Asimilace N – ze sloučenin anorganických do organických – běžné (rostliny, mikroorganismy obecně) N[2] – inertní, problém převést na sloučeninu - kyslíkaté – výboje - redukce na NH[3] – energeticky náročná N[2] + 3H[2] -> 2NH[3] DG^°' = 32,6 kJ.mol^-1 Technologicky – katalýza (pův. Os a U, dnes Fe^3+, 400 – 650 ^oC, 10 – 40 MPa) – Haber-Bosch 1913 – spotřebuje ca 1% veškeré celosvětově produkované energie Biochemicky – enzymová katalýza + ATP 25B Nitrogenasa Probíhá podle rovnice N[2] + 8H^+ + 8e^- -> 2NH[3] + H[2] na každý elektron se spotřebují 2 ATP, tedy 16 ATP -> 16 ADP + 16 Pi Celkově N[2] + 4NADH+ H^+ + 16MgATP -> 2NH[3] + H[2] + 4NAD^+ + 16MgADP + 16Pi Tato redukce je omezena na několik mikroorganismů – symbiotické a volně žijící Rhizobium – symbiont vikvovitých rostlin Azotobacter, Klebsiella, Clostridium a cyanobacteria (vodní) Reakce je katalysována nitrogenázovým komplexem složeným z FeS-proteinu dinitrogenasa reduktasy (složena ze 2 podjednotek o ca 65 kD, obsahuje 4Fe a 4S na dimer, citlivá na kyslík) a MoFe-proteinu dinitrogenasy (a[2]b[2] heterotetramer s velkým redoxním centrem obsahujícím Fe[4]S[3]a Fe[3]MoS[3] spojené 3 sulfidovými skupinami) Nitrogenasová reakce může být rozložena do 3 kroků: 1. redukce FeS-proteinu externím donorem elektronů 2. redukce MoFe-proteinu redukovaným FeS-proteinem 3. redukce N[2] MoFe proteinem První reakce vyžaduje NADH a je katalysována feredoxinem. Ve druhém stupni dochází ke spřažení s exergonickým pochodem – hydrolýzou ATP. Podstatou je snížení redoxpotenciálu (z -350 mV na -450 mV) po fosforylaci proteinu, to umožní redukovat koncový enzym – FeMo-protein o nízkém E^’0, jenž je pak schopen redukce N[2]. Úloha Fe[4]S[4] při redukci dinitrogenasy Přenos elektronu mezi klastry Vazba N[2] v klastrech dinitrogenasy Nitrogenasa (podobně jako RUBISCO) je syntesována ve velkých množstvích, u diazotofytů tvoří až 10% všech bílkovin. Nitrogenasa redukuje i jiné substráty se strukturou podobnou N[2], dobrým měřítkem její aktivity je redukce acetylenu: HCCH + 2e^- + 2H^+ -> H[2]CCH[2] Schema mechanismu redukce N[2] Problém citlivosti ke kyslíku, produkce leghemoglobinu odčerpávajícího O[2] (v rostlinné buňce, kodován v jejím jádře. Symbiosa – rostlina zásobuje symbionta metabolity (z TCA). Lokalisace enzymů redukce dusíku Možnosti GMO – nitrogenázy v rostlinách. Jiné typy nitrogenas (V místo Mo, účast azotoflavinu aj.)