Metody značení a imobilizace biomolekul Petr Skládal Ústav biochemie PřF MU Kamenice 5, Brno skladal@chemi.muni.cz http://biosensor.chemi.muni.cz/edu/mib Uvod ■ modifikace biomolekul: - vzájemné spojování - zavádění vhodných značek - navázání na pevný povrch (separační materiály, mg. částice, sensory, ...) ■ základ řady moderních: - vědeckých výzkumných metod - bioanalytických procesů -terapeutických postupů ttF» L" ti i.: a f •........,ft 7 - cílem přednášky je podat ucelený pohled na tuto problematiku 4 ^ 1 * ■ « J r m 1 Souhrn přednášky 1. Modifikace proteinů a peptidů. 2. Funkční skupiny nukleotidů, modifikace DNA a RNA. Modifikace (poly)sacharidů. 3. Chemické reakce vybraných skupin biomolekul. 4. Biokonjugační reakce, zesíťující činidla. Štěpitelné můstky. -o, Fluorescenční značky. 6. Biotinylace, chelatační skupiny, histidinové skupiny, boronátové komplexy. Radioaktivní značení. Liposomy, nanočástice. 7. Enzymové značky, metodiky značení a detekce aktivity. 8. Imobilizace biomolekul. Aktivace matric, polymerní materiály, porézní skleněné nosiče. 9. Aktivace povrchu zlata, platiny, uhlíku a křemíku. Spontánní vznik monovrstev, fotoaktivace. 10. Charakterizace biokonjugátů - stupeň substituce, povrchová hustota Ugandu. 11. Aplikace: konjugace haptenů s nosiči, značení protilátek. 12. Aplikace: imobilizace proteinů na povrch zlata, příprava DNA biočipů. Literatura ■ P. Skládal: Metody značení a imobilizace biomolekul. Elektronický text (PDF), MU Brno, 2007. ■ Lowe CR., Dean P.D.G.: Afinitní chromatografie. SNTL, Praha 1979. ■ Hermanson G.T., Mallia A.K., Smith P.K.: Immobilized Affinity Ligand Techniques. Academie Press, San Diego, CA, 1992. ■ Hermanson G.T.: Bioconjugate Techniques. Academic Press, San Diego, CA, 1996. ■ CM. Niemeyer: Bioconjugation Protocols, Strategies and Methods. Humana Press, Totowa, NJ, 2004 ■ internetové zdroje - webové stránky dodavatelů reagencií (Pierce, Sigma, ...) Hermanson G.T., Mallia A.K., Smith P.K.: Immobilized Affinity Ligand Techniques. Academic Press, San Diego, 1992. PART I Bioconiugate Chemistry I. Functional Targets Greg T. Hermanson 2. The Chemistry of Reactwe Groups PART II Bioconjjgate Reagents 1 Zero-Length Cross-linker; 4. Hornc afunctional Cross-linkers 5. Heterobifunctional Cross-linkers & Trituncbonal Cross linkers 7. Cleavable Reagent Systems 8. Tags and Probes PART III Bioconjjgate Applications 9- Preparation of Hapten Camer Immunogen Conjugates 1(L Antibody Modification and Conjugation 11. Immunotoxm Conjugation Techniques 12. Preparation 0f Liposome Carjugates and □emaiives 11 Avidm-Biotin Systems 14, Preparation of Colloidal-Gold Labeled Proteins 15. Modification with Synthetic Polymers 1& Enzyme Modification and Conjugation 17. Nucleic Acid and Oligonucleotide Mcdrficaiior and Conjugation 169 m za 2i7 535 Hermanson G.T., Mallia A.K., Smith P.K.: Immobilized Affinity Ligand Techniques. Academic Press, San Diego, 1992. ■ The matrix ■ Activation methods ■ Immobilization of ligands ■ Techniques of the trade ■ Selected applications Immobilized Affinity Ligand Techniques CM. Niemeyer: Bioconjugation Protocols, Strategies and Methods. Humana Press, Totowa, NJ, 2004 METHODSj IM Vl(.)l EFL'tAK UIOItK.Y Volume 283 Bioconjugation Protocols J*' Strategies, and Methods \l edited by (hustotM. Niemeyer Cmlenti Modifikace peptidů a proteinů ■ aminokyseliny spojené navzájem peptidovou vazbou: modifikovat lze některé postranní řetězce AK, koncovou aminoskupinu a karboxyskupinu, a případně také kovalentně připojené prostetické skupiny (např. koenzymy) AK nepolární a hydrofobní: glycin, alanin, valin, leucin, isoleucin, methionin a prolin AK nepolární aromatické: fenylalanin a tryptofan - tyto jsou často orientovány dovnitř struktury proteinu, a tedy nepřístupné pro modifikační činidla ■ AK polární: asparagin, glutamin, threonin a serin - mimo Gin často posttranslačně modifikovány oligosacharidovými zbytky přes N- nebo O- glykosidické vazby - často modifikovány enzymově (např. fosforylace), avšak chem. modifikace ve vodném prostředí nesnadná, protože nukleofilní vlastnosti hydroxylu i amidu se blíží vodě ■ AK s ionizovatelnou skupinou - kyseliny asparagová a glutamová, lyzin, arginin, cystein, hlsíldl/j a íyroskj - v deprotonovaném stavu jsou účinná nukleofilní činidla - hlavní cíl modifikačních reakcí Aminoskupina (Lys, Arg, His, N-konec) ■ volná aminoskupina (konec pept. řetězce a Lys) je nejčastějším cílem ■ Lys (pKa 9,3 až 9,5) je obvykle protonován ■ Arg (pKa přes 12) je protonován prakticky vždy ■ His s imidazolovým kruhem (pKa 6,7 až 7,1) ■ aminoskupiny se účastní alkylačních a acylačních reakcí, kdy fungují jako nukleofily ■ imidazol. kruh může být elektrofilní, např. při jodaci Alkylace a acylace aminoskupiny o R ■ průběh při reakcích je nukleofilní substituce - vzniká tetraedrický intermediát, X je obecná odstupující skupina Karboxyskupina (Asp, Glu, C-konec) ■ postranní karboxyly (pKa 3,7 až 4,5) při fyziologickém pH nesou záporný náboj ■ vhodné pro tvorbu amidových, případně i hydrazidových derivátů ■ lze připravit i thioestery - ve vodném prostředí nestabilní ■ derivatizace probíhá přes reaktivní intermediáty -nejznámější je použití karbodiimidů (EDC, DCC, CMC): CMC ... cyklohexylmorfolinoethylkarbodiimid DCC ... dicyklohexylkarbodiimid - nerozp. ve vodě, spíše pro konjugace malých molekul Aktivace karboxylu karbodiimidem ester amid thioester hydrazid Alternativní postupy ■ reakce s karbodiimidy je velmi rychlá - nesnadná kontrola průběhu, nežádoucí postranní reakce, konkurenční hydrolysa je rychlá ■ konjugační reakce se provádí přes stabilnější aktivované meziprodukty - NHS, N-hydroxysukcinimid, nebo rozpustnější sulfo-NHS o ■ vzniklé NHS-deriváty nebo imidazolylové deriváty jsou relativně stabilní ve vodném prostředí a ochotně reagují např. s aminoskupinou za vzniku amidů -j komerčně je dostupná široká škála NHS-aktivovaných molekul (NHS-biotin, NHS-fluorescein, ...), které se pak velmi jednoduše mohou konjugovat s cílovou biomolekulou (R'-NH2): Thioskupina (Cys) ■ cysteinové zbytky jsou normálně protonované a bez náboje (pK, 8,8 až 9,1) ■ nejdůležitější reakcí v přirorozeném stavu je tvorba vzájemných disulfidů (cystinové uskupení) ■ mohou se účastnit alkylací a reversibilních redoxních reakcí ■ z oxidované formy (disulfid) vzniká redukovaná forma (volná SH skupina) pomocí redukčního činidla dithiothreitolu (DTT, Clelandovo činidlo) ■ reakce může probíhat oběma směry Fenolická skupina (Tyr) ■ diazotační kopulace - elektrofilní substituce na aktivovaném benzenovém jádře - probíhá do ortho polohy, spojení s aromatickými aminoskupinami, aktivací s kys. dusitou (dusitan a HCI) vzniká regující diazoniová sůl - vzniklé konjugáty mají oranžovou barvu ■ další možnost - jodace, radioaktivní značení 125l ■ Manichova kondenzace - připojení aminosloučeniny v přítomnosti formaldehydu Specifita modifikačních reakcí ■ účastní se bílkoviny, které obvykle poskytují řadu různých skupin - jejich srovnání dle síly nukleofilních vlastností: R-S > R-SH, R-NH2 > R-NH3+, R-COO > R-COOH, R-0 > R-OH a H-OH ■ úlohu hraje přítomnost náboje (protonovaná / deprotonovaná forma) - lze ovlivnit volbou pH, ale protože se hodnoty pKa často překrývají, tak to není příliš spolehlivé ■ pro přesné cílení modifikace na konkrétní skupiny je zapotřebí zvolit specificky reagující činidlo Cílené zablokování postranních skupin o n ■ P NH 2 ^_ trinitrobenzensulfonová (LyS)2 R"n=c=s ho3shQkno2 kyselina (subst.) isothiocyanát n aldehyd R-CH=0 (adice - thiomočovina) °2n (+ redukce boronydrjdem) - P-SH R i Cl-Hg—(\ ,)— COOH p-chlormerkuri °VNNí:>0 (CyS) benzoová k. T—T maleimidy, např. NEM (adice) 5,5'-dithio-bis(2-nitrobenzoová k.) H00C C00H DTNB, Ellmanovo činidlo °2N^\ tfS~S~\ N°2 (adice (substituce) CO—OC2H5 ■ P"n^/' (His) [^Vih Os diethylpyrokarbonát (alkoxylace) CO—OC,H 2' '5 Cílená modifikace postranních skupin ■ P-OH (Ser) lf/0-CH(CH3)2 F-PN O—CH(CH3)2 diisopropylfluorfosfát DFP (fosforylace) C-S-F 2 O fenylmethylsulfonylfluorid PMSF (sulfonylace) (Tyr) ■ P- (Arg) C(N02)4 oh tetranitromethan (nitrace) ■ NH-<^ NH2+ CH, 2,3-butandion (kondenzace) N I CO-CH, N-acetylimidazol NAI (acetylace) fenylglyoxal (kondenzace) Modifikace nukleových kyselin ■ nukleové kyseliny (DNA a RNA) jsou tvořeny z jednotlivých nukleotidů spojených fosfodiesterovou vazbou mezi sacharidovými kruhy ■ základní složkou jsou báze - pyrimidinové (C cytosin, Tthymin a U uracil) - purinové (A adenin, G guanin) ■ spojením s molekulou sacharidu (ribosa nebo deoxyribosa) poskytují nukleosidy (např. Ade adenosin nebo dAde deoxyadenosin) ■ připojením fosfátu vznikají nukleotidy (např. AMP adenosin monofosfát). Nukleové kyseliny n h 2" hydroxyl schází u DNA (deoxy ...) ho 5' konec 9 3" konec modifikační reakce mohou typicky směřovat na molekuly bází méně časté je využití sacharidové části (2' hydroxyl u RNA) velmi běžné je připojení dalších funkčních molekul na konec řetězce nukleové kyseliny u Pyrimidinové base ■ části jejich molekul mohou být cílem ataku elektrofilních (červeně) i nukleofilních (modře, pozice 4 a 6) činidel ■ v molekule uracilu nukleofilní substituce v C6 pozici následně aktivuje C5 pozici pro elektrofilní atak: nh. nh. hn Reakce cytosinu s hydrogensiřičitanem vzniká sulfonovaný derivát, R R v přítomnosti nukleofilu (amin) hnx dojde k transaminaci - možnost +^JL zavést funkční skupiny Hľ^ I Hľ' v slabě kyselém prostředí pak dojde k hydrolyse aminoskupiny na C4 a následně po alkalizaci se odštěpí hydrogensiřičitan - proběhla konverze na uracil Biotinylace cytosinu R ■ reaktivní adukt cytosinu s hydrogensiřičitanem se v reakci s biotin-hydrazidem přemění na žádaný derivát Cytosin - halogenace ■ možností vpravení vhodné reaktivní aminoskupiny v postranním řetězci je halogenační reakce ■ vodný roztok jodu nebo bromu, případně pomocí N-bromosukcinimidu ■ poslední krok je substituce diaminem: Purinové base ■ pozic pro nukleofilní i elektrofilní ataky je celá řada ■ halogenační reakce s N-bromosukcinimidem poskytuje brom v pozici C-8 jak v případě adeninu, tak guaninu ■ reakce s kyselinou jodoctovou: ■ in vitro enzymová synthesa DNA polymerasou pomocí komplementárního templátového vlákna ■ do reakční směsi se přidají pozměněné nukleotidy, schopné párování, které tak do struktury DNA vnesou žádané funkční skupiny ■ je-li vyžadováno správné párování, tak stupeň substituce max. 30-40 modifikovaných míst/1000 bází - derivatizace na cukr-fosfátové kostře nebo na koncích vlákna párování nevadí ■ pozměněné base - deriváty s biotinem, nebo methylenový řetězec s volnou aminoskupinou - menší modifikace - není ovlivněna rychlost připojování bází ■ mnohočetné včlenění značených bazí může být nevýhodné pro hybridizační reakci vr karboxyskupina na N6 Modifikace DNA Metoda náhodných primerů ■ směs náhodných hexanukleotidových úseků sloužících jako 3'-OH primery s templátovou DNA ■ modifikované nukleotidy se připojují pomocí DNA polymerasy I - pouze Klenowův fragment, který postrádá 5'-3' exonukleasovou aktivitu přítomnou v nativním enzymu z E. coli ■ výsledkem je náhodné včlenění značených bazí Nick-translace ■ nick-translační značení účinkuje na dvojitou šroubovici ■ směs pankreatické deoxyribonukleasy I (DNasa I) a DNA polymerasy I ■ v přítomnosti Mg2+ DNasa (v limitujícím množství) provádí hydrolýzu pouze v jednom vlákně ■ vzniklé štěpy jsou však ihned zaplněny přítomnými modifikovanými i nativními nukletidovými monomery za katalysy DNA polymerasy ■ výsledkem je modifikace původní molekuly dsDNA Značení v průběhu PCR ■ nejúčinnější metodou je provést značení DNA v průběhu polymerasové řetězové reakce (PCR) - současně se samozřejmě zmnoží množství původní DNA ■ buď se do reakční směsi prostě přidají značené nukleotidy a jsou náhodně vestavovány do nově syntetizovaných řetězců ■ nebo je možné použít pouze značené primery (např. biotinylované) Koncové značení cílem je zamezit modifikaci uprostřed řetězce DNA využití terminálni transferasy - přidává nukleotidy ke 3'-OH koncům DNA bez potřeby templátového vlákna např. také pro radioaktivní značení Sekvenčně-specifické značení rozpoznání cílového místa, vytvoření kovalentní vazby se značkou DNA methyltransferasy (MTasy) - přenáší methylovou skupinu z S-adenosyl-L-methioninu (AdoMet) na A nebo C zbytky methylová skupina se nahradí něčím "užitečnějším" -aziridinový reaktivní zbytek pro vytvoření kovalentní vazby s DNA v průběhu enzymové methylace, biotinová skupina připojena v postranní části značení DNA v předem určeném místě, daném polohou cílové sekvence MTasy Značení pomocí methyltransferasy Fosforamidová metoda • aktivace konc. fosfátu EDC vede s aminy k fosforamidům • reakci lze provést také s imidazolem, čímž vznikne fosforimidazolidový produkt - má ve vodném prostředí prodlouženou životnost a reaguje velmi dobře s aminy - vyšší výtěžky fosforamidové reakce oligonukleotid s 5'-P. Reaktivní EDC fosfodiester imidazol fosforimidazolid O M-U Fosforimidazolid vnesení amino nebo thioskupiny na konec DNA Modifikace RNA molekuly RNA obvykle jednořetězcové, vnitřní vzájemně komplementární krátké sekvence párování vede ke vzniku různých třídimenzionálních struktur (helikální úseky, smyčky, vlásenky, G-kvartety...) další změnou oproti DNA je existence diolového uskupení v molekule ribosy - lze specificky oxidovat jodistanem, na reaktivní aldehydové skupiny vhodně orientované struktury RNA (i DNA) mohou vytvářet vazebná místa, komplementární k jiným biomolekulám - APTAMERY - možnost náhrady protilátek - tyto vazebné struktury, tzv. aptamery, lze vytvářet uměle kombinatorickými postupy (SELEX, systematic evolution of ligands by exponential enrichment) - nejznámější je aptamer vážící thrombin Modifikace sacharidů volné existují v monomerní, oligo- a polymerní formě vázané ve formě konjugátů s proteiny (glykoproteiny) nebo lipidy (glykolipidy) reaktivní skupiny - hydroxyly a oxoskupiny - monosacharidy - dle polohy oxo skupiny aldosy a ketosy - ve vodném prostředí přítomna zejména hemiacetalová forma - glukosa jako glukopyranosa a fruktosa jako fruktofuranosa - následně jsou přirozené oxoskupiny jsou méně reaktivní k modifikaci se využívají postranní glykosidické skupiny pokrývající povrch glykoproteinů velký význam má derivatizace polysacharidových matric sloužících jako stacionární fáze (separace, sensory, ...) Aktivace bromkyanem BrCN ■ klasická metoda aktivace polysacharidových materiálů ■ nevýhodou je vysoká jedovatost činidla ■ výhodou dobré výtěžky reakce -j reakce probíhá v alkalickém prostředí, rozsah je úměrný koncentraci činidla ■ meziprodukt imidokarbonát reaguje s aminoskupinou biomolekuly B za vzniku různých derivátů: OH derivát N-substituovaný N-subst. karbamát isomočoviny imidokarbonát .... , . J Aktivace bromkyanem Oxidace jodistanem ■ jodistan (periodate) za mírných podmínek a v neutrálním pH účinkuje na diolová uskupení v molekule sacharidů ■ vhodné i pro postranní sacharidové složky glykoproteinů - postup je např. často využíván k oxidaci peroxidasy při výrobě enzymových imunokonjugátů j—oh |-oh ^ oh o o ■ získají se reaktivní aldehydové skupiny Reaktivní skupiny ■ obecný pohled na reaktivní skupiny bez vazby na konkrétní typ biomolekuly - univerzálně použitelné metody -j možnosti konverze existujících skupin reakce typické pro vybrané skupiny Vnášení reaktivních skupin ■ přirozené reaktivní skupiny biomolekuly nemusí dostačovat pro zamýšlené syntetické postupy ■ konjugace bílkovin - často heterobifunkční činidla, která vyžadují různé koncové skupiny v obou partnerech ■ jeden z reakčních partnerů předem upraven zavedením potřebné skupiny Thiolace (zavedení -SH) volná -SH skupina je pro konjugace velmi oblíbená v bílkovinách obvykle zřídka, nebo blokováno ve formě disulfidických -S-S- můstků stabilita -SH špatná - oxidace (inertní atmosféra, chelatace iontů kovů - katalyzují oxidaci)_ + NH2 N H, methyl-4-merkaptobutyr- S1-1 * ? ] + CH3OH imidát (Trautův reagent) 1 1 2-iminothiolan cykl. na 2-iminothiolan (imidothioester) T2 R—NH2 H v mírně alk. podmínkách reaguje s primárními aminy alternativní methyl-3-merkaptopropionimidát poskytne kratší můstkovou část -NH2 na -SH pomocí SATA ■ N-sukcinimidyl-S-acetylthioacetát (SATA) působí konverzi aminoskupiny na thioskupinu -j odštěpí se N-hydroxysukcinimid, produkt obsahuje chráněnou sulfhydrylovou skupinu (lze uchovávat) ■ deprotekce nadbytkem hydroxylaminu nh2oh -\— RVSH o\ VCH3 ho—n h ■ není třeba redukce - neovlivní se tedy nativní -SH skupiny ■ analog N-sukcinimidyl-S-acetylthiopropionát (SATP) poskytne delší můstek n-o S—\ o o . R—n h, - Vy _- N n-oh h R-n m: ch, -NH2 na -SH: citiolon a SAM SA ■ citiolon, N-acetylhomocysteinthiolakton resp. 2-acetamido- 4-merkaptobutyrát reaguje jako Trautův reagent, reakci urychluje Ag+ reaktivní cyklický anhydrid - anhydrid S-acetylmerkapto-jantarové kyseliny (SAMSA) uvolnění -SH skupiny deprotekcí s hydroxylaminem >C=0 na -SH ■ konverze oxoskupiny (aldehyd / keton) je možná hydrazidem 2-acetamido-4-merkaptomáselné kyseliny (AMBH) ■ např. pro jodistanem oxidované sacharidy či glykoproteiny ■ vznikne amidová resp. fosfamidová vazba ■ vnesené -S-S- disulfidové uzkupení je možné přímo spojit s molekulou obsahující volnou -SH skupinu (uvolní se cysteamin) ■ nebo lze získat volnou -SH skupinu redukcí, např. DTT ■ cysteamin = 2-aminoethanethiol / 2-merkaptoethylamin / dekarboxycystein / thioethanolamin ■ cystein ■ cystin o -COOH nebo -0-P032- na -SH ■ cystamin v přítomnosti karbodiimidu (EDC) -S-S- na -SH speciální případ, k rozštěpení dojde redukcí, činidel je celá řada, např. s volnou -SH skupinou: - dithiothreitol (DTT, Clelandovo činidlo), 2-merkaptoethanol, 2-merkaptoethylamin imobilizované formy činidel - není třeba provádět separaci nadbytečného činidla odobný výsledek poskytuje i TCEP, tris(karboxyethyl)fosfin nejjednodušší redukce pomocí borohydridu NaBH má význam i pro štěpení nativních S-S můstků v bílkovinách Karboxyskupina místo -NH2 užívají se cyklické anhydridy dikarboxylových kyselin reagují s volnou aminoskupinou - otevírá se kruh a vzniká amid může reagovat i hydroxyl serinu a threoninu, fenolátový anion dává nestabilní produkt dočasné blokování aminoskupiny - anhydrid kyseliny citrakonové - poskytuje amidovou vazbu při pH 8, snadno hydrolyzuje při pH 3 až 4 za opětovného uvolnění aminoskupiny možnosti: a sukcinanhydrid, b glutaranhydrid, c maleinanhydrid, d anhydrid kyseliny citrakonové změna aminoskupiny za karboxy-skupinu mění náboj a pl dané biomolekuly Halogenoctové kyseliny ■ kyselina jodoctová: - může reagovat s aminoskupinami lyzinu nebo imidazolového kruhu histidinu, se sulfhydrylovou skupinou cysteinu i s methylthioskupinou methioninu - reakce závisí na pH prostředí ■ další a-halogenoctové kyseliny - podobně - reaktivita derivátů klesá v řadě I > Br > Cl > F - z druhé strany v řadě sulfhydryl > imidazolyl > thioether > amin - za ekvimolárních poměrů a v mírně alkalickém prostředí jodacetát reaguje exkluzivně s cysteinovým zbytkem ■ kyselina chloroctová slouží k derivatizaci hydroxylových skupin v polysacharidových matricích (dextran) - reakce probíhá v alkalickém pH: r-oh + ^O^JL Vnesení aminoskupiny ■ nejběžněji konverze karboxylu pomocí diaminů v přítomnosti karbodiimidu (EDC) - vzniká amidová vazba a druhá koncová aminoskupina zůstává volně k dispozici ethylendiamin (krátký můstek) nh2 hexamethylendiamin (1,6-diaminohexan) NH2 3,3'-iminobis(propylamin) ^^NH2 JeffaminEDR-148(hydrofilní) ■ konverze karboxyskupiny na aminoskupiny výrazně ovlivní celkový náboj biomolekuly a také její pl hodnotu - často je to zamýšleným účelem modifikace -SH na -N H 2 ■ lze pomocí aminoethyl-8,N-(jodoethyl)trifluoracetamidu: O ^.