KURZ ZÁKLADŮ PROTEOMIKY
ČASOVÝ ROZVRH:
PONDĚLÍ 7:50- 7:55 Zahájení praktika (UKB, A2, 2.NP, místnost č. 211, Dr. Hejátko)
8:00 – 9:00 2-D elektroforéza – rehydratace proužků
9:00 – 9:30 Exprese rekombinantních proteinů – zaočkování expresní kultury
9:30 – 10:00 Úvod do experimentální části (přednáška)
9:30-9:40 2D elektroforéza (Dr. Konečná)
9:40-9:50 MS analýza (Dr. Zdráhal)
9:50-10:00 Rekombinantní proteiny (Mgr. Dopitová)
10:00 – 13:00 Struktura proteinů, proteomické databáze (Dr. Zdráhal, Dr. Janda,
doc. Marek)
13:00 – 13:45 OBĚD
13:45 – 14:30 Exprese rekombinantních proteinů – indukce
Příprava 1-DE gelů (pro SDS-PAGE a nativní PAGE)
14:30 – 15:00 In-solution proteolytické štěpení směsi proteinů pro LC-MSMS
analýzu
15:00 – 15.30 Příprava 1-DE gelů (pro SDS-PAGE a nativní PAGE)
15.30 -16.05 Příprava gelů pro 2-DE
16:05 – 16:45 Exprese rekombinantních proteinů – sklizeň kultury
Příprava noční kultury pro izolaci plazmidové DNA
16.45 – 18:00 1. rozměr 2-D elektroforézy: izoelektrická fokuzace (IEF)
ÚTERÝ 7:45 – 9:15 Izolace plazmidové DNA
9:15– 10:00 Sekvenování – PCR
10:00 – 11.00 2. rozměr 2-D elektroforézy: SDS-PAGE
11,00 – 12.00 OBĚD
12.00 – 14.00 Barvení 2-DE gelů, densitometrie
14.00 – 17.00 Software pro vyhodnocování 2-D gelů, databáze 2-D gelů
Sekvenace DNA –čištění vzorku (prostřídání skupin), nasazení vzorku
17.00 – 17.30 Ukončení in-solution proteolytického štěpení proteinů pro LC-MS/MS
analýzu
Nasazení vzorků do autosampleru a začátek LC-MS/MS analýzy
STŘEDA 7:30 – 8:30 In-gel proteolytické štěpení proteinů separovaných 2-D
elektroforézou
8:30-13:00 Purifikace rekombinantních proteinů pomocí metalochelatační
afinitní chromatografie
Demonstrační chromatografie – FPLC
PAGE analýza rekombinantních proteinů – příprava vzorků
- SDS-PAGE analýza
Stanovení koncentrace proteinů metodou dle Bradfordové
13:00 – 14:00 OBĚD
14:00 – 15:00 Sekvencování DNA – vyhodnocení výsledků
ČTVRTEK 8:30 – 9:00 Nativní PAGE analýza – nanesení vzorků na gel
9:00 – 11:00 Analýza proteomu – identifikace proteinů metodou MALDI-TOF
MS (ukončení in-gel proteolytického štěpení proteinů separovaných
2-D elektroforézou a analýza vzorků MALDI-TOF hmotnostní
spektrometrií)
11:00 – 12:30 Ukončení nativní PAGE – aktivitní barvení (MUG)
- Western blotting
12:30 – 13:30 OBĚD
13:30 – 16:30 Western blotting
Analýza obrazu – densitometrie. software pro vyhodnocování 1D gelů
Dle dohody (vyhodnocení čistoty purifikovaných proteinů)
Vyhodnocení sekvencování DNA, čtecí rámec (Work Bench)
PÁTEK 8:00 – 10:00 Vyhodnocení výsledků LC-MSMS a MALDI-TOF MS analýz
10:00 – 11:00 “dodělávky“, konzultace, vypracování a odevzdání protokolů
11:00 kolokvium
Cvičící (legenda):
2-DE a příprava pro MS RNDr. Hana Konečná, Danuše Fridrichová
Analýza obrazu RNDr. Jana Buršíková
MS analýza doc. RNDr. Zbyněk Zdráhal, Dr.
Struktura proteinů RNDr. Lubomír Janda, PhD., doc. Jaromír Marek, Ph.D.
Exprese a purifikace rekombinantních proteinů Mgr. Radka Dopitová, Ph.D., Ing. Blanka Pekárová,
Ph.D., Bc. Martina Válková, Mgr. Zuzana Gelová, Ing.
Matej Zábrady
Izolace a purifikace DNA, práce s WorkBench RNDr. Eliška Nejedlá, CSc.
Sekvencování DNA Bc. Martina Válková
Dohled nad laboratoří a přípravou materiálu ing. Šárka Skoupá