Elektromigrační metody Jsou založeny na pohybu nabiých částic v elektrickém poli Základní síla vyjádřena Coulombovým zákonem •Fe = k . Q1.Q2/ r122 •Fe = síla působící na částice o nábojích Q1a Q2 o souřadnicích 1 a 2, r12 = jejich vzdálenost •k = 1/4Πε0, kde ε0 je permitivita prostředí • •Fe = Q.E •Kde E = intensita elektrického pole (V.m-1) Fe uděluje částici zrychlení, zvyšující se rychlost vyvolá zvýšení frikční síly Ff opačného směru Fe = m . a, Ff = v . f = v . 6Πη.r Kde m je hmotnost a r poloměr částice (pro kouli),v její rychlost, f frikční koeficient a η viskosita prostředí Částice dosahuje rychlosti, kdy se vyrovnají obě síly E . Q = v . f, pak v = E . Q / f Vliv E eliminujeme vyjádřením elektroforetické mobility jako rychlosti při jednotkové intensitě elektrického pole μ = v/E = Q/f = Q/6Πη.r Rychlost i mobilita jsou přímo úměrné náboji a nepřímo úměrné velikosti částice Podle druhé Sekundární jevy •Jouleovo teplo •Elektroosmóza Jouleovo teplo P = výkon [W.m-3] S = průřez [m2] k = vodivost [W-1.m-1] i = elektrický proud [A] Elektroosmotický tok Elektroosmotický tok x = potenciál Helmholtzovy dvojvrstvy h = viskozita e = dielektrická konstanta meo = elektroosmotická mobilita Původ elektroosmotického toku Elektroforéza • •„Dělení nabitých částic na základě rozdílných elektroforetických mobilit“ Elektroforéza •Volná • •Zónová Volná elektroforéza + + - - C B+C A+B+C A+B+C A A+B mA > mB >mC Zónová elektroforéza + + A+B+C A B C - - mA > mB >mC Stabilizace •Rotací • •Gradienty hustoty • •Porézními medii • •Kapilárou • Požadavky na porézní media •Homogenita •Inertnost - nespecifické interakce • - nulový EOF •Reprodukovatelná a snadná příprava •Mechanická pevnost •transparentnost » Upořádání Horizontální + - + - Upořádání Vertikální Chromatografický papír •Složení – celulosa • -Nehomogenní -Přítomnost ionogenních skupin -Špatně se chladí – pálí se - •Použití : téměř už se nepoužívá Agar a agarosa •Složení – kopolymer galaktosy a anhydrogalaktosy • -Přítomnost ionogenních skupin – silný EOF •+ Velké pory •+ Snadná příprava - •Použití : imunoelektroforetické metody • elektroforéza NK Acetát celulosy •Složení – acetát celulosy • •+ Komerčně dostupný •+ Dobré mechanické vlastnosti - •Použití : imunoelektroforetické metody • klinické aplikace Škrob •Složení – hydrolyzovaný škrob • •+ poprvé se uplatňuje efekt molekulového síta -Špatné mechanické vlastnosti -Komplikovaná a nereprodukovatelná příprava -Není transparetní - •Použití : izoenzymová analýza Sypané vrstvy •Složení – Sephadex – zesíťovaný dextran • •+ uplatňuje efekt molekulového síta - •Použití : preparativní Polyakrylamid •Složení – kopolymer akrylamidu a • N,N,- methylenbisakrylamidu • •+ plně splňuje požadavky -Monomery jsou neurotoxiny !!!!!! - •Použití : analýza bílkovin Polyakrylamid Polyakrylamid - příprava •Radikálová polymerace • •Katalyzátor – tetramethylethylendiamin • TEMED •Iniciátor - chemicky – (NH4)2S2O8 • - fotochemicky – ribloflavin + UV • Polyakrylamid - složení a – akrylamid (g) b – methylenbisakrylamid (g) m – objem (ml) Provedení PAGE •vertikální x horizontální •deskové x trubičkové •homogenní x gradientové •kontinuální x diskontinuální Provedení PAGE protean_IIxiw_combs Provedení PAGE 1011631 Diskontinuální PAGE Orstein, Davis Koncentrační gel T = 3 – 5 % Separační gel T = x % Elektrodový pufr Tris Glycin pH 8.3 Koncetrační pufr Tris HCl pH 6.8 Separační pufr Tris Glycin pH 8.3 Elektrodový pufr Tris Glycin pH 8.3 Cl- Gly- B- A- Cl- Gly- B- A- Separační gel Zónová elektroforéza Koncentrační gel Izotachoforéza + - SDS PAGE + 1 g bílkoviny váže 1.4 g SDS Þ uniformní náboj na jednotku MW SDS PAGE Stanovení Mr pomocí SDS PAGE Mr Rm Stanovení Mr pomocí SDS PAGE - standardy 1046053 67771 Použití SDS PAGE •Stanovení Mr •Analýza komplexních směsí •Sledování purifikace bílkovin •Stanovení podjednotkového složení + - + - + - PAGE - sekvenace DNA figure2 Izoelektrická fokusace • •„Elektroforéza v gradientu pH, částice jsou separováný podle svých pI“ Tvorba gradientu •Anoda (+) H3O+ 6H2O®O2 + 4H3O+ + 4 e- • •Katoda (-) OH- 4H2O®2H2 + 4OH- - 4 e- • Ampholyty Izoelektrická fokusace pH + - H3O+ OH- A + - H3O+ OH- A pI t0 t1 Izoelektrická fokusace + - H3O+ OH- pH tx Kapilární izoelektrická fokusace Izoelektrická fokusace analytická •Provedení - v gelech – PAGE, agarosa • •Použití - sledování komplexních směsí • - izoenzymové složení • - stanovení pI – rozřezání a eluce • – mpH elektrody • – pI standardy • Izoelektrická fokusace analytická 1026921 Izoelektrická fokusace analytická 1046056 Izoelektrická fokusace analytická - standardy 71383 Dvourozměrné metody •Metoda titračních křivek • •Dvourozměrná elektroforéza Metoda titračních křivek I.rozměr – IEF bez vzorku II.rozměr – elektroforéza se vzorkem pH 3.0 10.0 - - + + pH 3.0 10.0 10% Dvojrozměrná elektroforéza 10% pI Mr I.rozměr IEF II.rozměr SDS-PAGE pH 3.0 10.0 Dvojrozměrná elektroforéza 71377 Dvojrozměrná elektroforéza pI Mr CelM