-► s ^^NH2 R—SH ^-► R-s— H-l O >. F OH - deblokace v druhém kroku je spontánní ■ ethylenimin v alkalickém prostředí - reakce převážně pouze s Cys - činidlo může vznikat přímo v alk. směsi cyklizací z 2-bromoethylaminu R-s + /a-* R-S/^^NH2 Aldehyd na -NH2 ■ redukční aminace pomocí amoniaku nebo diaminu v přítomnosti kyanoborohydridu sodného NaCNBH3 - vzniká Schiffova báze, pak stabilizována redukcí - lze takto připravit např. aminovaný dextran po předcházející oxidaci jodistanem - nedochází k redukci aldehydické skupiny -NH2 z tyrosinu ■ nitrace pomocí tetranitromethanu ■ nitroskupina se zredukuje na aminoskupinu ■ lze výhodně aktivovat kyselinou dusitou na diazoniovou sůl pro kopulační reakce noz nh2 Aminoskupina na aldehyd • sukcinimidyl-p-formylbenzoová kyselina (SFB) • sukcinimidyl-p-formyl-fenoxyoctová kyselina (SFPA) - při reakci vzniká amidová vazba, v případě proteinů výrazně narůstá jejich hydrofobicita Glutaraldehyd Schiffova báze -C=N-je redukována i stabilnější formu (A) reagují i oligomerní adukty glutaraldehydu (E), prc adice aminoskupiny n: dvojnou vazbu (B) kondenzace na cykl. prodi k X^CH, -> "z" N CH3OH CH3OH amidinová vazba je stabilní v mírně kyselém prostředí, při vyšším pH může hydrolyzovat činidla jsou na bázi imidoderivátů dikarboxylových kyselin: - dimethyl adipimidát (DMA, C6 z = 0,86 nm) - dimethyl pimelimidát (DMP, C7 z = 0,92 nm) - dimethyl suberimidát (DMS, C8 z = 1,1 nm) DMP stabilizuje komplexy protilátek s proteinem A dimethyl-3,3'-dithiobispropionimidát (DTBP) obsahuje uprostřed disulfidové spojení (z = 1,19 nm) - může být případně rozštěpen DTT Homobifunkční činidla spojující -SH skupiny ■ dvě skupiny podle stability vznikajícího spojení: - disulfidová vazba - spojení lze snadno rozrušit pomocí oxidačních činidel - thioetherová vazba - spojení trvanlivé ■ 1,4 di-[3'-(2-pyridyldithio)-propionamido] butan (DPDPB) - reverzibilní spojení biomolekul, z = 1,6 nm, 14 atom. řetězec - odštěpovaný pyridin-2-thion lze sledovat při 343 nm - pro vytváření konjugátů redukovaných molekul protilátek s enzymy Thioetherové spojení ■ bis(maleimido)hexan (BMH) reaguje v neutrálním prostředí za vzniku stabilního spojení (z = 1,6 nm) ■ dochází k adici sulfhydrylových skupin na dvojné vazby v cyklu a vznikají tak stabilní thioetherové vazby - mechanismus vychází z použití N-ethylmaleimidu (NEM) jako inhibitoru cíleného na SH skupinu Homobifunkční aldehydy ■ dříve zmíněný glutaraldehyd ■ formaldehyd - nejkratší spojovací můstek, reaguje prostřednictvím ■ Mannichových kondenzací (A) - spojuje sloučeniny s aktivovanými vodíky (např. na jádře fenolu v ortho a para polohách) s formaldehydem a dále s aminoskupinou ■ přes imoniový kationt s aminoskupinou (B) - spontánně vznikne reaktivní imoniový kation, který zreaguje s další aminoskupinou a dojde ke spojení přes C1 můstek Bis-epoxidové sloučeniny - jsou schopné spojovat biomolekuly obsahující nukleofilní skupiny včetně aminů, hydroxylů a sulfhydrylů ■ dochází k otevření tříčlenného epoxidového kruhu (A) ■ reakce probíhají v mírně alkalickém prostředí ■ k aktivaci matric nesoucích hydroxylové skupiny (polysacharidy) ■ nejznámějším činidlem je 1,4-butandiol diglycidylether (B) R"—NH2 H OH 1 D O \ /V ----- R'—SH A R"—OH^S- OH OH Rv Fotoreaktivní crosslinkery ■ bis[p-(4-azidosalicylamido)ethyl]disulfid (BASED) je aktivován ozářením UV světlem (270 nm) ■ uvolní se molekula dusíku a vznikne velmi reaktivní a nestálý arylnitren - rychle se přemění za rozšíření aromatického kruhu na dehydroazepin, ten následně reaguje s aminoskupinou biomolekuly ■ derivát vzniklý po konjugaci obsahuje na 7-členném kruhu fenolický hydroxyl, který ho aktivuje např. pro elektrofilní značení radioaktivním jodem další možnosti... ■ aktivované vodíky na aromatickém jádře - diazoniové deriváty ■ úspěšné spojení se projeví oranžovým nebo ještě tmavším zbarvením vzniklých konjugátů -charakteristické pro diazosloučeniny ■ diazoniové sloučeniny se obvykle generují z příslušných diaminů -o-tolidin a benzidin (p-diaminodifenyl) - reakcí s NaN02 v slabě kyselém prostředí v chlazené reakční směsi ■ vzniklá diazoniová sůl reaguje ochotně se zbytky tyrosinu a histidinu ■ ■ difluorbenzenové deriváty - atomy fluoru na vhodně aktivovaném aromatickém jádře (např. pomocí nitroskupin) reagují substitučně s aminoskupinami - mohou ale reagovat i jiné nukleofily ■ dostupná činidla jsou 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenzen (DFDNB) nebo 4,4'-difluoro-3,3'-dinitrodifenylsulfon (DFDNPS) Heterobifunkční konjugační činidla ■ obsahují dvě různé reaktivní skupiny - spojí se s různými funkčními skupinami konjugovaných biomolekul ■ použití obvykle probíhá ve dvou nebo třech krocích - výrazně se omezuje množství oligomerních nebo polymerních produktů - činidlo je smícháno s první biomolekulou, kterou derivatizuje svou reaktivnější skupinou - nadbytek činidla je odstraněn (dialýza, gelová filtrace) - druhá reaktivní skupina je obvykle stabilnější a následně reaguje s druhou biomolekulou ■ variabilita reaktivních skupin - lze lépe vybrat cílové místo - menší narušení důležitých aktivních míst (epitop antigénu, vazebné místo protilátky, aktivní místo enzymu ...) ■ důležitá je i spojovací můstková část - linker - může být samozřejmě pasivní - může být cílem dalších reakcí, zejména se jedná o rozštěpení - význam pro zachování bioaktivity konjugátu má délka a polarita linkeru Spojení -SH a -NH2 ■ nejčastější vzhledem k běžné dostupnosti cílových skupin v bílkovinách ■ pro aminoskupinu je v činidle nejčastěji přítomna NHS skupina v kombinaci s několika možnostmi pro SH skupiny ■ N-sukcinimidyl-3-(2-pyridylditio)propionát (SPDP) poskytuje amidovou vazbu s biomolekulou nesoucí -NH2 a disulfidovou vazbu s biomolekulou nesoucí -SH: ■ pro SPDP je z = 0,68 nm ■ s delším řetězcem (z = 1,12 nm) pod názvem LC-SPDP (long-chain) ■ rozpustnější se sulfonovanou NHS skupinou - Sulfo-LC-SPDP sukcinimidyloxykarbonyl-a-methyl-a-(2-pyridyldithio)toluen (SMPT) - můstek tvořený benzenovým jádrem a methylovou skupinou chránící disulfidovou skupinu (sterická zábrana ataku) zlepšuje trvanlivost konjugátů - analog Sulfo-LC-SMPT - spojení biomolekul lze rozebrat v místě -S-S- vazby redukcí (např. DTT) „nerozebíratelné" spoje používají pro SH skupinu maleimidovou nebo jodacetátovou reaktivní část - sukcinimidyl-4-(N-maleiimidomethyl)cyklohexan-karboxylát (SMCC) z = 1,16 nm) n—O /-y n—ä H „^J^MCc" r-nh, r'—sh h r-n nhs O - další alternativní činidla: m-maleimidobenzoyl-N-hydroxysukcinimidoester (MBS, 0,99 nm), sukcinimidyl-4-(p-maleimidofenyl)butyrát (SMPB, 1,45 nm) a N-(Y-maleimidobutyryloxy)-sukcinimidester (GMBS, 1,02 nm) ■ N-sukcinimidyl(4-jodoacetyl)-aminobenzoátem (SIAB, 1,06 nm) ■ alternativní činidla - sukcinimidyl-6-[(jodoacetyl)-amino]hexanoát (SIAX) - jeho varianta s můstkem prodlouženým o aminohexanovou kyselinu, tj. sukcinimidyl-6-[6-(((jodoacetyl)amino)-hexanoyl)amino]hexanoát (SIAXX) - sukcinimidyl-4-(((jodoacetyl)amino)methyl)cyklohexan-1-karboxylát (SIAC) s analogem SIACX mají objemnější spojovací můstek ■ p-nitrofenyljodo-acetát (NPIA) vůči -NH2 reaguje podobně jako NHS, vzniká také amidová vazba - výhodou může být krátké spojení mezi biomolekulami R-nh, R'" sh npia * h" nitrofenol Spojení >C=0 a -NH2 ■ pro konjugaci zejména sacharidů (a glykoproteinů) - oxoskupina se snadno generuje mírnou oxidací jodistanem - reaguje s ní zejména hydrazidová skupina - z druhé strany se účastní skupiny popsané již dříve • hydrazid kyseliny 4-(4-N-maleimidofenyl)-máselné (MPBH), z = 1,79 nm - je vhodné provést reakci nejprve s SH skupinou, purifikovat produkt a následně připojit aldehydovou skupinu. • rozebíratelné spojení se získá 3-(2-pyridyldithio)-propionylhydrazidem (PDPH) Amino- a fotoreaktivní konjugační činidla ■ jedna část činidel je aktivována světlem - arylazidy, fluorované aryl azidy, benzofenony, některé diazosloučeniny a diazirinové deriváty - první konjugační reakce napojí činidlo na biomolekulu (pracovat ve tmě) - odstraní se nadbytek činidla a navázaná fotoreaktivní skupina pak po osvětlení reaguje s partnerskou biomolekulou ■ N-hydroxysukcinimidyl-4-azidosalicylát (NHS-ASA, 0,80 nm) - derivatizuje aminoskupiny obvyklým způsobem - vznik amidové vazby - k dispozici jsou i varianty Sulfo-NHS-ASA a Sulfo-NHS-LC-ASA (1,8 nm) ■ fenolický hydroxyl aktivuje benzenové jádro pro značení radioaktivním jodem, to lze provést před fotoreakcí - k dispozici jsou varianty bez hydroxylu na benzenovém jádře: ■ N-hydroxysukcinimidyl-4-azidobenzoát (HSAB, 0,90 nm) ■ případně s nitroskupinou N-5-azido-2-nitrobenzoyloxysukcinimid (ANB-NOS, 0,77 nm) ■ štěpitelné konjugáty poskytuje sulfosukcinimidyl-2-(p-azidosalicylamido)ethyl-1,3'-dithiopropionát (SASD, 1,89 nm) ■ linker může být alifatický řetězec u N-sukcinimidyl-6-(4'-azido-2'-nitrofenylamino)hexanoátu (SANPAH, 1,82 nm) - nitroskupina podporuje fotoaktivaci již nad 320 nm ■ sulfosukcinimidyl-2-(7-azido-4-methylkumarin-3-acetamid)ethyl-1,3'-dithiopropionát (SAED, 2,25 nm) - vzniklý konjugát obsahuje fluoreskující uskupení - derivát kumarinu - lze tak pohodlně sledovat pohyb konjugátu - fluorescence se přitom iniciuje až po fotolytické reakci ■ podobně se chová sulfosukcinimidyl-7-azido-4-methylkumarin-3-acetát (Sulfo-SAMCA, 1,28 nm) R-H ■ alternativní fotolytickou skupinou je diazopyruvátové uskupení - poskytuje reaktivní karbenové uskupení, které se přemění Wolfovým přesmykem (W) na ketenové uspořádání - pak aduje nukleofilní skupinu - p-nitrofenyldiazopyruvát (pNPDP) ■ podobným mechanismem reaguje i p-nitrofenyl-2-diazo-3,3,3-trifluoropropionát (PNP-DPT) Sulfhydrylová a fotoreaktivní konjugační činidla ■ kombinací předchozích skupin je l-(p-azidosalicylamido)-4-(jodacetamido)butan (ASIB) a N-[4-(p-azidosalicylamido)butyl]-3'-(2'-pyridyldithio) propionamid (APDP) ■ jinou fotoaktivní část obsahuje benzofenon-4-jodacetamid - výhoda benzofenonu - možnost opakovaného průběhu fotoaktivace i po nekonjugační zpětné rekombinaci volných elektronů - vyšší výtěžky konjugace - alternativní SH-reaktivní část má benzofenon-4-maleimid Další fotokonjugace ■ s guanidinovou skupinou argininu může reagovat p-azidofenylglyoxal (APG) zbytek argininu pro napojení fotoaktivní části na aldehydovou skupinu je použitelný p-azidobenzoylhydrazid (ABH) karboxyskupina může být fotoaktivována pomocí 4-(p-azidosalicylamido) butylaminu (ASBA) - jeho volná aminoskupina se spojí s karboxylem v přítomnosti karbodiimidu, kdy vznikne amidová vazba Fluorescenční metody ■ široké použití v oblasti výzkumu i praktické aplikace ■ bioanalytické metody - klinická chemie (fluorogenní substráty při stanovení enzymů) - imunochemické metody (ELISA, FIA fluoresceční imunoanalýza) - genetické analýzy a DNA biočipy - monitorování prostředí (fluorecenční proby) ■ biomedicína - identifikaci a separace buněk v průtokové cytometrii - zobrazení buněčných komponent ve fluorescenční mikroskopii a analýze obrazu - konformace a dynamika buněčných systémů Fluorescence intenzita /, zdroj světla fluorescence (kolmo na excitační paprsek) detektor If = kQscl fluorescence = fotoluminiscence, emise světelného kvanta při návratu l0 » lf elektronu z vyšší energetické hladiny, kam byl vybuzen fotoexcitací fluorescence F se udává při určité vlnové délce - emisní x excitační spektra - relativní vyjádření, alternativně jako intenzita světelného toku na jednotkovou plochu ("count") další charakteristiky: kvantový výtěžek 0, střední doba života r, polarizace P (směr kmitání el. vektoru emg. vlny) fluorescence prakticky ihned (KHs) po skončení excitace ustane fosforescence trvá delší dobu, při excitaci vzniká metastabilní stav energetické přechody - Jablonského diagram: (vznik a zánik excitovaných stavů) Fluorescence 5„ S„... energetické hladiny fluoreSCence fosforescence T~ -10-15 g 10-ss 10-3-1 s neradiační přechody ý vibrační hladiny Kashovo pravidlo: - před emisí dochází k relaxaci vibrační energie a vnitřní konverzi, takže fluorescenční přechod nastává z nejnižší vibrační hladiny prvního excitovaného stavu S1 Vavilovův zákon: - kvantový výtěžek a doba trvání excitovaného stavu složitých molekul v roztoku nezávisí na vlnové délce budícího záření - obecná vlastnost fluorescence: emisní spektra jsou nezávislá na vlnové délce excitace Zcadlová symetrie mezi absorpčním a fluorescenčním pásem: - absorpce i emise z odpovídajících si vibračních hladin mají stejnou relativní pravděpodobnost. Většina absorbujících i emitujících molekul se nachází v rovnovážném vibračním stavu, přičemž vibrační struktura základního i excitovaného stavu mají stejnou strukturu - po absorpci přechází elektron z rovnovážné vibrační hladiny stavu S0 na vyšší vibrační hladinu stavu Sv poté dochází k rychlé relaxaci na stavu S1 (v čase 1012-1013 s) a teprve poté následuje zářivý přechod na vyšší vibrační hladinu stavu S0 a další vibrační relaxace na rovnovážnou vibrační hladinu stavu S0 - výjimky jsou důsledkem rozdílného geometrického uspořádání atomových jader v excitovaném a základním stavu Stokesův posuv - rozdíl v energiích mezi maximy absorpčního a emisního pásu Sledování a měření fluorescence spektrofluorimetry - měří střední signál celého vzorku v kyvetě nebo v jamce mikrodestičky fluorescenční mikroskopy - umožňují pozorovat fluorescenci dvojného trojrozměrných mikroskopických objektů fluorescenční skenery (i "čtečky" mikrodestiček) - měří fluorescenci 2D makroskopických objektů (elektroforetické gely, bloty, chromatogramy) průtokové cytometry - měří fluorescenci velkého množství jednotlivých buněk a umožňují identifikaci a separaci jejich subpopulací měření relaxačních časů (pulzní, nebo fázový posun - frekvenčně modulované světlo) fluorescenční korelační spektroskopie (FCS) - fluktuace intenzity F v mikroobjemu (10151) určeném fokusovaným laserovým excitačním paprskem - rychle difundující fluorofory - fluktuace fluorescence (nedochází ke zprůměrování), její časová závislost se analyzuje pomocí autokorelační funkce (informace o kinetice, difúzi, koncentraci molekul ve vzorku) Rozdělení fluoroforů vlastní (vnitřní, intrinsic) - přirozený výskyt - proteiny (Trp, Tyr, Phe), NADH, FAD, FMN, chorofyl - fykobiliproteiny, green fluorescent protein (GFP) nevlastní (vnější, extrinsic) - přidávají se ke vzorkům, které samy nemají fluorescenční vlastnosti fluorescečni značky (váží se kovalentně) fluoresceční sondy (váží se nekovalentně) - fluorofory, jejichž kvantový výtěžek, případně i spektrální vlastnosti se výrazně mění po navázání na bílkoviny, nukleové kyseliny, membrány aj. - studium změn konformace, membránového potenciálu, polarity a viskozity prostředí fluorescenční indikátory (chemické sondy) - spektrální vlastnosti nebo intenzita fluorescence jsou citlivé na přítomnost dalších látek - zjištění koncentrace Fluoresceční značky klasické: organická barviva, fluorescentní bílkoviny, cheláty lanthanidů - dobře rozpustné ve vodě, snadné použití, mnoho existujících protokolů a aktivovaných forem - ale široké spektrální pásy, náchylné na fotorozklad moderní - polovodičové