) •filtrovaný •Gaussovský • • • Filtered * zahlavi CZ Match Set •Soubor gelů porovnávaných navzájem v rámci experimentu •Master gel = uměle vytvořený gel •Prostřednictvím Master gelu jsou gely srovnávány mezi sebou * • zahlavi CZ Editování zahlavi CZ Experiment summary •Experiment summary – počet spotů, matched spots, CV • •Match rate 1 – the percentage of matched spots relatively to the total number of spots on the member (gel) • •Match rate 2 – the percentage of matched spots on the gel relative to the total number of spots on the master gel zahlavi CZ Normalizace •Rozdíly ve velikosti spotů a intenzitě (mezi gely) – nejsou způsobeny rozdílnou expresí • •Variace způsobené různými faktory – pipetování, příprava a zpracování vzorku, barvení….. • • NORMALIZACE = předpoklad pro správné srovnání kvantity spotů • • * zahlavi CZ Spot quantity •celková intenzita definovaného spotu v daném zobrazení gelu (pro výpočet se používá gaussovské zobrazení spotu) •koresponduje s množstvím proteinu v aktuálním spotu • zahlavi CZ Spot quantity •Spot quantity = celková intenzita definovaného spotu v gelu, odpovídá množství proteinu v aktuálním spotu • •Pro výpočet kvantity gaussovského spotu v PDQuestu platí: •spot height x π x σx x σy •spot height – (peak value) – pík gaussovského zobrazení spotu, měří se v OD nebo image units •1 image unit (IU) = 100 mikrometrů nebo 0,1 mm •σx = SD gaussovského rozdělení spotu ve směru osy x (v IU) •σy = SD gaussovského rozdělení spotu ve směru osy y (v IU) zahlavi CZ Normalizace •Kompenzace rozdílů nezpůsobených a nesouvisejících s vlastní expresí •Provádí se pro každý gel v experimentu •Zahrnuje: §nenormalizovanou intenzitu spotu §„scaling“ faktor – volí si uživatel §faktor kompenzující chyby pipetování §normalizační faktor (v závislosti na zvolené metodě) zahlavi CZ Metody normalizace * •Total quantity in analysis set •Total quantity in valid spots •Total density in gel image •Specified value •Mean of log ratios •Local regresion model * zahlavi CZ Replikativní skupiny •Použití •máme-li 2 a více gelů od jednoho vzorku •umožňují seskupit kopie gelů daného vzorku a určit průměrnou kvantitu každého spotu •analýza gelů v replikách je podmínkou pro aplikaci statistických nástrojů (např. Student T-test) * * zahlavi CZ Analytické sety •Tři typy analytických setů: • •kvalitativní •kvantitativní •statistické (pouze pro replikativní skupiny) •Booleovy analytické sety • zahlavi CZ Prezentace výsledků zahlavi CZ Prezentace výsledků zahlavi CZ Prezentace výsledků zahlavi CZ Prezentace výsledků – Redfin Ludesi zahlavi CZ Řezání spotů •Manuálně • (viditelné barvičky, transluminátor) • •Automaticky • (spot cutter) • zahlavi CZ Skladování gelů •Uchovávání gelů: •H2O + případně přídavek azidu •vysušit a zatavit do fólie •Zabránit kontaminaci keratiny – digesce keratinů probíhá stejně jako digesce hledaných proteinů – problémy při detekci slabších proteinů •Digesce •Štěpení trypsinem zahlavi CZ 2D elektroforéza • •Neexistuje standardizace pro přípravu vzorků a průběh elektroforézy. •Není snadné srovnávat výsledky z různých laboratoří. •Protein nelze identifikovat pouze na základě jeho pozice v gelu. •Musí následovat identifikace – MALDI,LC MS/MS. • zahlavi CZ Variabilita •Rozdíly ve skupině vzorků- biologická •Technická - váže se k používaným analytickým technikám, může být náhodná nebo systematická •DIGE – snižuje variabilitu mezi gely • Image analysis •Image acquisition •Background substration •Specles, streaks •SW – identifikace spotů,velikost a ohraničení spotu * * zahlavi CZ Zdroje chyb •Nedostatečná rehydratace stripu •Neúplná absorpce vzorku na strip •Neúplný přenos proteinů z prvního do druhého rozměru •Barvení zahlavi CZ Ohraničení spotu zahlavi CZ Ohraničení spotu zahlavi CZ Detekce - specle zahlavi CZ Příklady zahlavi CZ Příklady • • • •Stejný vzorek dělený na různých typech gelů * zahlavi CZ zahlavi CZ OPVK_MU_vlevo_2 •Děkuji za pozornost. Tato prezentace vznikla s podporou projektu OP VK „Rozvoj týmu pro výuku, výzkum a aplikace v oblasti funkční genomiky a proteomiky“ (CZ.1.07/2.3.00/09.0132)