Chromatografické metody Podstata •Distribuce látek mezi dvě fáze - stacionární a mobilní – popsána distribučními izotermami • CS = f(CM). •Rovnováha je neustále porušována a obnovována průtokem mobilní fáze. • Chromatografie • •Cvet – separace chlorofylů na Al2O3 1906 Typy chromatografie •Mobilní fáze –kapalina (liquid) – LC –plyn (gas) – GC •Stacionární fáze –pevná (solid) – LSC, GSC –kapalná (liquid) – LLC, GLC •Uspořádání –sloupec (kolonové), tenká vrstva - TLC •Provedení analytické a preparativní – • • Schematický průběh sloupcové chromatografie E:\obr22.gif Chromatogram – eluční profil Retenční – eluční čas tr •Doba od nástřiku vzorku po dosažení maxima eluční křuvky •Retenční – eluční objem Vr •Objem mobilní fáze proteklý od nástřiku vzorku po dosažení maxima eluční křuvky •Fm – objemová rychlost mobilní fáze Mrtvý objem •Vr – zdánlivý retenční objem • •Vr’- redukovaný (skutečný) retenční objem • •Vm- mrtvý objem – mimokolonové příspěvky • + mimočásticový objem kolony Kapacitní faktor k’ •Vs – objem stacionární fáze •VM – objem mobilní fáze •cs – rovnovážná koncentrace látky ve stacionární fázi •cM – rovnovážná koncentrace látky ve mobilní fázi •Distribuční koeficient •k’= 1 – 10 Účinnost kolony počet teoretických pater N •Yr •½Yr Účinnost kolony výškový ekvivalent teoretického patra H •l – délka kolony Účinnost kolony Rozlišení •tr1 •tr1 •Yr1 •Yr2 •R12=1.5 – nulové překrytí •R12=1.0 – překrytí 2 % •Yr1 •Yr2 Síly a efekty využívané při separaci •Iontové síly •Polární síly •Nepolární síly •Sterické interakce •Efekt velikosti molekul Rozdělovací chromatografie Rozdělovací chromatografie •cS •cM •Použití – analytická PC, TLC Adsorpční chromatografie Adsorpční chromatografie •cS •cM Adsorpční chromatografie •Stacionární fáze – polární • • Silikagel SiO2 . n H2O • • Oxid hlinitý Al2O3, AlO(OH), Al(OH)3 • • Hydroxyapatit [Ca5(PO4)3OH] • Adsorpční chromatografie •Mobilní fáze – nepolární • •Eluce - zvyšováním polarity mobilní fáze • •Eluotropická řada: •uhlovodíkyMrB>MrC Gelová permeační chromatografie •Totální exkluse •Totální permeace •Selektivní permeace Gelová permeační chromatografie •Nanášení vzorku – objem vzorku < 2% • objemu kolony •Eluce – izokratická • •Použití : stanovení Mr, odsolování, purifikace PC a TLC PC a TLC •1944 – Martin, Snyge - PC aminokyselin • (Nobelova cena) • •1952 – TLC nahrazuje PC Instrumentace PC a TLC Chromatografický papír •Nemodifikovaný • •Modifikovaný – ionexy, acylace • •f. Watman (Anglie) • Schleicher-Schüll (Německo) TLC •Vlastní příprava - sypané, nalévané • •Komerčně dostupné - Siluful (Cz) • Watman • PC a TLC - mody •rozdělovací •adsorpční •ionexová •hydrofobní – RP a HIC •gelová permeační Nanášení vzorku •Pipety • •Kapiláry • Provedení •Vzestupné • •Sestupné • •Kruhové • •Dvojrozměrné • Vzestupné • • • • • • • • • • • Sestupné • • • • • • • • • • • Kruhové • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • Vyvíjení E:\obr46.gif Dvojrozměrné • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • Provedení •Analytické • •Preparativní • Analýza kvalitativní • • • • • • • • •standardy •vzorky Analýza kvantitativní • • •Planimetrie • •Denzitometrie • • • • • • • • •Plocha •skvrn Denzitometrie E:\obr48.gif Denzitometrie E:\obr49.gif Preparace •PC – vystřižení a eluce skvrny • •TLC – vyškrábání a eluce skvrny • – odsání a eluce skvrny Chromatografie Kapalinová chromatografie rozdělení •Nízkotlaká (atmosferický tlak) – LPC • •Střednětlaká (4 Mpa) – FPLC • •Vysokotlaká (40 Mpa) – HPLC Kapalinová chromatografie využití •LPC – semipreparativní • •FPLC – semipreparativní a analytická • •HPLC – analytická • Kapalinová chromatografie doba trvání •LPC – hodiny • •FPLC – desítky minut • •HPLC – minuty Zařízení pro LPC E:\71563.gif Instrumentace pro LPC •Pumpa – peristaltická nebo gravitace •Gradient – mísič gradientu •Dávkování – přímo pumpou na kolonu •Kolony – skleněné •Detekce – spektrofotometrická 254, 280 nm •Vyhodnocování – zapisovač •Sběrač frakcí – programovatelný Instrumentace pro FPLC a HPLC Zařízení pro HPLC E:\system.gif Pumpy Tlaková pumpa Lineární dávkovače Pumpa jednopístová Pumpa dvoupístová C:\Dokumenty\hplc\pmp_2p2v.gif Pumpa dvoupístová C:\Dokumenty\hplc\dpist_pm.gif Gradient nízkotlaký C:\Dokumenty\hplc\grad_for.gif Gradient vysokotlaký C:\Dokumenty\hplc\hp_grad.gif Dávkování – dávkovací ventil C:\Dokumenty\hplc\j_valve.gif Dávkovací ventil – „Load“ C:\Dokumenty\hplc\inj_load.gif Dávkovací ventil – „Inject“ C:\Dokumenty\hplc\inj_inj.gif Kolona C:\Dokumenty\hplc\collumn.gif Detektory UV – VIS detektor s fixní vlnovou délkou C:\Dokumenty\hplc\uv_fix.gif UV – VIS detektor s proměnlivou vlnovou délkou C:\Dokumenty\hplc\uv_var.gif UV – VIS detektor s diodovým polem C:\Dokumenty\hplc\uv_darr.gif LC-MS Vyhodnocení •Zapisovače • •Integratory • •Integrační software + PC Provedení •Analytické • •Preparativní • Analýza kvalitativní •Srovnání retenčních časů (objemů) píků u vzorku a standardů •„spiking“ – přidání standardu do vzoru ® • nárůst výšky píků •Specifická detekce – UV-VIS, fluorescence, • elektrochemická •MS Analýza kvantitativní •¯ •Plocha (výška) píku • •Metoda externího standardu •Metoda vnitřního standardu •Metoda standardního přídavku • LC analýza