kvantové tečky, anorganické nanočástice dopované lanthanidy, nanočástice latexu a kremičitanu s navázanými fluorofory - díky pokroku v oblasti materiálových věd Fluorescein nejčastěji používaný fluorofor - výhody: vysoká absorbce, velké 0, nízká cena - exc. lze při 488 nm Ar laserem (kofokál. mikrosk., cytometrie) fluorescein-5-isothiokyanát - FITC, 494/520, s-NH2 skupinou dává thiomočovinové uskupení výhodnější je NHS-fluorescein - reaguje rychleji, stabilnější produkt na -SH skupiny: 5-jodoacetamidofluorescein (5-IAF) a fluorescein-5-maleimid na aldehydové či oxoskupiny: - fluorescein-5-thiosemikarbazid, dá hydrazonovou vazbu - použitelný např. pro značení cytosinův DNA či RNA po jejich aktivaci hydrogensiřičitanem na sacharidové zbytky: NHS-fluorescein - fluorescein-dichlorotriazin (DTAF), i na jiné biomolekul s volnými alifatickými hydroxyly, také na tubulin Problémy s fluoresceinem ■ náchylný na fotorozklad - signál vydrží pouze pár minut ■ pH závislost fluorescence - výrazně klesá signál pro pH pod 7 ■ existence isomerů - může komplikovat geometrii vazby k proteinům, následně eluční časy v chromatografii, migraci v gelech ■ méně vhodný pro "ultracitlivé" aplikace Rhodaminy 1 U r c: o O sulforhodamin 101 I II (Texas Red) 1^ SO,-Cŕc' u tetramethylrhodamin (TMR) rh ódami n B sos- r I U H2N. O O I 9 Ó k rh ódami n 6G rhodamin 110 TRITC y/N ■ strukturně podobné fluoresceinu, který doplňují - místo atomů kyslíku jsou na postranní cykly vázány dusíkové atomy - mohou nést různé substituenty a tím je dostupná široká škála variant ■ emise probíhá při delších vlnových délkách ve srovnání s fluoresceinem - použitelné pro techniky s dvojím značením - vyšší fotostabilita a dobrá excitovatelnost světlem rtuťových výbojek ■ sulforhodamin B, jinak Lissamin rhodamin B - obsahuje na dolním aromatickém jádře dvě sulfoskupiny v polohách 3 (vpravo nahoře) a 5 (dole) (Imperiál Chemical Industries) ■ sulforhodamin 101, Texas Red (Molecular Probes) - emitující nad 600 nm ■ tetramethylrhodamin-5-isothiokyanát (TRITC) resp. (TMR) - od tetramethylrhodaminu, nej běžnější značkovací činidlo z této skupiny, (544/570), £544 = 105 Mcm-1 - reakce s aminoskupinou probíhá analogicky jako u FITC - karboxytetramethylrhodamin (TAMRA) další alternativa ■ NHS-rhodamin (5-karboxymethylrhodamin sukcinimidylester) (544 / 576) ■ karboxy-X-rhodamin (ROX) - značení oligonukleotidů, sekvenování ■ Lissamin Rhodamin B sulfonylchlorid (556 / 576) - má v 5-pozici reaktivní skupinu -S02CI - s -NH2 vzniká sulfonamid - podobně existuje sulfonylchlorid i od Texas Red derivátu ■ na derivatizaci SH: tetramethylrhodamin-5-jodacetamid (540 / 567) ■ pro reakci s aldehydy Lissamin rhodamin B sulfonylhydrazin - má v 5 poloze skupinu -S02-NH-NH2) (560 / 585) - sulfonylhydrazin Texas Red emituje při delší vlnové délce (580 / 604) Rhodaminy- zhodnocení -j fluorescence v červené oblasti ■ vyšší stabilita než fluorescein ■ excitovat (při 520 nm) lze rtuťovou výbojkou so3h S03h so3h S03h h2i\l Jv-cooh 1 T y Alexa 488 Alexa 532 cooh cooh Alexa Fluor rhodaminový nebo kumarinový skelet doplněný o sulfoskupiny vyšší rozpustnost celá odstupňovaná řadu sloučenin s posunujícími se exc. a emis. maximy napojení na značené biomolekuly probíhá v dolní části molekuly přes karboxyl v poloze 5 aktivovaný např. NHS skupinou - jsou přítomny i isomery se skupinou posunutou do polohy 6 550 600 650 Wavelength (nmj 1. Alexa Fluor 405 - 2. Alexa Fluor 350- 3. Alexa Fluor 500 4. Alexa Fluor 408 - 5. Alexa Fluor 430 6. Alexa Fluor 514 ■ 7. Alexa Fluor 532 8. Alexa Fluor 555 -0. Alexa Fluor 546 10. Alexa Fluor 565 - 11. Alexa Fluor 594- 12. Alexa FluorSlO- 13. Alexa Fluor 633 14. Alexa Fluor 635 - 15. Alexa Fluorite-Alexa Fluor 660 ■ 17. Alexa Fluor 660 - 18. Alexa Fluor 700-ia. Alexa Fluor 750- imunolokalizace ribulosabisfosfát karboxylasy v 2.0 um řezu listu kukuřice (C4, separovány fotosynt. složky mezi mezofil a svazky cévní) - anti rubisco Ab, Alexa Fluor 488 kozí Ab anti králičí IgG - autofluorescence chlorofylu (červeně, v mezofylových plastidech) - lignin (matně zelený) v xylemu svazků - kutin (jasně zelený) v kutikule vně epidermis periferní neurosystém embrya Drosophily: - mAb 22c10 anti mikrotubuly, Alexa Fluor 488 králičí Ab anti-myší IgG - dělící se buňky - Ab anti histon-H3, Alexa Fluor 594 kozí Ab anti králičí IgG - jádra DAPI (modrá fluorescence) Kumariny kumarin = 2H-1-benzopyran-2-on je přírodní látka 7-amino-4-methylkumarinové deriváty, zejména 7-amino-4-methylkumarin-3-octová kyselina (AMCA) (345 / 450) - pro-NH2 AMCA-NHS - pro-SH AMCA-HPDP - pro aldehydy AMCA-hydrazid 7-diethylamino-3-[(4'-(jodacetyl)amino)-fenyl]--4-methylkumarin (DCIA) - velmi intenzívní fluorescence (382 / 472) - na světle nestabilní 4,4-difluoro-4-bor-3a,4a-diaza-s-indacen - nemá ionizovatelné skupiny - málo ovlivněn pH - vysoké absorbance a vysoké kvantové výtěžky fluorescence - menší komplikací jsou malé Stokesovy posuny pod 20 nm modifikace v krajních polohách postranních cyklopentadienů - deriváty s posunutými spektrálními charakteristikami - pro -NH2 existuje BODIPY FL C3 SE s postranní NHS skupinou (502 / 510) - komplikací je vzájemné zhášení, pokud je stupeň substituce vyšší - dostupné deriváty s jodacetamidovou a hydrazidovou skupinou deriváty BODIPY 530/550 C3-X - maxima k vyšším vlnovým délkám - přítomnosti objemných aromatických postranních substituentů - reaktivní skupinou X může být NHS nebo hydrazid bromderivát Br BODIPYpro substituce sulfhydrylových skupin Cascade blue od sulfonovaného pyranu - vlastnostmi vhodně doplňuje fluorescein při multiznačení - výborná rozpustnost ve vodě - dobré kvantové výtěžky (kolem 50%) - malá úroveň vzájemného zhášení při vyšších substitučních poměrech - mateřská sloučenina má na horním jádře vpravo pouze methoxyskupinu. pro značení aminoskupin - acetylazidový derivát (375+400 / 410) - při vyšších teplotách - kolem 80 °C v DMF probíhá přesmyk azidového uskupení na isokyanátovou formu a odštěpí se molekula dusíku - isokyanát reaguje s volnými hydroxyly, vzniká urethanové uskupení - další formy mají v postranní části hydrazinový, ethylendiaminový nebo kadaverinový (pentamethylendiaminový) zbytek Lucifer yellow ■ základní sloučeninu z = H ■ deriváty 4-aminonaftalimid--3,6 disulfonátu ■ napojení se realizuje přes horní imidový atom dusíku - jodacetamidový derivát (na -SH) - hydrazidová skupina (Lucifer Yellow CH, na aldehydy) - optické parametry (427 / 530) ■ především v cytochemii Cyaninové fluorofory ■ velmi populární zejména v oblasti DNA biočipů využívajících cDNA fragmenty jako imobilizované próby ■ základem je indokarbocyaninový skelet - je sulfonován, obě aromatické části jsou spojeny uhlíkatým můstkem s konjugovaným systémem dvojných vazeb (methin) ■ je k dispozici odstupňovaná řada fluoroforů (Amersham Biosci.) s,S03H HS03^, . /SO-H jí J I ^\^K JI z K vzorek - Cy5 kontrola Cy3 překryvový signál (oba kanály) Cyaniny - zhodnocení ■ délka polyenového spojovacího řetězce - monomethinové sloučeniny -thiazol orange (TO), oxazolle yellow (YO) nebo jejich dimery (TOTO, YOYO) - fluoreskují po vazbě na nukleové kyseliny (fluorescenční sondy) - polymethinové sloučeniny - Cy3, Cy5, ... - délka spoj. řetězce, resp. počet vinylenových -CH=CH- skupin působí bathochromní posun o cca 100 nm -fluorofory emitující až v NIR oblasti ■ výhody NIR fluorescence - není zde už autofluorescence biologických složek - vyšší citlivosti - méně nákladná instrumentace, excitace při delších vlnových délkách ■ problémy - úzké excitační pásy, fotorozklad, menší intenzita v NIR Atto vysoká absorbce a výtěžek, fotostabilita modifikace oligonukleotidů několik typů struktur na bázi kumarinu, rhodaminu,... (Atto-Tec) Fluorescent Dye Absorption max. [nm] Emission max. [nm] Extinction coefficient [cm_1M"1] 479 24.000 484 45.000 Atto 465 453 508 75.000 Atto 495 495 527 80.000 Atto 488 501 523 90.000 Atto 520 516 538 110.000 Atto 532 532 554 115.000 Atto 550 554 579 120.000 Atto 565 563 592 120.000 594 624 120.000 Atto 594 Atto 620 601 627 120.000 619 643 120.000 629 657 130.000 Atto 647N 644 669 150.000 Atto 655 663 684 125.000 Trojnásobné značení endotheliálních buněk (HUVAC): von Willebrand faktor - Atto 550 znač. Ab (zelené), kadherin - Atto 655 zanč. Ab (červeně) a jádra DAPI (modře) Fluorogenní substráty hydrolas OH 1 OH 1 0=P-0. / I ^ví^ ^ .o-p=o 1 \^ OH '/|<:-o T ' OH FDP ^O deriváty resorufinu deriváty fluoresceinu, např. fluoresceindifosfát pro ALP h Z"R_N\rí^\t/°\ h d BZAR [T 1 — rhodamin 110, bis-(Af-CBZ-L-argininamid) (BZAR), pro serinové proteinasy, (496 / 520) cca 100x citlivější než sloučeniny založené na AMC jiný příklad - rhodamin 110, bis-(A/-CBZ-L-fenylalanyl-L-arginin amid) (Z-FR-R110) pro cysteinové proteinasy katepsin B a L Fluorogenní enzymové substráty o II w H20 OH II — ií Y - H3P04 K ÁJ MUP i CH3 T CH3 4-methylumbelliferylfosfát (MUP), po hydrolyse fosfatasou vzniká 4-methyl-7-hydroxykumarin (methylumbelliferol), modrá fluorescence, (360 / 450) deriváty 7-amino-4-methylumbelliferolu (Z-X-AMC nebo Z-X-MCA), AMC produkt (342 / 441), např. 7-amino-4-methylkumarin Ar-CBZ-L-fenylalanyl-L-argininamid (Z-FR-AMC) pro stanovení serinových proteinas a plasminu, kalikreinu, katepsinu), nebo 7-amino-4-methylkumarin, Ar-CBZ-L-aspartyl-L-glutamyl-L-valyl-L-asparagylamid (Z-DEVD-AMC) pro kaspasu 3 alternativně deriváty 7-amino-4-trifluoromethylkumarinu, např. Z-DEVD-AFC W-CBZ-je W-benzyloxykarbonyl- Lanthanidové komplexy Eu3+ a Sm3+ ve formě chelátových komplexů - atraktivní fluorescenční značky vhodné pro časově rozlišenou fluorescenci („time-resolved fluorescence", TRF) pro "přichycení"k biomolekulám slouží N1-(p-isothiokyanatobenzyl)- diethylen-triamin-N1,N2,N3,N3-tetraoctová kyselina (DTTA) která se může vázat na aminoskupiny za vzniku thiomočovinového uskupení. takto připravené komplexotvorné místo pak váže iont lanthanidu a získá se intenzivně fluoreskující značka s relativně dlouhou dobou záření po excitaci - při pulzní excitaci se vyčká, až vymizí či vyhasne nespecifická fluorescence pozadí, případně rozptýlené záření, a až pak se po krátké prodlevě změří fluorescence značky - lze použít i další lanthanidy, např. terbium a dysprosium - proces pod názvem DELFIA zavedla finská firma Wallac Oy Další chelátové struktury ■ kryptát terpyridin chelát s anténou O 400 800 1000 Time Gis) Kvantové tečky ■ moderní fluoreskující polovodičové nanokrystaly ■ QD, "quantum dots" jsou menší než 10 nm a svým kvantovým chováním se nachází mezi polovodiči a izolovanými atomy ■ polovodiče - valenční a vodivostní energ. hladiny odděleny o £g - excitace - elektron přejde do vodivostní hladiny a zanechá za sebou kladně nabitou díru ve valenční hladině - prostorová separace tohoto páru ("exciton") odpovídá Bohrovu průměru a je typicky 1 až 10 nm ■ QD mají obdobnou velikost - excitony jsou v nich ohraničeny podobně jako chování částice v uzavřeném prostoru - energetické hladiny připomínají atomy či molekuly - optické vlastnosti závisí na velikosti Fotoluminiscence u QD ■ vzniká radiační rekombinací excitonů, spektrální vlastnosti jsou „laditelné" změnou velikosti částic - např. u CdSe nanokrystalů lze emisi nastavit od 450 do 650 nm - menší QD jsou „modřejší" (hypsochromní efekt) ■ výhody nanoteček oproti klasickým fluoroforům zahrnují - vysoký jas (20x vyšší proti jiným typům, daný velkým kvantovým výtěžkem a vysokým extinkčním koeficientem) - úzké emisní pásy pod 30 nm, velké Stokesovy posuny - částice obsahujících různě barevné QD v různých poměrech, čímž vzniká chemický „čárový kód" umožňující identifikaci v komplexních směsích - velmi stabilní a nepodléhají fotodegradaci (často se chrání proti fotooxidaci pláštěm z polymerů nebo jiných polovodičů (např. CdSe povlečený ZnS nebo silikátem) - široké absorbční pásy - různě barevné QD lze excitovat stejným zdrojem světla a jednoduše tak vyhodnocovat současně různé značení odlišnými barvami při multiplexních stanoveních ■ pro konjugaci s biomolekulami se nanáší reaktivní vrstvy jako tri-n-oktylfosfinoxid (TOPO) nebo hexadecylamin Kvantové tečky (QD) Quantum dat synthesis unikátní fluorescenční vlastnosti - stabilita vůči fotorozkladu, velké Stokesovy posuny CdTe jádro obalené CdS, rozpustnost díky vazbě thioglykolové kys. (TGA) prekurzory - Te, CdCI2, TGA a NaBH4 - NaHTe připraven redukcí Te pomocí NaHB4 atmosféře - refluxace na vzduchu (minuty až hodiny) při zahřívání roste průměr QD, emisní maximum se posouvá k delším vln. délkám větší QD mají lepší stabilitu Nanočástice s fluorofory ' optické kódování na základě multiplexování vln. délek ' polymer, uvnitř směsi různě fluoreskujících QD - charakt. spektrum ' možnost identifikace cílových biomolekul ve směsích při užití kombinatorických postupů a e B C ve c-►§_ c □ 1:1:1 2 1 1 3:0:3 5:3:2 ■ - 10 5 3 Wavelength Fykobiliproteiny ■ intenzivně fluoreskující proteiny z fotosyntetického aparátu eukaryot, modrozelených a červených sinic, řas a cyanobakterií ■ nativní nefluoreskují, ale excitační energii předávají na chlorofyly ■ purifikované fluoreskují s výtěžky kolem 100% - obsahují několik bilinových chromoforů (např. B-fykoerithrin 34) - to v souhrnu poskytuje vysoké extinkční koeficienty pro celou molekulu - fluorescenční výtěžky se blíží 30 fluoresceinům nebo 100 rhodaminům - fluorescence není externě zhášená - dostupnost mnoha konjugačních míst - v prodeji jako konjugáty se streptavidinem nebo biotinem Název Zdroj Složení Mr Počet ^ex/^em E (10" NT1 (kDa) bilinů (nm) cm"1) B-fykoerythrin Porphyridium cruentum (o0)eY 240 34 546 / 575 2,4 R-fykoerythrin Gastroclonium coulteri (o0)eY 240 34 566 / 574 2,0 C-fykocyanin Anabaeba variabilis (00)2 72 4 614/643 0,58 allofykocyanin Anabaeba variabilis (00)3 110 6 650 / 660 0,70 CryptoFluor Crimson cryptomonad algae 40,2 585 / 658 CryptoFluorGold cryptomonad algae 30,8 566 / 600 Zelený fluoresceční protein ■ "green fluorescent protein", GFP - z bioluminiscentní medúzky (Aequrea victoria, jellyfish), 26 kDa ■ chromofor - p-hydroxybenzyliden-imidazolidinon, vniká cyklizací a oxidací aa zbytků Ser-Tyr-Gly: ■ mutagenezí získány vylepšené varianty - široké použití pro značení - divoký typ, směs fenolu a fenolátu - fenolátový anion - fenol - fenolátový anion s přidruženým pí-elektronovým systémem - indol (Trp místo Tyr) - imidazol (His místo Tyr) - fenyl (Phe místo Tyr) Použití GFP ■ biologická značka pro sledování a kvantifikaci exprimovaných bílkovin ■ studium protein-protein interakcí ■ interní buněčný "biosensor" pro sledování signálů ■ rekombinantní techniky - spojení GFP se sekvencí jiné bílkoviny - chiméry - sledování lokalizace a pohybu bílkovin v buňkách ■ zelené myši a podobné ... Fluorescenční polarizace (FP) založena na velikosti rotačního pohybu molekul v protikladu jsou doba života rfl a rychlost pohybu 0rot fluoroforu excitace se provádí polarizovaným světlem, tj. excitují se-pouze- Tfi«e fluorofory vhodně orientované vůči rovině světla pokud bude životnost exc. stavu mnohem kratší, než rotace, tak si excitované mo le- _ r*~rm kuly zachovají orientaci CrC& °3o a bude emitováno x> polarizované záření ^^•^P»x0 pokud bude životnost exc. stavu dlouhá, poruší se orientace molekul a nastane de polarizace f OCCR % Tn»ero, \ polarizované depolarizované emitované záření FP a mobilita molekul FP v nepřítomnosti rotační difuse 9 rjV _ T]Mr (_ kT ~ RT (v+h) alternativní vyjádření rotace pomocí viskosity a molekulárního objemu V, lze dále zavést molekulovou hmotnost spec. objem bílkoviny v a hydrataci h (typ. 0.2 g vody na 1 g proteinu) v praxi jsou díky hydrataci a nesférickému tvaru korelační časy 0 asi 2x větší než odvozené pro kouli v suchém stavu (např. HSA, M= 65 kDa, A)=1,9 vychází 0 kolem 50 ns) Polarizátor světlo po průchodu polarizátorem osciluje pouze v jedné rovině dichroické systémy - adsorbují jednu z obou rovin polarizace (film z orientovaného PVA dopovaná jódem), málo efektivní v UV oblasti krystaly kalcitu vykazující dvojitou refrakci - rozptylují různě obě roviny polarizace (Nicol a Glan polarizátory, Wollastonův hranol) Měření FP zdroj světla ■ změří se horizontální a vertikální složky emitovaného záření ■ polarizace se vypočte podle vztahu: bývá od -0.25 po 0.5 ■ alternativně se používá anisotropie r. polurľzíríory detektor ■ obě veličiny jsou zaměnitelné (vnitřně souvisí): P = 2r 2 + r ■ jako tracer fungují konjugáty malých molekul (peptidy, léčiva, pesticidy,...), které jsou pomocí vhodného můstku (linker) spojeny s fluoroforem (fluorescein, rhodamin) FRET Förster energy resonance transfer přenos energie zářivými nebo nezářivými mechanismy mezi dvěma chromofory - zářivý (triviální) přenos - excitovaná molekula donoru emituje záření, které je absorbováno molekulou akceptoru - nezářivý přenos energie (FRET) - ve směsi molekul dochází k absorpci pouze molekulami donoru, avšak konečným výsledkem je excitovaná molekula akceptoru (chromofor, budící záření sám neabsorbuje) - nedochází k emisi světla donorem absorbce donoru neradiační přechody ý ......► rezonanční přenos emise akceptoru donor akceptor Ä Distance and Energy Transfer Efficiency , Fůrattť Distance R. 2 4 « t Distance jr. In Nanometers) Efektivita FRET dána poměrem vzdálenosti r mezi D a A a Forsterova poloměru r0, nebo alternativně poměry doby t nebo intenzity F fluorescence donoru bez (t, F) a v přítomnosti (t' ,F) akceptoru, závisí dále na: - vzdálenosti mezi donorem a akceptorem - speltrální překryv emisního pásu donoru a absobčního pásu akceptoru - vzájemné relativní orientaci dipólů donoru a akceptoru ■ pravděpodobnost rezonančního přenosu energie určuje kt - určující složkou je dipól-dipólový přenos energie - Forsterův vzorec (v případě slabé vazby, kdy vzájemné interakce donoru a akceptoru neovlivní optická spektra) - rD - doba dohasínaní fluorescence donoru, r0 - vzdálenost, ve které je pravděpodobnost přenosu energie rovna pravděpodobnosti vnitřní deaktivace vzbuzeného stavu molekuly, rDA - vzdálenost mezi donorem a akceptorem d \ 'daJ FRET uspořádání Tt excitace donor - fluorescenční skupina (fluorofor) akceptor - zhášející skupina (quencher) hydrolysa vhodné skupiny ve spojovacím můstku I I nezářivý přenos energie na blízkou skupinu akceptoru I ZADNA FLUORESCENCE \ 7 oddálení - není přenos energie NASTUP FLUORESCENCE "molecular beacon" komplementární DNA (target) FRET - vhodné skupiny Vícenásobné značení - detekce mutací Targets WT-C MUT-G MUT-A FAM (G) LI MUT-T AL350 (T) TMR (C) CY5 (A) 12 FISH fluorescence in situ hybridization mRNA largel ■ dual molecular beacon - vyšší specifita - obě proby musí hybridizovat s cílovými místy, technika "adjacent probes" Real time PCR ■ zviditelnění průběhu pomocí MB - 95 °C denaturace - 65 °C annealing, přisednutí primerů a MB = fluorescence - 72 °C prodloužení vláken wvers* primer 5_a-forward primer 51_ j molecular beacon V.V I Initiation | 5' —._._________3" I 1 2000 m 5 c S jn 1000 ä E 0 1,000,000 1oa.ooo / 10.000 / / 1000 / / 100 ___^JJ^J-J/-___mrasiMíd 5' '---1 1 H 1 y £5" G ^ N Repaatad g ULIJ- J J 1 1 LI J U*- fl (rnmitof fl uorescence) 1 / 31 ......._.......................... 5 / ...... 72C l....................................... 1 2N -'" 10 20 30 40 50 60 Thermal Cycles FRET: in vivo interakce biomolekul FRET: in vivo interakce biomolekul interakce ligand a receptor_fúze liposomů FRET imaging v mikroskopii Acceptor Emission lokalizace a vzdálenosti biomolekul v buňce Fluorescence TuncitM POSOrUlIlCO tlilcgcn Energy Transfer Limphau** Micro« co» Con fig u ration Are-Diuhugč Cütled i. ■ 1lil CCO Ci'IINľil •4 NlůHůw Cůflfůí H TImub Cutlur« Gene-PIN CCGCT T A A 0 GACGTAGGCGATCTAAT C tA -CTGCATCCGCTAGATTAG C G C-G C G C-G ig ■ oligonukleotid - "inteligentní" DNA próba obsahující sekvenci komplementární k cílové sekvenci v analyzovaném vzorku ■ na jednom konci má řadu G, na druhém konci řadu C a navíc skupinu fluoroforu ■ v roztoku tedy vytvoří vlásenkovou strukturu, v níž se fluorofor přiblíží ke guaninovým zbytkům, které fungují jako zhášeč -j v přítomnosti cílové sekvence se vlásenka otevře a objeví se fluorescence ■ výhody: jednoduchost, rychlost, citlivost (107 až 1012 M) Elektrochemiluminescence (ECL) ■ chemiluminescence jako výsledek elektrochemické reakce, ze stabilního prekurzoru na povrchu elektrody vytvořen vysoce reaktivní prvek, který reaguje za tvorby světelného záblesku ■ chemiluminiscentní reakce, která vede k emisi fotonu z rutheniového komplexu, je iniciována elektricky, spíše než chemicky ■ realizace ECL na povrchu elektrody umožňuje přesnou prostorovou kontrolu procesu, včetně zapnutí a vypnutí (ON / OFF), PMT detektor je prostorově velmi blízko ■ hlavní výsledek je intenzita světelného toku, podružnou informací je závislost proudové odezvy elektrody ■ vhodné i pro velmi nestabilní látky (generování in situ) ■ možnost recyklování - zesilovací účinek ■ ECL lze provést i s luminolem ■ komplexy ruthenia s bipyridinem, [Ru(bpy)3]2+ ■ technologie se využívá v imunoanalyzátorech firmy Roche Systém Bioveris I 620 nm Luminiscence emise světla Chemi-předání chem. energie 6" Electrode 6- ... iniciace Elektro- elektrochemická Bu(bpy)3!+(1) = BV-TAG™ TPA = Tri pro py la m i ne ruthenium a TPA jsou oxidovány po aplikaci napětí na elektrodu radikál TPA + ztrácí proton, redukuje Ru3+ na Ru2+, které z excitovaného stavu přechází do základního za vyzáření fotonu Ru se nespotřebovává - recykluje se - zesilovací mechanismus - zvýšení citlivosti stanovení BioVeris tag stabilní neizotopická značka různé formy pro biomolekuly: - BV-Tag-NHS-ester - BV-Tag-fosforamid - BV-Tag-maleimid - BV-Tag-hydrazid - BV-Tag-amin aminy (bílkoviny) fosfoskupiny (nukleové kyseliny) thioly sacharidy karboxyly podobný je systém ELECSYS obvykle kombinováno se záchytem pomocí magnetického nosiče Biotin a (strept)avidin široce používáno pro přípravu konjugátů, značení a imobilizace - 1927 - objeveno, že krysy krmené bílkem dostanou dermatitídu - 1940 tu odstraní vitamin H - 1941 efekt přiřazen avidinu a objevena vysoká afinita avidinu k biotinu - 1976 praktické využití interakce pro značení - Wilchek Biotin / avidin ■ velmi pevná interakce, KD = 1.3 x 1015 M ■ odolnost komplexu - stabilní v 8 M guanidinu při pH 5, disociuje až při pH sníženém na 1.5 ■ biotin, vitamin B7, vitamin H ■ avidin - tetramer (4 x 16.4 = 58 kDa) - každá podjednotka má vazebné místo pro biotin - glykoprotein, pl 9.5, izoluje se z vaječného bílku ■ streptavidin - obdobný (tetramer 4x15 kDa), ale strukturně i co do aa složení odlišný od avidinu - pl 5-6 - menší celkový náboj - méně nespecifických interakcí - ze Streptomyces avidinii - výhodou mnohem menší nespecifické interakce ■ neutravidin - deglykosylovaná forma avidinu (nevadí lektiny), pl 6.3 Reverzibilita komplexu Mze přerušit 1 nelze přerušit interakce mezi biotinem a avidinem za normálních podmínek nelze přerušit imobilizace různých biotinvlovanvch biomolekul na avidinovaný povrch nitroavidin - připraví se nitrací tyrosinových zbytků v avidinu (volný nebo imobilizovaný) pomocí tetranitromethanu interakci mezi biotinem a nitroavidinem lze narušit nadbytkem biotinu nebo při pH 10 Biotinylace - lysin, ev. jiné -NH2 Biotinylace -SH r-sh Biotinylace sacharidů biocytin-hydrazid po oxidaci jodistanem na aldehyd s CDI účinkuje i na Asp a Glu ® r3JH avidin (b) a B J Modifikace genetické manipulace - mutace Y33H - pH-nastavitelná vazba biotinu - monovalentní protein (N23A, S27D, S45A) - odstranění crosslink-interakcí cílená kovalentní vazba polymerů reagujících na stimuly - "molecularswitches" - reakce na podněty - teplota, pH, světlo,... změnou konformace - "smart polymers" fúzní chimérické proteiny - dvojí afinita - "single-chain" Change in pHr light or temperature Stimuli-rescnsive itreptavidin conjugate i i-+ B, B ' B Change in pH, ů( ^ _ light or R/^Yv temperature nÍL-^JL' Existující a budoucí možnosti -Combining other functions to changed binding activities -Novel binding fpecificitie* ~Catalytlcally active Stngptavidin -More stable avidin -Recombinant protein |■ ■.jrrii'■ ■:.■ I ii-■ -Specific immobilization ■y tr 'Targeted gene therapy -Enhanced binding activities Chimeric proteins -enhanced scaffolds^ for nanotechnology ^ f E* -Dual-affinity avid Ens Cine u Early permuted proteins Directed /random mutagenesis ■ Faster biotin-binding kinetics -Increased affinity towards libelled biotin -Specific binding of multiple (up to TpurJ ligands into one (strept)avldln molecule "Scaffold structures for nanotechnology -Screening residues important for property engineered In uch case A'C^ri? Brök* -Combining other functions to biotin binding, like epitope recognition and enzymatic activities -Probe and enzyme immobilization -Identification of structurally important residues -Affinity maturation for a peptide llgand (Streptag and streptauidirt) -Optimization of properties: acquired by other method* -Affinity maturation for olhnr type of new ligends like small molecules, peptides and nucleic adas -Incorporation of fluorescent amino acid in the streptavidin polypeptide ■Immobilisation & labelling methods -Modulation of binding affinity -Control of aligomerisaiion and stability -Modification of physlcochemleal properties Radioaktivní značení ■ sledování radioaktivně označené bílkoviny, nukleové kyseliny, substrátu nebo produktu enzymové reakce ■ používané sloučeniny: - jednoduché - 14C02,3H20,35S042- - uniformě značené - [14C] alanin, [14C] ethanol - specificky značené L-[methyl-14C] methionin, [methyl-3H] thymin ■ jednotky: Bequerel ~ s_1 (dle SI), Curie ~ 1 g 226Ra, (|jCi - mCi v praxi) ■ detektory - ionizační (Geiger-Mullerova trubice) -scintilační - polovodičové skenery - fotografický materiál ■ separace rad. produktu - precipitací, extrakce - vývoj nebo inkorporace rad. plynu nebo těkavé látky - elektroforesa, papírová nebo tenkovrstevná chromatografie ■ výhody: přesnost, chemická identita, měření radioaktivity nezávisí na formě a podmínkách ■ problémy: nákladné vybavení i reagencie, pracovní rizika Radioaktivní značení vysoce citlivé z hlediska detekce komplikací je striktní dodržování zásad bezpečnosti práce s radioaktivním materiálem a získání potřebného oprávnění pro značení biomolekul přichází do úvahy řada izotopů: p zářiče - 14C, 32P, 35S a 3H - slabé záření vyžaduje použití scintilačních činidel Y zářiče -1311 a 125l - lepší z hlediska citlivosti detekce sledovatelné přímo s několikařadově lepší odezvou 1311 má velmi silné záření a zejména krátký poločas (8,1 dne) - obojí je nevýhodné 125l má delší poločas rozpadu (60 dní) a je slabší zářič Jodace lze využít přímo vodný roztok l2, který obsahuje reaktivní formu H2OI+, vznikající v důsledku rovnovážných reakcí dochází k substituci aktivovaných aromatických jader tyrozinu (mono i disubstituce) a histidinu mohou být najodovány některé uměle vnesené skupiny jodace obvykle snižuje rozpustnost bílkovin doba reakce určuje stupeň jodace ukončí se přidáním redukčního činidla, např. dithioničitanu Jodační činidla ■ pro oxidaci jodidu se používá nejčastěji chloramin T 125I-CI ■ dostupný i v imobilizované formě na polystyrénových částicích jako tzv. IODO-BEADS (Pierce) - výhodou je pomalejší reakce a lepší kontrola průběhu a stupně jodace - IODO-GEN - 1,3,4,6-tetrachloro-3a,6a-difenylglykouril - nerozpustný ve vodě, potáhne se jím povrch pracovní nádoby ■ laktoperoxidasová jodace - nosič s imobilizovanou glukosa oxidasou (generuje s glukosou peroxid vodíku) a laktoperoxidasou - oxiduje jodid na jod Bolton-Hunterovo činidlo ■ často efektivnější než přímá jodace ■ když nejsou k dispozici volné tyrosinové zbytky ■ napřed se najoduje činidlo, to se pak konjuguje s bílkovinou 1251 :sw XJ XJ 125 R-NH2^/ - NHS HO^ŕ Radioaktivně značené protilátky ■ cílené rádioterapeutické aplikace ■ radionuklidy - 212Bi, 88Y, 90Y, "Tc, 67Cu, 186Re, 188Re, 66Ga, 67Ga, 111ln, 114ln, 115ln ■ přímé metody - jodace, interakce kovů s povrchovými -SH skupinami ■ nepřímé - zavedení chelátových skupin komplexujících ionty kovů - BCA, "bifunctional chelating agents" - DTPA, diethylentetraaminpentaoctová kyselina - na bázi dianhydridu pro derivatizaci -NH2 skupiny Liposomy 1 poprvé popsal Bangham v roce 1965 ■ široké uplatnění v bioanalytických aplikacích, jako nosičů terapeutických prostředků nebo vakcín, kosmetický průmysl ■ spontánně vznikající sférické lipidové struktury sestávající z fosfolipidových dvojvrstev (jedna nebo několik) tvořených amfifilními molekulami - - mohou být přítomny také např. cholesterol, mastné kyseliny nebo další látky důležité pro funkcionalizaci povrchu liposomů ■ amfifilní molekuly na rozhraní fází - voda / vzduch - vytváří orientovanou strukturu monovrstvy, kdy polární části molekuly směřují do vodné fáze a nepolární do prostředí vzduchu ■ mezi jednotlivými dvojvrstvami je uzavřena vodná fáze - může obsahovat hydrofilní látky, do lipidové dvojvrstvy lze vpravit hydrofobní látky Vrstvy a micely lipidová dvojvrstva sestává ze dvou monovrstev nad sebou orientovaných tak, že nepolární části jsou uvnitř struktury, kde navzájem interagují - základem přirozených biomembránových struktur sbalením monovrstvy do kulovitého tvaru vzniká micela (ve vodném prostředí) nebo obrácená (invertovaná) micela (v nevodném prostředí) ~ 4 nm lipidová monovrstva vzduch voda lipidová dvojvrstva Uzavřené struktury ■ sbalením dvojvrstvy do sférické struktury vznikají membránové váčky (vesikly) - liposomy, které uvnitř obsahují vodnou fázi ■ nejjednodušší jsou unilamelární (ULV) v praxi nejvhodnější - 20 až 50 nm - SUV, „small unilamellar vesicles", velké zakřivení povrchu - od 100 nm až do asi 1 um LUV, „large ..." - 1 až 200 um GUV, „giant..." ■ multilamelární (MLV, připravují se nejsnadněji a jsou stabilnější), až 20 pm, uspořádány koncentricky i nekoncentricky ■ multivesikulární (MVV) - obsahují uvnitř několik vesiklů_ lipidovv váček fliposom) 898499915915 Příprava liposomů rozpuštění směsi lipidů v org. rozpouštědle (chloroform:methanol, 2:1) - lze použít i rozpouštědla mísítelná s vodou, zejména ethanol; nejsou v něm ale rozpustné všechny lipidy potřebné pro přípravu liposomů rozptýlení ve vodné fázi - po odpaření rozpouštědle ve vodné fázi se dá využít mechanické protřepávání, vysokotlaká emulzifikace, ozvučování, protlačování membránou s póry (extruze) nebo opakované zmrazování / rozmrazování - vznikají různé druhy liposomů - přidání detergentů, které proces disperze usnadní dočasným maskováním nepolárních částí (Triton X-100, cholát, oktylglukosid) - přidání chaotropních činidel (močovina, guanidin HCI, thiokyanát, nitrát) izolaci žádané frakce z populace liposomů separace nadbytečných modifikujících látek nezachycených uvnitř liposomů, - gelová filtrace (Sephadex G-50) nebo dialýza - pro velikostní frakcionaci liposomů (Sepharosa 2B nebo 4B) uchovávání - ve vodném prostředí obvykle vede k reorganizaci liposomů - zmražení poškozuje integritu vnější membrány - zmražení v přítomnosti polyolů nahrazujících vodu, např. sorbitol Lipidy složení je variabilní: - cholesterol - fosfatidylethanolamin (PE) - fosfatidylglycerol (PG) - fosfatidylcholin (PC lecithin) - fosfatidylserin (PS) - fosfatidylinositol (Pl) - roztoky je třeba chránit před oxidací, udržovat ve tmě R značí zbytek mastné kyseliny, např. - kyselina myristová R = CH3(CH2)12- - kyselina palmitová R = CH3(CH2)14- - kyselina stearová R = CH3(CH2)16- Cholesterol může tvořit až 50% (mol.) z přítomných lipidů - je v membráně do značné míry rigidní a nemá volnost ohybu - jeho vzrůstající podíl snižuje fluiditu membrány liposomů a posouvá fázové přechody k vyšším teplotám I Ň H N1-cholesteryloxykarbonyl-3,7-diazanonan-1,9-diamin (C-DAN) - polyaminový kladně nabitý derivát dále je možné do liposomů včlenit i sfingolipidy na bázi sfingosinu, běžné v přirozených membránách, prakticky to omezuje vysoká cena těchto složek Náboj liposomů ■ neutrální (PC, PE) - náchylné k agregaci a sedimentaci ■ záporně nabité (PG, k. fosfatidová, PS) - dobře vychytávány buňkami, uvolní obsah při cirkulaci ■ kladně nabité (dimethyldioktadecylamonium bromid, DoDAB, stearylamin, C-DAN) - zejména pro přenos nukleových kyselin (genová terapie) Charakterizace vlastností ■ morfologické (velikost, tvar, stabilita, distribuce velikostí -mono/polydisperzní, náboj ■ strukturní organizace (permeabilita a fluidita) ■ funkcionalizace (zachytávači kapacita, stabilita, reaktivita, schopnost fúzování) ■ techniky - elektronová mikroskopie (SEM, cryo-TEM) - rozptyl světla (statický SLS a dynamický DLS) - separace (SEC, FFF, CZE) - kalorimetrie (DSC) - určení teploty přechodu 7"„ Funkcionalizace liposomu (Chemická) modifikace liposomů ■ aktivace liposomů je možná předem - modifikací komponent tvořících membránu - biotinylované liposomy - přímé zakotvení lipofilních antigénu (kardiolipiny, glykosfingolipidy) nebo biomolekul modifikovaných lipidy ■ nebo až u hotového liposomu - oxidace PG nebo PI v diolové části pomocí jodistanu - vznikne aldehydová skupina - volné aminoskupiny u fosfatidylethanolaminu a fosfatidylserinu, nebo přidání stearylaminu - karboxyskupina z PS, lze získat začleněním karboxylových kyselin s dostatečně dlouhým alifatickým řetězcem přímo do membrány - hydroxylové skupiny u fosfatidylglycerolu a fosfatidylinositolu Náplň liposomů ■ při přípravě mohou být dovnitř vpraveny různé látky z okolního vodného prostředí - barviva, fluorofory, enzymy, léčiva,... ■ liposomy pak fungují jako nosiče velkého množství detekovatelných nebo jinak "užitečných" komponent - mohou být s vysokou citlivostí stanoveny po uvolnění do okolního prostředí rozrušením membrány liposomu detergentem -- zesilovací mechanismus - postupně se uvolňují v cílovém prostředí po specifické vazbě liposomu na vhodné determinanty na povrchu buněk, tzv. cílené směrování - "homing" Homogenní imunostanovení • použití komplementu (skupina sérových bílkovin, ničících cizí buňky) - cizí buňka (resp. liposom) je opsonizována protilátkami, pak se navážou složky komplementu a zlyzují buňku (resp. liposom - přitom se uvolní značka) - CMLIA (complement mediated liposome IA) lyže pomocí mellitinu (cytolysin, 26 AA) - CyMLIA - konjugát mellitinu s antigenem, v imunokomplexu mellitin blokován Heterogenní stanovení • LISA, liposome immunosorbent assays varianta s využitím biotinu/avidinu - univerzální použití antigen (stneptjavicfin ■ výhoda: vyšší citlivost oproti klasické ELISA Boronátové komplexy ho oh ho' voh ■ kyselina boritá je schopna vytvářet komplexy se sloučeninami obsahujícími diolové uskupení - sacharidy, glykoproteiny ■ možnost využití pro reversibilní imobilizaci biomolekul pomocí kyseliny m-aminofenylborité (APBA): ■ nejznámější je možnost měření hladiny glykosylovaného hemoglobinu ho ho ho. ho' Boronátové komplexy (Versalinx) ■ velmi silnou komplexaci mezi kyselinou fenylboritou (PBA) a salicylhydroxamovou (SHA) využívá firma Prolinx pro generický způsob imobilizace biomolekul či tvorbu biokonjugátů: HO. /OH B OH HN ,OH Ô HO, /OH O N O SHA je obvykle kovalentně navázána na jednom partneru a PBA (nebo diboritá varianta PDBA) je v preaktivované formě pro modifikaci biomolekul: Imunoreagencie ■ pro značení se využívá specifická interakce mezi vazebným místem protilátky a rozpoznávaným místem (epitopem) antigénu - protein, lipopolysacharid, nízkomolekulární hapteny - peptidy, pesticidy, toxiny, léčiva, ... ■ protilátka - prakticky výhradně imunoglobulin G (IgG) - 160 kDa, 2 vazebná místa pro antigén, tvar Y, 1 Fc a 2 Fab fragmenty - polyklonální (pAb), monoklonální (mAb), rekombinantní (rAb) ■ primární protilátky - rozpoznávají cílové místo, ale obvykle nejsou nijak dále označeny - jsou dostupné tisíce prim. Ab a nebylo by ekonomické od každé připravovat různě značené konjugáty - je to ale samozřejmě možné, má význam při dlouhodobém častém používání - zjednoduší se pracovní proces ■ sekundární protilátky - obvykle značené (konjugát s enzymem nebo fluoroforem) - skupinová specifita - rozpoznávají všechny protilátky pocházející z určitého organismu, např. kozí anti myší protilátka rozpozná všechny IgG připravené imunizací myší (nebo vytvořené pomocí DNA pocházející z myši) Sekundární protilátky rozpoznávající (anti) protilátky původem: - myší, králičí, kozí, krysí, ovčí, koňské, lidské specifita vůči: - celý IgG, IgM, Fc, Fab, IgG., 2 , konjugované s: - peroxidasa, alkalická fosfatasa - fluorescein, rhodamin, Texas red, fykoerithrin - biotin, streptavidin Proteiny A, G, L některé kmeny Staphylococcus aureus produkují protein A - skupinový ligand, velmi pevně a specificky váže molekuly imunoglobulinů v oblasti Fc fragmentu (až 4 vazná místa) - 42 kDa, stabilní při pH 1 až 12, snadno renaturuje - KA až 108 l/mol, neváže ale všechny podtřídy IgG skupiny C a G streptokoků - podobný protein G - 23 kDa, nižší afinita k IgG, ale váže širší skupinu IgG - má vazebné místo pro albumin (odstraněno v rekombinantní formě) - produkují i podobné protein H (IgG Fc), protein B (IgA), Arp (IgG a IgA) Peptostreptococcus magnus - protein L - 35.8 kDa, 4 vazná místa - váže některé k (ne však A) řetězce L protilátek, i Fab a scFv fragmenty rekombinantní hybridní varianty (L/G, L/A, ...) Použití proteinů A G L ■ orientovaná imobilizace protilátek - na povrchu sensorů nebo afinitních nosičů - vzniklý komplex lze zpevnit prokřížením pomocí dimethylpimelimidátu ■ purífikace protilátek - po imobilizaci na vhodnou (agarosovou) matrici - Protein A Sepharose ■ obecně použitelné jako detekční činidlo pro imunokomplexy - Protein A značený peroxidasou nebo vhodným fluoroforem - zviditelnění přítomnosti protilátek Porovnání specifity Antibody Protein A Protein G Protein L (*) Bovine ++ ++++ - Cat + - Chicken - +/- - Dog +++ + Goat - +++ - Guinea pig ++++ ++ ? Horse ++ ++++ ? Human IgG.,, lgG2, lgG4 ++++ ++++ ++++ Human lgG3 - ++++ ++++ Human IgM, IgA, IgE +/- - ++++ Human IgD - - ++++ Mouse IgG, + ++++ ++++ Mouse (others) ++ ++ ++++ Pig +++ +++ ++++ Rabbit ++++ +++ ++ Rat +/- ++ ++++ Sheep +/- ++ - * pouze pokud má kapa řetězec Lektiny ■ buněčné proteoglykany, glykoproteiny a glykolipidy mohou obsahovat širokou škálu oligosacharidových zbytků - vyskytují se obvykle na povrchu buněk jako složky zakotvené do buněčné membrány - pro různé buňky mohou být specifické různé sacharidové sekvence - např. nádorové buňky mohou změnit své povrchové oligosacharidy ■ lektiny - proteiny schopné rozpoznávat a vázat specifické konfigurace sacharidových molekul - aglutinace buněk (aglutininy) - precipitace komplexních oligosacharidů ■ fluorescenčně značené lektiny se uplatňují při: - detekce povrchových buněčných struktura intracelulárních glykoproteinů v mikroskopii - detekční postupy v histochemii a cytometrii - lokalizace glykoproteinů na gelech a v blotech - precipitace glykoproteinů - aglutinace specifických buněk Concanavalin A ■ z bobu Canavalia ensiformis (Fabaceae, "jack beán", "pig bean") ■ první známý lektin, 237 aa, Mr 26,5 kDa, dvě místa pro ionty kovu (Ca2+, Mn2+) ■ vytváří dimery a z nich pak tetramer - 4 dostatečně vzdálená vazebná místa - výhodné pro tvorbu agregátů, (např. z erythrocytů) ■ má afinitu ke glukose a k manose - nejlépe váže methyl-3,6-di-0-(-D-manopyranosyl)-a-D-manopyranosid ■ podjednotka Con A Lektiny Izolován z Vlastnosti Vazebná specifita Con A brazilské boby, Canavalia ensiformis 4-mer, 104 kDa ionty Ca2* a Mn2* a-GIc, a-Man WGA obilní klíčky, Triticum vulgaris dimer, 36 kDa (GlcNAc)2, NeuNAc GS- .. IA4, IA3B, IA2B2, IAB3, IB4 africké boby, Griffonia simplifolia isolektiny, 4-mery, 114 kDa A: term. a-GalNAc, B: term. a-Gal GS-II 4-mer 113 kDa term, nereduk. GIcNAc PHA-L fazol, Phaseolus vulgaris 4-mer, 126 kDa GlcNAc(1-2)Man PNA arašídy Arachis hypoglea 4-mer, 110 kDa term. ß-Gal H PA hlemýždi, Helix pomatia 6-mer, 70 kDa, váže A-eryhtrocyt GalNAc SBA sója, Glycine max 4-mer, 120 kDa, isolektiny term. GalNAc a Gal ABA žampion, Agaricus bisporus Monomer, 59 kDa ß-Gal(1-3)GalNAc PSA hrách, Pisum sativum 49 kDa, 4-mer a-Man RCA Castor bean, Ricinus comunis 120 kDa, 4-mer ß-Gal B-podjednotka z choleratoxinu Vibrio cholerae Gal, gangliosid G r JU yľ3SĽ3fJCfJJ 2U-J51C3.TJJ posn rjĽÍ J 3 Jn J u ů apoptické lidské keratinocyty značené ConA-fluoresceinem (okraje membránových puchýřků) a propidium jodidem fixované a permeabilizované Osteosarkomové buňky - ConA-AlexaFluor-488 - žlutozeleně, glukopyranosyl - WGA-AlexaFluor-594 - oranžově, GlcNac - Hoechst 33342 - modře, nukleové kyseliny kapilární endothely a mikroglie z kryořezu krysíhc mozku - GS-IB4-AlexaFluor488 (žlutozeleně) - neurony - NeuroTrace 530/615 (červeně) - jádra - DAPI (modře) His-tag ■ purifikace geneticky modifikovaných rekombinantních proteinů exprimovaných v E. coli nebo jiných mikroorganismech ■ jinak "polyhistidine-tag" nebo "hexahistidine-tag" je úsek histidinových zbytků na N- nebo C-konci - volí se ten méně důležitý nebo dostupnější ■ slouží k rychlé izolaci pomocí metaloafinitní chromatografie s Ni2+ nebo Co2+ ionty - eluce snížením pH (protonace His) nebo komplexotvorným činidlem (imidazol, EDTA) - další formáty - magn. nosiče, jednoúčelové kolony, ... -> po purifikaci se tento koncový úsek odstraní - pomocí exopeptidasy z N-konce - na základě další krátké cílové sekvence endoproteinasy ■ vhodné i pro denaturované proteiny (důležitá je sekvence) ■ vadí peptidylprolylisomerasa (25 kDa, SlyD) - lépe použít SlyD-deficientní E. coli ■ vynalezeno u Roche (licence, akademická zdarma), vhodné vektory distribuje Qiagen Vnesení His-tagu ■ vnesení DNA úseku kódujícího cílový protein do vektoru, kde je His-tag sekvence přítomna na C-konci ■ použití primem s His-tag sekvencí ke spojení s cílovou DNA v průběhu PCR DNA encoding Protein HIS-TAG Forward Primer Reverse Primer HIS-TAG DNA encoding Protein DNA encoding Protein vector T Ligation DNA encoding Prorein Hts. 'A Q vector primery s repetitivními His sekvencemi (CAC nebo CAT) Protein specific sequence 5' ATGcatcatcKcatcKcacNNNNNNNN. f HIS-TAG START Protein specific sequence „N NNNNNN catcatcaccatcaccacTV coder STOP codoti Metaloafinitní interakce ■ komplexotvorná reakce nitrilotrioctové kyseliny (NTA) s vhodným iotem kovu (Ni2+, Cu2+) a imidazolovým kruhem histidinových GST-tag glutathion-S-transferasa (26 kDa) - má silnou afinitu k nosičům s imobilizovaným glutathionem GST reprezentuje skupinu multifunkčních cytosolických proteinů u eukaryot nevyskytují se u prokaryot - není tedy žádná kompetice s glutathionovou matricí připraví se fúzí konjugát cílového proteinů s GST - exprese se provede v bakteriích - GST část může zlepšit rozpustnost eukaryotických bílkovin v prokarytickém prostředí - purifikace na glutathionové matrici - odstranění GST části štěpením proteasou glutathion, y-Glu-Cys-GLy Další "tágy" tyto cizorodé sekvence se vkládají pomocí rekombinantních technik do cílových genů kódují krátké peptidy, které vytváří antigenní determinanty (epitopy), které rozpoznávají specifické protilátky výsledkem je "označení" exprimovaného proteinu daným úsekem ("tagged protein") běžně komerčně dostupné protilátky proti tag sekvencím zjednodušují identifikaci, imunoprecipitaci nebo imunoafinitní purifikaci označených bílkovin tyto fúzní proteiny se vzhledem ke krátké značce neliší od nativních bílkovin co se týká bioaktivity nebo biodistribuce příklady "tagů": - HIS HHHHHH - c-MYC EQKLISEEDL - HA YPYDVPDYA - VSVG YTDIEMNRLGK - HSV QPELAPEDPED V5 GKPIPNPLLGLDST - FLAG DYKDDDDK Značení glykoproteinů mapování glykomu - metabolické značení pomocí acetylovaných derivátů: - N-azidoacetylgalaktosamin (GalNAz) - N-azidoacetylglukosamin (GIcNAz) - N-azidoacetylmanosamim (ManNAz) v metabolismu buňky se vestaví do glykoproteinů chemicky se označí Staudingerovou ligací pomocí FLAG-fosfinového derivátu vhodné pro proteomickou analýzu postranslačních modifikací FLAG se „zviditelní" pomocí značené anti FLAG protilátky Metabolic labeling r. -_ GalNAz Staudinger ligation ob FLAG-Phosphine Ob Labeled glycoprotein Značení red. konce ■ anthranilová kyselina (2AA) nebo 2-aminobenzamid (2AB) - fluorescenční značky ■ redukční aminace - Schiffova báze stabilizovaná redukcí NaBHá 0 OH __oh X r 1 —- hct\ HO" NHAc V J Dye + | Reduclanl OH \ —OH H f HO NHAc Glycan (cycllctecycllc in Cquilihrium) HO' NHAc |l Labeled Glycan j Glycan (cyd c acyclic in equilibnum) NHAc Labe led Glycan Nanočástice ■ techniky značení biomolekul pomocí různých částic se používají již několik desetiletí, „immunogold" - částice zlata potažené protilátkou se zmiňují už kolem roku 1970 - rutinně se používají např. v elektronové mikroskopii ■ značná popularita se zvedla v posledních letech se všeobecným trendem nanotechnologií, kam řada tradičních značek „rozměrově" samozřejmě zapadá Koloidní zlato ■ stabilní suspenze dispergovaných částic kovu vel. 5 až asi 150 nm - v roztoku se jeví jako intenzívně zbarvené (červeně, dle velikosti částic -při koagulaci - zvětšování velikosti - se barva posouvá do modra) - Casiův purpur - již od středověku k barvení skla či hedvábí ■ příprava konjugátů s proteiny - řada způsobů podle toho - který typ interakce bude zodpovědný za vazbu proteinu na povrch částice; ta nese obvykle záporný náboj - mohou se uplatnit i hydrofobní vazby - velmi často se používá pevné adsorbce thiosloučenin na zlato (SAM, „self assembled monolayers") - v roztoku se záporně nabité částice odpuzují, ale existují mezi nimi a jinými molekulami i přitažlivé síly, v závislosti na iontové síle prostředí ■ adsorbované bílkoviny stabilizují sol zlata a brání koagulaci, kterou lze jinak vyvolat např. přídavkem NaCI - vazba bílkovin by měla probíhat v blízkosti jejich izoelektrického bodu, ale proces samozřejmě ovlivní i další faktory - sledovat se adsorbce dá při 580 nm. Příprava ■ prakticky je výhodné používat monodisperzní částice ■ redukce kyseliny chlorozlatité HAuCI4 pomocí různých činidel ■ obecně větší „redukční síla" poskytuje menší částice - redukce citrátem sodným poskytuje částice 15 až 150 nm velké dle použitých koncentračních poměrů - střední částice 6 až 15 nm se získají nejlépe pomocí askorbátu sodného - nejmenší lze připravit redukcí bílým fosforem (pod 5 nm) - nebo pomocí borohydridu sodného (2 nm) ■ struktura koloidní částice - Au obalené záporně nabitými [AuCI2] - neshlukují se, přitahují kationty Adsorbce bílkovin ■ inkubace s proteinem, zcentrifugování částic, rozsuspendují ■ částice s proteinem A (G, L) - univerzální zviditelnění imunokomplexů - adsorbce při pH 6,9 v přítomnosti polyethylenglykolu (PEG 20 kDa, 0,025%) jako stabilizačního činidla - produkt se uchovává v 10 mM fosfátovém pufru pH 7,4 s 1% PEG ■ adsorbce protilátek - pH 8 až 9, PEG lze nahradit albuminem (0,25%) ■ další často používané kombinace - lektiny - detekce sacharidových struktur na povrchu buněk - avidin / streptavidin - široké univerzální použit. ■ rychlé vizuálně vyhodnocované imunotesty - červená barva snadno a citlivě detekovatelná - výhodou je stabilita nanočástic - nepodléhají degradaci na rozdíl od biomolekul - nulová toxicita Depozice stříbra ■ zlepšení citlivosti detekce - zvětšením velikosti nanočástic v průběhu stanovení - specificky zachycené částice fungují jako nukleační místa pro růst krystalů v přítomnosti Ag+ solí nebo HAuCI4 Nanočástice zlata ■ nanoklastry zlata jsou vlastně koordinační komplexem ■ centrální atomy Au jsou v dané konfiguraci, na povrchu jsou koordinačně vázány s vhodným ligandem, takže zlato je valenčné saturováno a tím stabilizováno - Undecagold a Nanogold - tris (aryl) fosfin - halidové anionty ■ menší klastry Hexagold (6 Au) a Octagold (8 Au) mohou nést náboj ■ ukázka nanoklastru Au aktivovaného maleimidovou skupinou nanočástice v mikroskopii svazek mikrotubulů - anti-tubulinová Ab, kozí Ab anti myší IgG značená koloidním zlatem (vlevo) nebo nanočásticemi NANOGOLD (vpravo) - zvětšení 1300x adenokarcinomy prostaty - Ab anti cytokeratin antibody, konjugát Alexa Fluor 488 FluoroNanogold s Fab' fragmentem kozí Ab anti myší IgG - vlevo, fluorescence - vpravo, lokalizace Au po zesílení Ag+ Magnetické pole permanentní magnet má dva póly, které vytváří magnetický dipól (často reprezentován šipkou, směr od S do N), mezi póly se šíří magnetické pole magn. dipól m v magn. poli o hustotě toku B je natáčen torzní silou do směru rovnoběžného se siločarami pole: mBsin(#) 1 A / B magnetické materiály mají volný magnetický moment, vykazují magnetizaci M, která závisí na: - hustotě magn. dipólů na jednotkový objem materiálu - velikosti a vzájemné orientaci dipólů - je důsledkem nespárovaných spinu elektronů, v malé míře i pohybem elektronu v rámci orbitalu magn. pole může vyvolat i elektromagnet - elektrický proud procházející vodivou smyčkou (solenoid) vytváří uvnitř homogenní pole hustota toku B je dána intenzitou H a permea-bilitou vakua u0: B = Mo(H + M) Magnetizace magnetizace M se mění v závislosti na intenzitě pole H - konstantou úměrnosti je magnetická susceptibilita x - velikost změny závisí na typu materiálu, teplotě a někdy i na historii předcházejícího magn. pole (hystereze) zahřívání zmagnetizovaného materiálu snižuje jeho magnetizaci, při zahřátí nad 7~c (Curieova teplota) pak M zcela vymizí M Magnetické materiály magnetické - mají tendenci "zahušťovat" siločáry - železo, kobalt - vykazují magnetizaci i při absenci magn. pole diamagnetické - siločáry slabě odpuzují - bílkoviny, tuky, voda - malá negativní magnetická susceptibilita paramagnetické - v magn. poli se u nich orientují magn. dipóly a získávají magnetizaci superparamagnetické - nanočástice, 1 až 10 r - orientují se v magn. poli A © H CD CD (2) CD CD M H Magnetické částice široká škála aplikací zahrnující: - imunostanovení - separace proteinů a buněk - distribuce léčiv, oligonukleotidů - magnetická hypertermie - magnetické značení - zobrazování při magnetické resonanci (MRI) superparamagnetické materiály na bázi maghemitu (Y-Fe203) a magnetitu (Fe304) - dobré magnetické vlastnosti, nízká toxicita - žádané vlastnosti: uniformní tvar, definovaná krystalinita, monodispersnost, stabilita ve vodném prostředí, povrchové funkční skupiny - nanočástice nebo duté koule (vyšší magnetický moment) Metody přípravy depozice z plynné fáze tepelný rozklad - Fe(CO)5, Fe(oleát)2, Fe tris(acetylacetonát) mikroemulzní precipitace sonochemická syntéza hydrolytické postupy - zahřívání FeCI3.6H20 s hexamethylendiaminem a NaAc v glykolu (6 hod, 200 °C) - vzniknou částice rovnou s -NH2 na povrchu bakteriální (BMP) produkce - vznikají potažené fosfolipidovou vrstvou (magnetosomy) povrchová funkcionalizace - vrstvička zlata - polymerní povlak s funkčními skupinami - silanizace pomocí aminopropyltriethoxysilanu (APTES) - elektrostatická adheze (přes polyaminový povlak) Magn. částice v kapalině vliv vnějšího magn. pole - uniformní pole částici otáčí - orientace dle jejího magn. dipólového momentu, nedochází ale k jejímu translačnímu pohybu - pouze gradient magn. pole způsobí translační pohyb viskozitní efekty mezičásticové magnetické a elektrostatické síly - může docházet k agregaci až precipitaci - el. odpuzování zabraňuje agregaci Separace buněk ■ přímá metoda - Ugand imobilizovaný na povrchu mg. nanočástice (kolem 50 nm -nezpůsobit mech. stres) - přidá se ke vzorku, naváže se na povrch cílové buňky ■ nepřímá metoda - cílové buňky se označí ligandem, např. protilákou (biotinylovanou, ...) - vymyje se nadbytek Ugandu (pokud možno) - označené buňky se pak zachytí na modifikovaných mg. částicích ■ získaný mg. komplex se zachytí mg. separátorem ■ pozitivní nebo negativní izolace - odseparují se cílové nebo balastní buňky Cílená distribuce (magnetic targeting) ■ akumulace podaných látek ve zvolené cílové oblasti organismu ■ injekce do cévy zásobující orgán ■ v přítomnosti externího mg. pole - musí překonat lokální lineární toky odnášející nosič (0.05 až 10 cm/s, dle průřezu a rozvětvení cévního systému) - dlouhodobé zadržení nosiče v daném místě (až 70%) - lokální vysoká koncentrace uvolňované látky (až 8x) - mnohem menší zatížení pro další části organismu než při systémové aplikaci ■ termocitlivé magnetoliposomy - v cílovém místě se přenášená látka uvolní lokálním zahřátím pomocí elmg. pole Hypertermie prostřednictvím magnetické kapaliny ■ metoda likvidace nádoru lokálním zvýšením teploty na 42 až 46 °C - sníží se viabilita buněk a ty jsou citlivější na chemoterapii a radiaci - mg. subdoménové nanočástice se bioselektivně zachytí na povrch maligních buněk - aplikace externího střídavého mg. pole generuje teplo mech. pohybem Kontrastní zobrazování MRI, "magnetic resonance imaging" - H-NMR aplikované na tkáně při MRI je kontrast zobrazení důsledkem rozdílných odezev různých tkání na aplikované radiofrekvenční pulsy - hustota protonů a mg. relaxační časy dané chemickým složením - zejména množství vody a lipidů přítomnost superparamagnetických nanočástic (magnetit-dextran) v cílovém místě velmi výrazně zvyšuje kontrast - více nanočástic vede k tmavšímu zobrazení, mění se rychlost relaxace protonů z excitovaného stavu - např. zdravé buňky nanočástice přijmou, ty odumřelé či poškozené ne sledování buněk značených uvnitř umístěnými mg. nanočásticemi in vivo - např. dodané buňky kostní dřeně, případně v budoucnu kmenové buňky Bioanalytické aplikace imunomagnetické sensory - snadná regenerace citlivého povrchu - na povrchu vhodného převodníku jsou zachyceny (magnet, elektromagnet) mg. mikročástice s imobilizovanou protilátkou - provede se imunostanovení, na konci se mg. částice uvolní a nahradí novými - vhodné zejména pro komplexní vzorky (potraviny, krev), které normálně degradují imunorekogniční vrstvu enzymové sensory - regenerace při stanovení ireverzibilních inhibitorů analýza DNA - specifická extrakce cílové sekvence z komplexního materiálu Enzymové značky ■ jedna molekula značky při detekční enzymové reakci konvertuje mnoho molekul substrátu - chromogenní, fluorogenní nebo poskytující jiné detekovatelné produkty ■ takže je zde využit jistý zesilovací mechanismus ■ nejběžnější využití je v bioanalytice - v imunochemických technikách typu ELISA ELISA > enzyme linked immunosorbent assay" > enzymové konjugáty („tracery") slouží pro detekci vzniku a množství imunokomplexů > enzymová značka se zachytí v komplexu na pevné fázi - povrch zkumavky, mikrotitrační destičky, imunostripu > přidáním substrátové směsi se vyvolá barevná změna ♦ ♦ kompetitivní enzymová značka ♦ V* 9 W <♦)-# sendvičová (vícevrstevná) protilátka ^ analyt Vlastnosti enzymu vhodného pro značení dostatečně vysoká aktivita - vysoké číslo přeměny stabilita snadná detekovatelnost skupiny vhodné pro konjugaci - konjugáty lze připravit mezi zvoleným enzymem a značenou komponentou - výhodně lze používat univerzálně např. biotinylované enzymy nebo protein A (G) - enzymové konjugáty Peroxidasa z kořenů křenu (HRP, „horše radish peroxidase", EC 1.11.1.7) malý (40 kDa) oxidoredukční enzym s hemem (protohem IX) v aktivním místě, glykoprotein, katalyzuje oxidaci široké škály substrátů pomocí peroxidu vodíku (i MeOOH a EtOOH) donory fenolické povahy nebo aromatické aminy, které jsou bezbarvé (leukoformy) a po oxidaci vznikají intenzívně barevné produkty pH optimum je 5 až 7, stabilita při pH 4 až 10 enzym je inhibován mimo jiné azidem, kyanidy a sulfidy mnoho isoenzymů, komerčně dostupná HRP C HKP + H2O2-* Compound I Compound I + AH^oxidizaole Substrats)-i Compound II + AtP Compound II + AHa->HRP + A.H 2A.H-íOxidized product peroxidasa ze sojových bobů (40 kDa) je termostabilní (do 90 °C) a aktivní v širokém rozsahu pH 2 až 10 Konjugace peroxidasy ■ při tvorbě konjugátů se peroxidasa může jednoduše sledovat a stanovovat na základě absorbance při 403 nm (typické pro hemoproteiny) ■ poměr absorbancí při 403 a 275 nm charakterizuje čistotu enzymu - toto jednoduché stanovení komplikuje existence několika isoenzymů - velmi kvalitní preparáty mají tuto hodnotu (R.Z., reinheitzahl) mezi 3 až 3.4, nemá to ale vazbu na aktivitu ■ reakce mohou využít e-aminoskupiny zbytků lyzinu - ty jsou ale pouze 2, což je velmi málo ■ využívají se sacharidové postranní řetězce - snadno se aktivují pomocí oxidace jodistanem a tak se získají aldehydové skupiny Chromogenní substráty HRP - DH2 + H202-- D + 2H20 bezbarvý barevný ... obecná reakce ■ ABTS, 2,2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazolin-6-sulfonová kyselina) TMB CH HgN CH, CH, NH, CH, \B„-285nm I-" CH, CH, CH, CH, íl/2 CH. H,N CH, NH, CH, 1-, CH, CH jiilfc>CH j CHjW WCH, \Bo»"370,652nfn CH. CH, HN"Q-0"NH CH,^ ^CH, '450 nm +- 2H + 3,3',5,5'-tetramethylbenzidin - měří se při 620 až 650 nm v prubehu reakce, nebo po zastavení kyselinou sírovou při 450 nm) ♦ H1 Luminogenní substráty HRP • pro citlivou detekci HRP se používá luminol - 5-amino-2,3-dihydroftalazin-1,4-dion • v nadbytku H202je intensita světla (425 nm) úměrná množství HRP +|-b02 +OH HRP NH2 O COO N2 COO -N2 hv + 3-aminoftalál NH, zlepšení luminiscence (vyšší výtěžek) - přítomnost "enhancers" sloučenin - p-jodofenol, p-fenylfenol - nejde již o záblesk, ale o stabilnější světelný tok - výsledek silně závisí na podmínkách reakce - raději použít komerčně namíchané směsi vyšší výtěžek dává 7-dimethylaminonaftalen-1,2-dikarboxyhydrazid NH I -NH Akridanové luminogeny alternativní substráty pro HRP emise při 435 nm Alkalická fosfatasa katalyzuje štěpení ortho-esterů kyseliny fosforečné v zásadité oblasti pH (AP, EC 3.1.3.1) řada isoenzymů, používá se enzym izolovaný z mukosy telecích střev - CIAP, 140 kDa dimer, 2 Zn2+ na podjednotku, vysoké číslo přeměny 3500 S"1 při reakci kolem pH 9,8 (pH optimum je 8 až 10) - aktivována aminoalkoholy (diethanolamin, Tris) uchovává se lyofilizovaná nebo v 3 M NaCI - nesnáší kyselé prostředí - poškozuje ji opakované zmrazování / rozmrazování relativně dobře snáší vyšší teploty - např. v průběhu hybridizace - značka při detekci nukleových kyselin Konjugace ALP příprava konjugátů není snadná a často dochází ke ztrátám aktivity pomocí glutaraldehydu nebo lépe heterobifunkčními činidly SMCC a SPDP - je dobré provádět konjugaci ve fosfátovém pufru, který chrání aktivní místo jako reverzibilní inhibitor komerčně dostupná je ALP s maleimidem (EZ-link od Pierce): 0==O -era o Maleimide Activated Alkaline Phosphatase (AP) Protein-AP conjugate with thioether linkage ■ protilátky se redukují merkaptoethanolem a po dialyse lze provést konjugaci ■ pro zavedení -SH slouží SATA Měření aktivity ' p-nitrofenylfosfát (PNPP, 405 nm), hydrolýzou vzniká nitrofenol - intenzivně žlutý v alkalickém prostředí 1 od fluoresceinu - fluoresceindifosfát • 4-MUP (methylumbelliferylfosfát) • luminogenní substrát - Lumigen PPD - chloro-4-methoxy-4-(3-fosfátophenyl)spiro[1,2-dioxetan-3,2'-adamantan]) - patří do skupiny dioxetanových luminogenů - substibuce halegenem v adamantanovém skeletu zlepšuje citlivost detekce (už 600 molekul ALP, zeptomoly) - 477 až (dle enhanceru) 620 nm OH I OH i o=p-o. / I I I T*^ OH jr t T ' OH ^O o-o O-CH, O-CH, + P, + h\ 5-bromo-4-chloro-indolylfosfát (BCIP) BCIP ■ hydrolytickou reakcí vzniká indoxyl, který po oxidaci (např. tetrazolium) přechází na modré nerozpustné indigo Galaktosidasa ■ p-galaktosidasa (PGal, EC 3.2.1.23) je velký enzym (540 kDa, 4 podjednotky po 135 kDa) a je tedy snadno inaktivován ■ katalyzuje hydrolýzu galaktosidů, pl 4,6, pH optimum má 7 až 7,5 (enzym z Escherichia coli) ■ má dostatek sulfhydrylových skupin pro konjugační reakce, takže lze jednoduše spojit s protilátkami aktivovanými předem SMCC Gal jako reporter genové exprese ■ enzym může být rozdělen na dva peptidy LacZa a LacZQ - samy o sobě nemají aktivitu - ale spontánně se spojí do funkčního enzymu ■ využívá se v mnoha klonovacích vektorech pro dosažení o> komplementace u speciálních lab. kmenů E. coli - malý LacZa peptid je kódován v plasmidu - velký LacZQje kódován bakteriálním chromosomem - když se DNA fragment vpraví do vektoru a produkce LacZa se přeruší, ztratí se p-galaktosidasová aktivita - základem pro modro/bílý screening rekombinantních klonů Glukosa oxidasa ■ (ß-D-glukosa:02-1 -oxidoreduktasa, EC 1.1.3.4, GOD) ■ dostupná z plísní Aspergillus niger nebo Penicillinum notatum ■ 160 kDa, dimer se dvěma FAD kovalentně vázanými na podjednotky ■ obsahuje asi 16% glykosylových zbytků ■ specifická aktivita preparátů přesahuje 200 lU/mg ■ velmi stabilní ■ v imunostanoveních často "spolupracuje" s HRP, pro kterou generuje peroxid vodíku oxidací glukosy - tunelovací stanovení, imunosensory Ureasa ■ substrátem je močovina - změna pH vyvolaná hydrolysou, měří se - pomocí indikátoru bromkresolová modř při 588 nm - potenciometricky (light addressable potenciometric sensor, na bázi pH ISFETu) - pro imunosensory Lakasa ■ z choroše Coriolus hirsutus, Cu-dependentní 1,4-benzendiol oxidasa (EC 1.10.3.2) ■ oxiduje fenolické substráty pomocí kyslíku - alternativa k peroxidase - menší problémy s dlouhodobou stabilitou substrátové směsi Acetylcholinesterasa ■ vysoké číslo přeměny (105 s1) 1 z elektrického úhoře ■ vysoká citlivost stanovení ■ substrát acetylthiocholin a DTNB - dithiobis(nitrobenzoová kyselina), Ellmanovo činidlo - poskytuje žluté zbarvení Luciferasy ■ patří mezi oxygenasy, štěpí substrát luciferin za účasti ATP - meziproduktem je luciferyladenylát, ten je poté oxidován - luciferin-4-monooxygenasa, 61 kDa, 550 aa - dochází k emisi světla při 560 nm (žlutozelené světlo), výtěžek asi 0.88 ! ■ zdrojem světluška (firefly, Photinus pyralis), (EC 1.13.12.7) Reakce luciferasy kroky I a II jsou enzymové (ligace a oxygenace) ^-m N COOH N COAMP ^-U^J + PPl + ^° (D-luciferin) (Luciferyl-adenylate) ^--^N N ^COAMP do --Očax-J M (Luciferyl-adenylate) (Peroxy-luciferin) cm) -o-y^s^j (Peroxy-luciferin) (oxyluciferin) (IV) [-o-OÍ^Í ] — (oxyluciferin) (oxyluciferin) Luciferasa z Renilla ■ mořská sasanka ("sea pansy", Renilla reniformis) svítí při dráždění ■ emituje modré světlo 480 nm, přenosem na GFP vzniká zelené záření ■ 36 kDa monomer ■ luciferinem je coelenterazin Luciferasa z brouků ■ zdrojem je "click-beetle", Pyrophorus plagiophthalamus ' různé enzymy emitující od 544 do 593 nm (zeleně až oranžově) - byly geneticky upraveny pro emisi při 611 nm a 544 nm - lucRD červená emise ("Chroma-Glo""), lucGR zelená emise (nebo CBR/uc, CBG/uc) DIPTERA COLEOPTERA Mycetophilidae Stapriylinidae Ela se Priengodidae 400 450 500 550 600 Wavelength (nm) 650 700 Luciferasa z bakterií ■ mořské bakterie - luciferasa (EC 1.14.14.3) oxiduje aldehydy (>C8, dekanal, tetradekanal) - Vibrio fischeři, Vibrio harveyi, Photobacterium phosphoreum ■ nemají význam pro použití v eukaryotických buňkách, pouze u prokaryot nad(p)h + fmn + h+ - NADH oxidoreduktasa y nad(p)* + fmnh2 Luciferasa fmnh2 + r-cho + 02 -> fmn + r-cooh + h20 + hv Geneticky upravené luciferasy světlušky: - luc nativní varianta, luc+ "enhanced", zvýšená luminiscence (vyšší svítivost) - vyžadují zlyzování buněk před přidáním substrátů - h/t;c+ optimalizované kodony pro expresi v savčích buňkách, svítí déle, poločas přes 5 hod, "Steady-Glo", h/t;cP+ zkrácená stabilita uvnitř buňky, poločas 30 min, "Bright-Glo", h/ucCP+ velmi krátká živostnost - svítí přímo v buněčné kultuře, vhodné pro mikrodestičkový formát - nahrazení C-terminální sekvence Ser-Lys-Leu cílové pro peroxisomy za Ile-Ala-Val u Renilla obdobné: R/uc, hR/uc, hR/ucP, hR/ucCP, nemá C-term. cílovou sekvenci "Dual-Luciferase" - použijí se oba typy luciferas, lyže buněk, dva substráty, postupné měření emise - "Dual-Glo" - stejné, ale přímo v buněčné kultuře optimalizace kodonů pro dobrou expresi v savčích buňkách odstranění skrytých ("cryptic") regulačních a potenciálních sestřihových sekvencí www.promega.com Vylepšené luciferasy 10,000,000 z luc+ na Iuc2 - mnohem vyšší exprese 4 n odstranění konsensuálních sekvencí pro vazbu transkr. faktorů - vyšší specifita 1,000 NIH/3T3 C HO Reportéry genové exprese molekul luciferasy je pro zobrazení potřeba mnohem méně než např. GFP (musí mít silnější promotor, je velmi stabilní) - rychlejší metabolismus (začlenění sekvence pro degradaci - PEST, Pro-Glu-Ser-Thr) - lepší pro zobrazení dynamiky exprese - efektorová specifita, uniformní a optimální exprese v hostitelských buňkách zobrazení žádané buněčné linie po úspěšné transfekci - hledání a studium účinku nových léčiv - efekty cizorodých látek na buněčné procesy identifikace interagujících proteinů - společně spustí přepis reporterového genu interakce a vzdálenosti biomolekul - BRET - fúze studovaného proteinu s luciferasou (Rluc) a druhého partnera s vhodným fluoroforem (GFP) Luciferasový reportérovy vektor pGL4 pro přenos reporterového genu do hostitelských buněk, obsahuje: - promotorové sekvence (HSV-TK, SV-40, CMV) - savčí selekční sekvence (Hygr - resistence k hygromycinu) - poly(A) úseky klonovací místa luc gen (dle volby), • Iuc2 nebo R/i/cNeo Synthetic-v poly(A) Selectable Marker - None i - Hygror - Neo' - Purty Poly(A) block [for background reduction) - Firefly [Iuc2] ■ Rapid Response™ (-P, -CP) -Reni!la(hR!uc) • Rapid Response™ (-P, -CP) Přehled dostupných vektorů Vector Reporter Gene Multiple Cloning Region Protein Degradation Sequence Gene Promoter Mammalian Selectable Marker pGL4.10 \uc2 Yes No No No pGL4.ll lur,2P Yea hPEST No No pGL4.12 luc2CP Yes CLl-hPEST No Mo pGL4.13 \uc2 No No SV40 No pGL4.14 luc2 Yes No No Hvg' pGL4.15 luclP Yes hPEST No Hyg' pGL4.1ů lur.2CP Yes CLl-hPEST No Hyg- pGL4.70 hRlac Yes No No No pGL4.71 kRlucP Yes hPEST No No pGL4.72 hRlucCP Yes CLl-hPEST No No pGL4.73 hRhtc No No SV40 No pGL4.74 hRhtc No No HSV-TK No pGL4.75 hRluc No No CMV No pGL4.7ú hRhtc Yes No No Hvgi pGL4.77 hRlhcP Yes hPEST No Hvg' pGL4.78 hRlucCP Yes No No Hvg' BRET ■ bioluminiscence resonance energy transfer - neradiační přenos energie z luminiscentního donoru na fluorescentní akceptor - vyskytuje se také in vivo (rod Renilla obsahuje luciferasu emitující modré světlo, BRET přenosem na GFP se ale mění na zelené - účinnost BRET se stanovuje jako poměr intenzit emise akceptoru a emise donoru - eliminují se tak vlivy techniky měření, počtu buněk, prostředí ■ aplikace in vivo - studium interagujících biomolekul - jeden z partnerů se na úrovni DNA sfúzuje s genem luciferasy (rluc), druhý partner pak s genem GFP ■ výhody - není problém s fotorozkladem - lze studovat buňky citlivé na světlo, případně buňky s vysokou přirozenou autofluorescencí ■ při sférických problémech lze použít velmi malou luciferasu z rodu Gaussia (20 kDa) Bioluminiscence vs. fluorescence F - vysoký jas, excitované stavy mohou vznikat rychle díky masivnímu excitačnímu záření (napumpovaní energie) - ale zvyšuje se i signál pozadí, rozhoduje poměr signál/šum - detektory nerozlíši excitační a emitované fotony (geometrická diskriminace ani filtry nejsou 100% účinné) - emitují i nežádoucí fluorofory přítomné v komplexním biomateriálu - uplatní se při zobrazování detailů - rozhraní, kdy S/N nemá takový vliv - mikroskopie, cytometrie, kdy stejně optická konstrukce limituje citlivost detektoru BL - nižší intenzita světla, ale současně prakticky nulové pozadí - uplatní se při "větších" vzorcích, kdy je pouze jednoduchá optika (žádné filtry) a detekce fotonů je tedy efektivnější (detektor blíže vzorku) - stanovení ve zkumavkách, v mikrodestičkách, detaily u větších organismů (myši, ...) - široká lineární oblast (6 až 8 koncentračních řádů) - při bioanalytických stanoveních dosahuje 10 až 1000x vyšší citlivosti a limity detekce (1020 mol, cca 104 molekul/vzorek, několik molekul v buňce) - luminofor je chráněn při emisi uvnitř bílkovinného obalu Acetátkinasa jako značka pro vysoce citlivá imunostanovení generuje ATP z acetylfosfátu a ADP vzniklé ATP se pak použije pro vyvolání bioluminiscence luciferinu s luciferasou citlivost až 10-22 mol Substráte + *- Substráte + ADP Imobilizace biomolekul v afinitní chromatografii separační postupy využívající vysokou specifitu bioafinitních interakcí - afinitní chromatografie možnost opakovaného použití biomolekul - snížení pracovních nákladů - imobilizované enzymové reaktory Afinitní chromatografie separace biomolekul na základě reversibilní interakce s ligandem imobilizovaným na vhodném nosiči ekvilibrace matrice ve vazebném pufru nanesení vzorku za podmínek, které jsou vhodné pro vznik afinitního komplexu, vymytí nenavázaných složek vzorku uvolnění biomolekuly změnou podmínek - přidání volného kompetujícího Ugandu - změna pH, iontové síly, polarity, ... - biomolekula se získá v čisté podobě a v zakoncentrovaném stavu • • • * 9 reekvilibrace nosiče s vazebným pufrem Průběh afinitní separace adsorption of wash re-equilibration 1-2 cv - x cv -»- 1-2 cv cv 1-2 cv Column Volumes (cv) Nosiče (bio)ligandů ■ ve vodě nerozpustné materiály obvykle sférického tvaru - kuličky "beads" - gelové materiály - membránové separační techniky - monolitické materiály - magnetické nosiče ■ v zásadě lze připravit vlastní materiály, je vhodnější používat komerčně dostupné matrice - výrobci poskytují materiály dostatečně re p rod u kováte Iné - charakterizující informace, bohatá firemní literatura - doporučené postupy imobilizace ■ povrchové reaktivní nebo derivatizovatelné skupiny - obvykle nejčastěji hydroxyly - dobře se aktivují, vykazují nízkou nespecifickou adsorbci - aminy, karboxyskupiny - snadná vazba biomolekul, ale vyšší podíl nespecifických interakcí (mohou nést náboj) Mechanické parametry nosičů mechanická a chemická stabilita nosiče může být aktivačními reakcemi negativně ovlivněna mechanické parametry - ovlivňují možnost použití vysokých tlaků a rychlých průtoků - rigidní nosiče na bázi skla a silikátů či zesíťovaných polymerů - měkké gelovité nosiče jsou málo odolné a nemusí snášet ani míchání při derivatizaci chemická odolnost - vhodná pro použití různých typů solventů - možnost pracovat v širším rozsahu pH mezi 3 až 11 odolnost vůči mikroorganismům - uchovávání v chladu, přidání konzervační bakteriocidních činidel (azid) Průtočné vlastnosti dobrý průtok přes daný nosič závisí na průměru použitých částic - pro běžné účely v laboratoři vyhovuje asi 100 um - přesná definice průměru není pro afinitní techniky až tak kritická jako pro jiné druhy chromatografických separací - typický rozsah pro Sepharosu CL-6B je 45 až 160 um - pohyb kapaliny přes sloupec mohou komplikovat jemné fragmenty vznikající mechanickým poškozením částic např. při intenzívním míchání velikost částic společně s porozitou samozřejmě ovlivňují kapacitu připraveného sloupce - vzrůstá pro menší částice Vazebná kapacita nosiče udává množství cílové molekuly navázané na jednotku nosiče teoretická vs. praktická - vhodnější je vztahovat tento údaj na nosič při reálném použití, tedy ne v suchém, ale v nabobtnalém stavu - často se může výsledná kapacita např. pro protein výrazně odlišovat od udávaného množství reaktivních skupin pro imobilizaci Ugandu (výrobci počítají s malou molekulou ...) - dostupnost molekul Ugandu na povrchu a uvnitř v pórech matrice - roli hraje také vzdálenost mezi povrchem matrice a ligandem - spojovací můstková část ("spacer" nebo "linker"), jeho délka může výrazně ovlivnit probíhající afinitní interakci Nespecifické interakce nespecifická vazba balastních molekul v separovaném roztoku probíhají na bázi iontových nebo hydrofobních vazeb proces lze ovlivnit - složením pracovních pufrů - promývacími kroky - také volbou teploty obvykle nelze zcela vyloučit oba typy rušivých vazeb různé typy matric vždy vykazují zbytkové interakce Volba nosiče ■ kombinace výše zmíněných parametrů ■ cena a dostupnost daného materiálu ■ předchozí zkušenosti Postup modifikace ■ nosič ■ nosič s aktivními skupinami ■ imobilizace bioligandu ■ blokování zbylých aktivních míst - glycin, ethanolamin, glycerol - hydrolysa při zvýšeném pH ■ volba pracovního uspořádání - naplnění do kolony, ... Způsob vazby Ugandu ■ vliv vzdálenosti Ugandu od povrchu nosiče - ovlivní se délkou spojovacího můstku - "linker", "spacer arm" - je potřebný pro Ugandy menší než asi 1 kDa - příliš krátký - biomolekula Ugand neváže efektivně, sterické zábrany vzniku pevného biokomplexu - příliš dlouhý - balastní biomolekuly s ním mohou reagovat nespecificky 0 10 15 20 25 Elution volume, ml 0 10 15 20 25 Elution volume, ml Silikagel "silica", Si02 x H20, voda chemicky vázaná v nestechiometrickém poměru, obsahuje vazby - siloxanové (Si-O-Si) - silanolové (Si-OH) amorfní struktura, výborná mechanická stabilita - vysoké tlaky omezená pH stabilita (mezi 2 a 8) náchylný na nespecifické interakce povrchové silanolové skupiny (Si-OH) se musí aktivovat, např. silanizací Poresní sklo CPG, "controlled pore glass" stejně jako obdobné anorganické silikáty, alumina a zeolity vynikají především výbornými mechanickými vlastnostmi - pro techniky pracující s vysokými tlaky - poměrně křehké, při aktivacích raději jemně třepat a nemíchat - při výměně roztoků je dobré používat vakuum, aby se odstranily bublinky zachycené v pórech příprava - borosi li katové sklo se zahřeje - dojde k separaci borátové a silikátové fáze, boráty se odstraní vylouhováním, vzniknou uniformní póry chemická stabilita - toleruje dobře kyselé pH - v alkalické oblasti nad pH 8 se rychle degraduje pro modifikace se využívá silanizace komerčně dostupnejšou aminované CPG i jiné deriváty nízká nespecifická adsorpce biomolekul CPG Silanizace aktivace inertních povrchů pokrytých vrstvou oxidu (sklo, silikáty, slída, oxidy kovů) - v hydratovaném stavu obsahuje hydroxylové skupiny, např. Si-OH, silanolový zbytek reakcí se silany vzniká spontánně uspořádaná vrstva - obvykle několik vrstev, ne monovrstva - nepoužívají se organické halogenované silany (jsou příliš reaktivní a žádná další skupina už by nezbyla), ale méně reaktivní alkoxyderiváty silanizací se na povrch modifikovaného nosiče zavedou vhodné reaktivní skupiny X OR 1 | RO—Si-X O | |-OH , 1 V OR |—o—Si—X | — -v , 1 ľ 1-OH I—o—Si-X 1 ROH ' 1 o aminosilany - APTES (CH3CH20)3Si-(CH2),-NH. Silanizační činidla (3-aminopropyl)-triethoxysilan APDEMS (3-aminopropyl)-diethoxy-methylsilan APMES (3-aminopropyl)-dimethyl-ethoxysilan, monofunkční - vede ke vzniku monovrstvy OCH,CH, I 2 3 H3C—Si—(CH2)3-NH. OCH,CH, (CH30)3Si—C-H, glycidoxysilany - GOPS glycidoxypropyl-trimethoxysilan - GPMES (3-glycidoxypropyl)-dimethyl-ethoxysilan merkaptosilany - MPTS H C-CH. \/ ' O CH, I 3 CH3CH20—Si—(CH2)3-NH2 CH, (CH30)3Si-(CH2)3-SH CH, I 3 CH,CH,0—Si-C- 3 2 I H, CH, 2 H -C-CH, \/ O (3-merkaptopropyl)-trimethoxysilan MPDMS (3-merkaptopropyl)-methyl-dimethoxysilan OCH,CH, I 2 3 H3C—Si—(CH2)3-SH OCHXH, další činidla - MPS (3-trimethoxysilylpropyl)methakrylát (CH3CH20)3Si-(CH2)3-0- CH, CH. Silanizační reakce lze provádět z organické fáze - 10% roztok silanu v toluenu, v něm se daný povrch ref luxuje 12 až 24 hod, po promytí toluenem či acetonem a vysušení se dále zahřívá 2 až 4 hod při 110 °C z vodné fáze se dosáhne menší vazebná kapacita, ale vrstva je stabilnější při použití ve vodném prostředí - povrch se hydratuje 30 min povařením ve vodě - zahřívá 3 až 4 hod při 75 °C v 10% vodném roztoku silanu, pH 4 - po usušení se zahřívá přes noc při 110 °C odpařovací nanesení je nejjednodušší - povrch se inkubuje 1 hod v 1% roztoku silanu v acetonu - po opláchnutí acetonem a vysušení se zahřívá 1 hod při 110 °C nanášení silanu z vodné fáze nebo z polárních rozpouštědel vede ke tvorbě složitějších struktur (4 až 5 vrstev silanu) Agarosa (Sepharosa) polysacharid tvořen z D-galaktosy — 3-anhydrogalaktosy — poly-{P-1,3-D-galaktosa-a-1,4-(3,6-anhydro)--L-galaktosa} sekundární a primární struktura je komplexní, vláknitá s přítomnými póry přirozená je mechanicky labilní (zahřátím nad 40 °C se rozpouští) - modifikuje se zesíťováním pomocí epichlorhydrinu nebo divinylsulfonu - ztratí se tím část využitelných hydroxylových skupin - zesítěná je relativně stabilní (rozpouštědla mísitelná s vodou, pH 3 až 14), - neměla by se nechat vyschnout Sepharosa nejběžnější je Sepharosa CL-6B - zavedená firmou Pharmacia (Amersham Biosciences, dnes GE Healthcare) - CL = „crosslinked", 6B = 6% „beaded" agarose - póry dostatečné pro biomolekuly do 1 MDa, varianty 2B a 4B do 10 MDa - nosič dodávají i firmy BioRad jako Bio-Gel A a IBF jako Ultrogel pro aktivaci vhodné metody zaměřené na hydroxylové skupiny Sepharose Forma (částice vesměs 90 pm) High Performance 6% highly cross-linked agarose (34 pm) 6 Fast Flow 6% highly cross-linked agarose 4 Fast Flow 4% highly cross-linked agarose CL-6B 6% cross-linked agarose CL-4B 4% cross-linked agarose 6B 6% agarose 4B 4% agarose Preaktivované Sepharosy NHS-activated Sepharose High Performance 12-atom. hydrofil. můstek, přes -NH2 NHS-activated Sepharose 4 Fast Flow viz výše CNBr-activated Sepharose 4 Fast Flow vazba primárních -NH2 skupin EAH Sepharose 4B 10-atom. můstek, přes -NH2 ECH Sepharose 4B 9-atom. můstek, přes -COOH Epoxy-activated Sepharose 6B 12-atom. hydrofil. můstek, přes -OH, -NH2 nebo -SH skupiny Activated Thiol Sepharose 4B 10-atom. můstek pro reversibilní vazbu přes volné thioskupiny Thiopropyl Sepharose 6B 4-atom. hydrofilní pro reversibilní vazbu proteinů a thiolovaných ligandů. Reaguje i s těžkými kovy, alkyl- a arylhalogenidy a dává adiční reakce s C=0, C=C a N=N vazbami Preaktivované Sepharosy Chemical group on ligand Length of Structure of spacer arm spacer arm Product Proteins, peptides, amino acids 10-atom amino carboxyl thiol None 10- atom 11- atom 4-atom 10-atom 12- atom OH OH r=. °Y°H HiTrap NHS-activated HP NHS-activated Sepharose 4 Fast Flow CNBr-activated Sepharose 4B CNBr-activated Sepharose 4 Fast Flow ECH Sepharose 4B EAH Sepharose 4B Thiopropyl Sepharose 6B Activated Thiol Sepharose 4B Epoxy-activated Sepharose 6B Aktivace -OH v sacharidových matricích • epoxyskupiny (bisoxiran, epichlorhydrin) • bromkyanová metoda • divinylsulfon CH,=CH-SO,-CH=CH, R-NH, (R-OH, R-SH) |-oh |-0-CH2-CH2-S02-CH=CH |-0-CH2-CH2-S02-CH2-CH2-NH-R sulfonylchloridy - tosylchlorid = p-toluensulfonylchlorid - tresylchlorid = 2,2,2-trifluorethansulfonylchlorid ci-so,—^j)-ch3 tosylchlorid ci-so2-ch2cf3 tresylchlorid r-nh2 ho-so2-ch2cf3 i-oh i-0-S02-ch2cf3 i-nh-r Srovnání reakčních parametrů Aktivní skupina Reagující skupiny ligandu Reakční podmínky epoxy - NH2 -OH -SH -COOH pH 5-12 doba 4-72 hod teplota 4 - 60° C bromkyan - NH2 pH 7-10, doba 1 -12 hod, teplota 4 - 25° C UlVIflyloUllUll - NH2 -OH -SH pH 6-11, doba 2-24 hod teplota 4 - 25° C tresyl - NH2 pH 7-9, doba 2-16 hod, teplota 4 - 25° C Množství navazovaného Ugandu -kolik ho použít? když ho máme dostatek - 10 až 100x molární přebytek vůči přítomným reaktivním skupinám malé biomolekuly - 1 až 20 umol na 1 ml media (2 umol typicky) proteinové Ugandy - 5 až 10 mg na 1 ml media protilátky - 5 mg proteinu na 1 ml media velmi slabě interagující systémy - co nejvyšší koncentrace Ugandu - vyšší koncentrace vede k vyšší vazbě Dextranové nosiče materiály Sephadex, Superdex glukosové jednotky spojené 1,6 vazbou, větvení i přes 1,2 /1,3 a 1,4 spoje mechanicky málo stabilní náchylné na bakteriální degradaci glykosidické vazby nestabilní při nízkém pH Celulosa ■ použití není tak běžné, spíše v průmyslové oblasti ■ velmi často se objevuje ve formě membrán ■ lineární polymer z 1,4-p-D-glukosových jednotek ■ nativní polymer je ve formě vláken bez poresní struktury, reinformovaná celulosa je ve formě kuliček • snáší pH 3 až 10, stabilnější je při kyselé oblasti pH, při pH 7 může být autoklávována • vláknitá celulosa se dodává jako suchý prášek - Whatman, BioRad, Schleicher & Schuell - v roztoku je náchylná na mechanické poškození (NE magn. míchání) ■ aktivace - karbonyldiimidazol a divinylsulfon (JF chloroform iát _OH CI-CO-0-CH2CH3 —O R"NH2 \=o N-R H —OH —OH - HCI, CH3CH2OH ^=o —O ■ celulosové částice, průměr kolem 450 um Polyakrylamidové nosiče ■ v biochemické oblasti velmi oblíbené ■ připravují se kopolymerací akrylamidu a N,N'-methylen-bis(akrylamidu), probíhá radikálovým mechanismem v přítomnosti tetramethylendiaminu (TEMED) a peroxodvojsíranu amonného jako iniciátoru ■ Bio-Gel P dodává materiál firma BioRad - póry poskytují vylučovací limity od 2 do 400 kDa - nízké nespecifické vazby - dobrá pH stabilita (2 -10) ■ nevýhodou je malá mechanická stabilita - variabilita matrice při změně složení pufrů - nízké průtočné rychlosti ■ aktivace se nejsnáz provádí částečnou hydrazinolýzou při 50 °C - dostupné jsou i preaktivované materiály (Enzacryl) ■ glutaraldehydem - uplatní se adice amidové skupiny na dvojné vazby přítomné v polymerní formě glutaraldehydu. Trisacryl kopolymerace dodáváIBF N-akryloyl-2 amino-2 hydroxymethyl-1,3 propandiol ^ ^(^^2®^z ^ ^^^OHJg H,C=C-CO—N-C(CH,OH), 2 H H CO I -CK-CH-CH. CO l-CK-CH- H H H,C=C- N-CO-C-C-CO- N-C=CH, H H OHOH H H N,N'-diallyltartradiamid -CH. -CH NH CO CH-OH CH-OH CO NH CO -CH-CH,-CH trisacryl NH-C(CH2OH)3 tris(hydroxymethylové) uskupení poskytuje materiálu výborné hydrofilní vlastnosti zesíťovaný charakter přináší zlepšení mechanických vlastností oproti polyakrylamidu tolerance pH je od 1 do 11 snáší zmražení, teploty do 120 °C a organická rozpouštědla aktivace je možná pomoci - karbonyldiimidazolu - bromkyanu - divinylsulfonu Sephacryl na bázi dextranového gelu s vnesenými allylovými postranními skupinami zesíťovanými pomoci N,N'-methylen-bis(akrylamidu) obsahuje tedy lineární glukosové řetězce spojené přes molekuly bis(akrylamidu) a také lineární části polymerního bis(akrylamidu) vyrábí Pharmacia Sephacryl S-300 a S-400 - vylučovací limity 1,5 a 8 MDa gely HR řady - vylepšené průtočné vlastnosti materiál je dostatečně chemicky i mechanicky odolný aktivace - přes sekundární hydroxylové skupiny Methakrylátové matrice CH,OH O o-^-c=c H0C=C-C-O-CH,-ip-CH2-O-u-C=CH2 CH3 CH2OH CH3 | CH30 OH ■- H O-C—C—C-f-O-C—C-fc-O-- H-f-0-C-C-]^-OH 0 ° II / \ H,C=C-C-C-C-CH, 2 1 H, H 2 CH, 2 CH, I 2 CH2 H3C— —► =0 0 1 CH, I 2 HC-OH I C....... H, '2 "2 TSK I pentaerythritol dimethakrylát II polyethylenglykol III glycidylmethakrylátu TSK-Gel Toyopearl (vyr. Tosoh, distribuce Merck jako Fractogel TSK) - kopolymerace glycidylmethakrylátu, pentaerythritol dimethakrylátu a polyethylenglykolu - velký počet hydroxylů a etherových vazeb částečně hydrofilní, výborné mech. vlastnosti, tolerancí pH 2 až 12 velikosti S („superfine", 20 až 40 um), F („fine", 30 až 60 um) a C („coarse", 50 až 100 um) střední typ rozsah 50 kDa až 5 MDa - nejvhodnější pro afin. separace CH,0 O CH, HEMA CH3 _ + O O II II H2C=C-C-0-CH2-CH2-0—C-C=CH2 CH, CH, H,C- -o-c-c-o- O CH, -CH, CH, -I-CH3 CH, O H,C- CH, H,C- -o-c-c-o- -CH, CH,0 O CH, poprvé připraven v Československu - distribuován pod názvy Separon a Spheron - vzniká kopolymerací 2-hydroxyethylmethakrylátu se síťujícím ethylendimethakrylátem - zesíťovaná struktura vytváří makro i mikropóry, které poskytují vysokou odolnost vůči tlaku chemická odolnost je pro pH 2 až 12 - krátké promytí je možné i 2 M NaOH či 2 M HCI tepelná odolnost až do 170 °C dodávané velikosti částic jsou 5,10 a 60 um - v tuzemsku nyní vyrábí firma Tessek - k dispozici i předaktivované matrice s různými reaktivními skupinami o II H2C=C-C-NH-CH2 O II -NH-C-C=CH, i i Eupergit i i ÓH, ÓH, CH3 CH3 1 2 1 2 + O /\ CH, 1 2 CH20 1 2 n H,C—C-C-O-C- -CH HC—C-NH, O II H H2 H2 CH20 1 1 li -C—C-N-C—N- 1 2 O CH, II | 2 -C-CH H2C=C-C-NH2 -► H3C- ČH3 O II i H H, H CH, 2 1 2 Au o CH2 /\ H,N-C- -C-CH, HC-C-O-C-C-CH, + 2 i 3 1 H, H, H 2 O CH2 CH, 2 2 /\ H,C=C-C-0-C- C-CH, H H2 H2 H 2 - kopolymerací methakrylamidu, N,N'-methylen-bis(methakrylamidu) a složky s oxiranovou skupinou, glycidylmethakrylátu nebo allylglycidyletheru (na obr. dole) - Rohm Pharma, v USA jako Spectra/Cryl ■ porézní částice 30,150 a 250 um, neporézní 1 um - mechanická stabilita výborná ■ imobilizace probíhá adicí na oxiranové uskupení - reagovat mohou primární aminy, sulfhydrylové skupiny či hydroxyly - doporučována přítomnost fosfátového pufru, urychlí se tím reakce a může probíhat blízko neutrálního pH Polyamidové nosiče ■ polykondenzační reakce - Nylon 66 z 1,6-diaminohexanu a hexan-1,6-dikarboxylové kyseliny - tuzemský Silon vzniká kondenzací e-kaprolaktamu - ve formě membrán, sítek, kuliček a trubiček pro imobilizaci enzymů ■ přirozený materiál má pro imobilizaci málo volných konc. skupin - je nutné jeho strukturu částečně narušit opatrnou hydrolýzou - asi 3 M HCI, doba působení závisí na formě materiálu, 10 sec až 1 hod ■ aktivační postupy, které amidovou vazbu nepřerušují - O-alkylace peptidové vazby oxoniovou solí (triethyloxonium tetrafluoroboritan) - dimethylsulfátem - vzniklý imidoester reaguje v slabě alkalickém prostředí s aminoskupinou (lyzin, 1,6-diaminohexan) za vzniku amidinu - kladný náboj zvyšuje polaritu polymeru - získá se větší povrchová hustota využitelných karboxy nebo aminoskupin - na trhu dostupná řada aktivovaných membrán /c-nh— (ch3)2s°4_C=fíH— r-nh2 _ C=Shk 'ii _fc. i _^ i \ o ► och3 . ch3oh * nh|-r Aktivace polyamidu dimethylsulfátem Skupinově specifické Ugandy ■ interaguje s třídou podobných biomolekul - skupinová separace NAD+, NADP+, Blue B dehydrogenasy 5'-AMP, Blue F3G-A NAD+-dependentní enzymy 2,,5,-ADP, Red HE-3B NADP+-dependentní enzymy kalmodulin, Blue B kinasy glutathion glutathion-S-transferasa (fúzní proteiny) chitin chitin vážící protein (fúzní proteiny) amylosa maltosu vážící protein (fúzní proteiny) Green A CoA proteiny, HSA benzamidin serinové proteinasy heparin lipoproteiny, hormony, DNA, RNA polymyxin endotoxiny konkanavalin A gluko- a manopyranosylové zbytky poly U, oligo-dT poly(A)+mRNA Cibacron blue F3G-A • příklad racionálního návrhu skupinově specifického Ugandu • původně textilní barvivo • váže se pevně do aktiv, místa dehydrogenas namísto přirozeného substrátu NAD+ - antrachinonová část - odpovídá adeninové kapse - diaminobenzensulfonát - interaguje s guanidinovou skupinou Arg zbytku - triazinový cyklus - atom chloru se váže v pyrofosfátovém místě ■ substituenty X a Y pak jemně dolaďují afinitu Ugandu - nejvyšší afinitu má derivát s -COOH v meta poloze (Y) - vliv na velikost disociační konstanty a tím pevnost vazby na afinitní nosič ■ další aplikace - odstranění albuminu ■ vazba na nosič - substituce v místě chloru triazinového cyklu, např. Blue Sepharose SO, H Procyon red -SO, H SO, H SO, H SO, H SO, H polycyklické barvivo vykazující jistou strukturní podobnost k NADP+ dále interagují albumin, lipoproteiny, interferon, koagulační faktory - méně specifické - elektrostatické a hydrofobní interakce Polystyren ■ zejména požíván jako materiál pro mikrodestičky ■ nejjednodušší imobilizace - adsorpce proteinů na povrch na základě hydrofobních interakcí ("coating" protilátek) - třeba vysytit zbývající vazená místa vhodnou inertní bílkovinou (albumin, kasein, želatina, sušené mléko bez tuku,...) ■ imobilizace malých molekul - třeba kovalentní vazby ■ modifikace PS - nitrace a redukce poskytnou povrchové aminoskupiny komerčně dostupné (Nunc) i modifikované mikrodestičky - "vážící aminosloučeniny" - se streptavidinem Monolitické kolony ■ poresní chromatografické sorbenty ve formě vyplňující celý separační prostor - Hjerten 1989 - PAG - "continuous bed" - Švec a Frechet 1992 - "monolith" na bázi makroporesního org. polymeru ■ polymerace uvnitř kolony (i kapilární) - polyakrylamid a methylenbis(akrylamid) nebo piperazindiakrylamid - styren a jeho deriváty, síťovadlo divynylbenzen - deriváty methakrylát - butylmetakrylát, methakrylová kyselina, glycidylmethakrylát, zesíťují se ethylendimethakrylátem (Bioseparations) • modifikované silikagely, spečené chemicky modifikované silikagelové částice (Chromolith, Merck) > kombinace malých ("mesopores", vhodné pro imobilizace ligandů, nm rozměry, difuse) a velkých ("through pores", zajišťují tok kapaliny, pm rozměry, konvekce) CIMs • "convective interaction media" - separační monolitický materiál ve formě disků - výborné průtočné vlastnosti díky převažující konvekci - celý tok media jde přes separační oblast, u časticových nosičů dochází k neefektivnímu obtékání částic - průtočné rychlosti až o řád vyšší bez vlivu na separační vlastnosti a vazebnou kapacitu materiálu kombinovatelnost různých materiálů v jednom 1 různých disků 'sloupci" - sériové spojení Column volume Row rate applied rime - loading ($cv) ttnt - elolion ftOCV) Tsme-equilibration (5CV) CIM* monotints Porous pamcIB 0.34 ml Jml/mln QAmiíí Tuno - lots! oct roň I ml/min (1 CV/mio) fittedwith standard ifW ODUHFi0-32VALC0-type connectors, the column cen be fitted to any LC, HPLC, orRA system. 5 min The Housing can be supplied In two different plastic verskms: POM (blue & white) and PEEK (brown). Disks are easily placed Into me bousing allowing simple column handling; fast efficient, and inexpensive screening of different chemistries. The housing can accommodate up to 4 disks. By packing the same chemistry, the volume (capacity) and length can be increased] by packing different chemistries, one can perform Conjoint Liquid Chromatography (CLC). Kombinace AC / IEC SsJsJnlyrjj j^ilis] rjj-jacs Quantification or impunities in IgGs Transferrin and albumin are often present in IrjG concentrates and are considered impurities. It is important to determine their concentration in order to obtain a well-characterized biological product Two CIM® Protein G disks and one CIM® quaternary amine (OA) monolithic disk were placed consecutively into one housing forming a CLC monolithic column allowing a complete separation of all three proteins in less than 5 minutes. Under the applied binding conditions, the IgGs were captured on the Protein G disks while transferrin and albumin were bound to the OA disk. Subsequently, transferrin and albumin were eluted separately by a stepwise gradient using sodium chloride, whereas the IgGs were released from the Protein G ligands by applying a low pH. This validated method permits the quantification of albumin and transferrin in IgG concentrates. From:Branovi6elal. (Odapnarma), J. Immunol. Math, 2002, 271,47-5$ Peak I: Transferrin Peak 2 Albumin Peak3:!gOi Tlmft(mln) - NS-i amcle — (Uic. NaCi — tJf Sample 0.25 nl (amount of IgG sample was B mg) Buffer* 20mMTris-HCI(pH7.0) BnfferB 20mMTris-rlCI + 1MNaCI(pH7.0] Buffer C 0.1MGIycirie-HCI(pH2.6) How rate 4 mťmin column 2 CIM* Protein G disks +1 CIM* OA disk Bradykinin (8K) Bovine serum Succinylated BSA Conjugate of BK with 1.5mg/ml albumin (BSA) (BSA-S) 3.0mg/ml BSA (BSA-S-BK) disk 3-Qmg/mldisk disk 7.4mgjmldisk Sample 500 pi rabbit blood sera (proteins: 2 mo/ml) Buffer A 10mM phosphate, 150mM NaCI (pH 7.0) Butler B 10tnMHCI(pH2.0)_ Imobilizace enzymů enzymy - průmyslové použití - biokatalytické konverse - bioanalytické aplikace, enzymové sensory ekonomický aspekt - snížení výrobních nákladů enzymových procesů díky opakovanému použití dlouhodobá stabilizace enzymové aktivity snadná separace výsledného produktu - dvoufázový systém, enzym zachycen na heterogenní fázi - substrát, produkt volně v roztoku - realizace kontinuálně pracujících procesů (enzymové reaktory) nevhodné, pokud je i enzymový substrát nerozpustný Ideální nosič enzymu levný, inertní, mechanicky pevný, chemicky stabilní zachovává nebo zvyšuje specifitu enzymu (dána poměrem *cat/Km) snižuje inhibici enzymu produktem posunuje pH optimum enzymu žádaným směrem zabraňuje mikrobiální kontaminaci omezuje nespecifickou adsorpci Způsoby imobilizace ■ a adsorbce • b kovalentní vazba • c zachycení v polymeru, "entrapment" • cŕzachycení v membránovém váčku, "cofinement" Volba nosiče • nízká cena (po zničení enzymové aktivity se vyhodí) ■ drahé nosiče - při malém rozsahu procesu, případně pokud je lze použít opakovaně (opakovaná imobilizace enzymu) ■ uplatní se forma, tvar, mech. stabilita, hustota, porosita, distribuce velikosti pórů, povrchový náboj (posun pH optima reakce), hustota reaktivních skupin (vazebná kapacita) ■ speciální vlastnosti - magnetismus - rozklad nežádoucích produktů (Mn02 a peroxid vodíku) - povrch s redukčními vlastnostmi (Ti02) Geometrické uspořádání ■ částice („beads") - definovaná velikost a porosita ■ filmové povlaky - tenké vrstvy na vhodném neutrálním nosném materiálu ■ membrány - současně je možné realizovat biokatalytickou reakci a separaci na základě rozdílné velikosti substrátu a produktu ■ vláknité materiály - vysoký podíl povrchu - velká objemová aktivita ■ pěny - zachycení uvnitř (polyurethany) Struktura - mikroporesní 0.1 až 10 nm - mesoporesní 3 až 10 nm - srovnatelné s velikostí enzymů - makroporesní 8 až 1000 nm, povrch 25 až 100 m2/g - neporesní - výborná průtočnost, ale malá kapacita a malý povrch - gelovitá - nemá stálé póry, ty vznikají až při nabobtnání; obdoba neporesního uspořádání Adsorpce enzymů na nosič jednoduchý, široce použitelný postup - velmi mírné podmínky, zachování aktivity - není kovalentní vazba, není narušení konformace reversibilita - jak enzymu (purifikace), tak vlastní matrice - obojí lze regenerovat a použít znovu možnost vysokých obsahů (až 1 g enzymu na 1 g nosiče) ale slabá interakce - enzymy se mohou postupně spontánně uvolňovat z matrice zúčastněné interakce - nespecifické (van der Waalsovy síly, vodíkové můstky, hydrofilní interakce): CPG, silikagely - biospecifické - přes Ugand interagující s enzymem (mimo aktivní místo) - interakce s imobilizovanými barvivy nebo ionty kovů - iontové interakce (ionexy) - hydrofobní interakce: PET, HDPE, polyethylentereftalát, latex (polystyren), poly(ST-DVB), amberlit XAD, silikáty, zeolity, talek částečná desolvatace v průběhu vazby na nosič, může docházet ke změnám konformace - stabilizace, změny aktivity a specifity katalyzované reakce Iontové interakce syntetické pryskyřice (SP) - kopolymery akrylamidu a kys. maleinové nebo itakonové, fenolformaldehydové kondenzáty SP s povrchovými skupinami - Dowex, Amberlit, Duolit polysacharidové deriváty - DEAE-celulosa, DEAE-dextran, DEAE-Sephadex, CM-celulosa, CH-Sepharosa, AH-Sepharosa, Q-Sepharosa, S-Sepharosa - DEAE ... diethylaminoethyl, CM ... -0-CH2-COOH, CH ... -NH(CH2)COOH, AH ... NH-(CH2)6-NH2, Q ... -CH2-N+(CH3)3, S ... -CH2-S03H - všeobecně velmi hydrofilní materiály, náboj závisí na pH okolního roztoku důležitou roli hrají podmínky, zejména pH, při adsorpci Invertasa Typ nosiče % vazby DEAE-Sephadex (anex) CM-Sephadex (katex) pH 2.5 0 100 pH 4.7 100 75 pH 7.0 100 34 Kovalentní imobilizace enzymů ■ poresní / neporesní nosiče, vzájemná velikost pórů a molekul enzymu ■ povrchová hustota navázaných molekul ■ reaktivní skupiny vhodné pro kovalentní imobilizace ■ a anhydrid, b karbonát, c aldehyd, d epoxid, e azid, f isothiokyanát, g nitrofenylester karboxylové kyseliny, h azlakton ■ typické množství 0.02 g enzymu na 1 g nosiče Relativní užitečnost aa pro imobilizaci AA zbytek Obsah Dostupnost Reaktivita Stabilita spojení Použití Asp + ++ + + + Arg + ++ - + - Cys - + ++ - - cystin + - + + - Glu + ++ + + + His + ++ + + + Lys ++ ++ ++ ++ ++ Met - - + - - Ser ++ + + + + Thr ++ + + + + Trp - - - + - Tyr + - + + + C konec - ++ + + + N konec - ++ ++ ++ + sacharid, zbytek — ++ ++ + + + Orientace enzymu nesmí dojít (a) ke změně konformace vazebného místa, aby docházelo k optimální vazbě substrátu (b) nevhodné je nepřístupné aktivní místo (c) v důsledku sterické zábrany méně efektivní až nefunkční může být vazebné místo deformované v důsledku distorse (d) v obou případech může pomoci "oddálení" molekuly enzymu od nosiče použitím vhodně dlouhého raménka (spacer, linker,...) Zachycení enzymu v polymeru může se jednat o čistě fyzikální zachycení na základě velikosti - v gelu, zapolymerování uvnitř vhodné matrice kombinace zachycení a kovalentní vazby - derivatizace lyzinových zbytků akryloylchloridem CH2=CH-CO-CI - vzniklý na enzym vázaný akrylamid se pak kopolymerizuje s klasickou směsí akrylamidu a bisakrylamidu vhodné pro imobilizaci "komplexnějších" systémů obsahujících daný enzym (buňky, organely,...) metoda je vhodná pouze pro enzymy účinkující na nízkomolekulární substráty stabilita chymotrypsinu v závislosti na způsobu imobilizace - volný (a), derivatizovaný akryloyl Cl (b) - zachycený v polymethakryl. gelu (d), kombinovaně (c) Gelové matrice ■ enzym se zachytí v průběhu přípravy gelu - alginát, chitosan, želatina, PAG, PVA plus MNOHO dalších polymerů ■ vznikne tak monolitický materiál ■ enzym se nechá vsáknout do hotového gelu ve formě kuliček (Sepharosa, Sephadex) a následně se chemicky zesíťuje (glutaraldehydem) ■ prosté zesíťování nedává geometricky definované tvary ■ "smart" polymery - mění vlastnosti pod vlivem externích vlivů (pH, teplota, iontová síla) a mohou tak cíleně např. uvolnit vázaný enzym do roztoku Sol-gel imobilizace ■ sol-gel proces - vznik „skla" hydrolytickou polymerací monomole-kulárních prekursorů (CH30)4Si tetramethyl-o-křemičitan (TMOS): (CH30)4Si + H20 (CH30)3Si-OH + CH3OH 2 (CH30)3Si-OH (CH30)3Si-0-Si(CH30)3 + H20 2 (CH30)3Si-OH (CH30)3Si-0+-Si(CH30)3 + OH" , H sol enzym -—^ / gelovatění SixOy(M-OH)z(t-OH)4x.2y.2z gel zachycení v pórech J stárnutí a vysychání SixOy + zH+ + (2x-y-z) H20 xerogel (mech. stabilní) Zachycení v membránových systémech ■ enzym je od pracovního prostředí oddělen semipermeabilní membránou, průchozí pro substráty a produkty ■ membránová dutá vlákna "hollow fiber membranes" obsahují enzym uvnitř, pracovní roztok proudí okolo - povrch membrány i více než 20 m2/l ■ jednoduché - není třeba nic optimalizovat ■ relativně drahé ■ membrána může být i ve formě váčků ("droplets") - enzym se rozpustí ve vodném roztoku 1,6-diaminohexanu - disperguje se v roztoku 1,6-hexandiové kyseliny v chloroformu - vzniknou kapičky enzymu obalené tenkou membránou z nylonu (Nylon-6,6) ■ je možné použít i liposomy s enzymem uvnitř Srovnání imobilizačních postupů Charakteristika Adsorpce Kovalentně Entrapment Zachycení v membráně Příprava snadné obtížné obtížné snadné Náklady nízké vysoké střední vysoké Vazebná síla různé silné slabé silné Unik enzymu ana ne ano ne Použitelnost široká selektivní široká univerzální Pracovní problémy vysoké nízké vysoké vysoké Matricové efekty ano ano ano ne Velká difúzni bariéra ne ne ano ano Ochrana před mikroby ne ne ano ano Vliv imobilizace na pH optimum enzymu náboj nosiče posouvá pH optimum důsledek partitice H+ iontů v mikrookolí enzymu na povrchu nebo v pórech nosiče posun pH pracovního roztoku může být výhodný pro zlepšení rozpustnosti substrátu či produktu nativní enzym v roztoku imobilizace na kladně nebo záporně nabitý nosič E > > 1 - / 1/ "N \\ i f / \ '/ V* \\ sX 5 < t í 5 f r { Ik pH i 1 0 11 Difúzni vlivy substrát se musí dostat z okolního prostředí do aktivního místa překonává se nemíchaná vrstva na povrchu nosiče - externí difúze poté se pohybuje uvnitř pórů nosiče - interní difúze koncentrační gradienty substrátu a produktu v případě poresního nosiče lil- a pouze reakce a interní difúze b navíc partitice S a P v mikro prostředí nosiče c jako a, navíc externí difúze d kombinace difúzních a parti-tičních efektů partitiční vrstva je cca 1000x tenčí než difúzni vrstva TET f[S] ■ HP] HS] i— ■ f[p] (d) Difúzni kontrola enzymové konverze ■ při imobilizování velkého množství enzymu se jeho aktivita jakoby zdánlivě ztrácí ■ efektivní aktivita enzymu na nosiči je mnohem menší než teoreticky navázaná - důsledek difúzních problémů - omezený pohyb substrátu ■ pozitivní projev - zdánlivá stabilizace imobilizovaného enzymu nalezená aktivita vnesená aktivita čas Enzymové biosensory ■ imobilizace enzymu na povrch fyzikálně-chemického převodníku ■ využívají se postupy imobilizace zmíněné dříve i další speciální metodiky ■ nejčastější jsou enzymové elektrody - kombinace enzymu a elektrochemického převodníku ■ enzymové optody (optrody) - analogie, nosičem je ale obvykle světlovod (optické vlákno) Membrány a biosensory ■ membrány v biosensorech plní několik funkcí: ■ imobilizace enzymových molekul - nosná funkce ■ řízení transportu látek buď prostřednictvím difúzni kontroly nebo ovlivněním selektivity (antiinterferenční) ■ zlepšení mechanické stability ■ biokompatibilita Rozdělení membrán ■ membrána = porézní prostředí, rozdělení: ■ hrubě porézní - póry nad 5 nm (skelná frita), permeabilitu ovlivňuje rozdíl hydrostatického tlaku na obou stranách, osmotický tlak se neuplatňuje (pokud polymer membrány neinteraguje s rozpouštědlem); permselektivita je velmi špatná až žádná (prochází všechny látky) ■ jemně porézní - póry 1 až 5 nm (např. acetylcelulosa), rozpouštědlo prochází konvekcí a difúzí, permeabilita je dána velikostí rozpuštěných látek ■ neporézní (husté) - nevykazují porézní strukturu, rozpouštědlo prochází pouze difúzí Příprava membrán je potřeba pečlivě kontrolovat podmínky (vlhkost, teplota), které silně ovlivňují vlastnosti vznikajících membrán fázová konverze - roztok polymeru ve vhodném rozpouštědle se nalije na pevný povrch a vyčká se odpaření rozpouštědla - polyvinyl chlorid (tetrahydrofuran - THF), acetylcelulosa (aceton), polyethersulonát (dimethylsulfoxid) nebo polyurethan (THF, aceton) - vyšší vlkost a nižší teplota okolí - vznikají větší póry - nalití roztoku polymeru v org. rozpouštědle nemísitelném s vodou na vodní hladinu, zde se na rozhraní utvoří asymetrická membrána polvmerace z mono či oligomerů přímo na místě použití (tvorba „in situ") - vhodná k přípravě fragilních gelovitých membrán (polyvinylalkohol, polyakrylamid), které obsahují velký podíl vody dodatečná tvorba pórů - tzv. nukleární membrány (Nucleopore) - vrstva polymeru se „prostřílí" urychlenými nukleony, lokálně narušená struktura polymeru se naleptá a vzniknou póry - velmi dobrá reprodukovatelnost a homogenita pórů o poměrně přesně definovaném průměru - lokální změny lze vyvolat mechanickým natahováním (polyenové membrány, obsahující krystalické a amorfní oblasti, v amorfních pak následně vzniknou póry) Úpravy membrán Nucleopore membrána velikost pórů membrány lze dodatečně změnit: zvětšení průchodnosti se dosáhne naleptáním polymeru membrány, které vede ke zvětšení průměru pórů - alkalická hydrolýza acetylcelulosy nebo polykarbonátů zmenšení průchodnosti a zlepšení permselektivity se dosáhne depozicí vhodných látek uvnitř pórů - např. organosilanů nebo lipidických látek symetrické membrány - obě strany jsou rovnocenné, průchodnost oběma směry je stejná asymetrické membrány - připravují se na rozhraní dvou fází Biokompatibilita ■ při použití biosensorů v živém organismu (in vivo) nebo v klinické praxi při kontaktu zejména s krví (in vitro) ■ při kontaktu povrchu membrán s prostředím dochází k adsorpci proteinů - zejména albuminu a fibrinogenu na povrch ■ pak se vytváří další vrstva krevních destiček (koagulační trombóza) ■ při dlouhodobé implantaci dochází k zarůstání biosensorů tkání ■ postupné snižování citlivosti důsledkem snížené prostupnosti ■ biosensor může vyvolávat rušivé reakce u živého organismu - srážení krve, zánětlivé procesy ■ je potřeba povrch biosensorů povléknout vhodnými polymery - silikon, polytetrafluorethylen a zejména polyurethany ■ modifikovat povrchní obal - hydrofilizace, konverze aminoskupin na hydroxyskupiny ■ do vnější vrstvy vpravit látky omezující rušivé reakce - fosforylcholin, fosfolipidy, heparin Mechanické zachycení enzymu -kroužek |dialyzační , membrána nejjednodušší - kápne se roztok biokomponenty na povrch převodníku a překryje se dialyzační membránou alternativní metodou je zachycení biomolekul uvnitř vhodného polymeru (inkluze), polymerní vrstva se vytvoří na povrchu podpůrné dialyzační membrány Zachycení v gelu ■ želatina je často používána pro enzymové membrány; 5% roztok se rozpustí při zvýšené teplotě (až 50 °C) a přidá se enzym, promíchá se a naleje na podložku (např. dialyzační membrána) ■ Nafion je polymer rozpuštěný ve směsi alkoholů s vodou - používá se pro tvorbu permselektivních membrán - jako iontoměnič - může zachycovat biomolekuly -[(CF2-CF2)m —CF-| "CF2]n- 0 1 Nafion CF2 1 \ CF3 —CF- -0-CF2-CF2—S03H J P Zachycení v PVA polyvinylalkohol (PVA) je hydrofilní, neutrální a biokompatibilní polymer, ve vodě silně bobtná; dostupný ve formě oligomerů (90 kDa), které po zesíťování vytvoří konečný polymer radiační polymerace využívá ozáření směsi oligomerů a enzymu y-zářením (generuje 60Co) - vzniklé radikály vyvolají další polymeraci a zesíťování - výsledná membrána neobsahuje žádné nežádoucí produkty a současně je sterilizovaná chemické síťování - triisokyanát\ (TIC), spojí postranní hydroxyly UV polymerace - PVA obsahující styrylbipyridiniové skupiny (PVA-SbQ, 1.3%) - vůbec nejšetrnější postup imobilizace pomocí PVA NCO —N=C=0 .HO--► —NH-C-O- + . II zesiteni o Multifunkční polymery ■ kombinují imobilizaci enzymu s polymerní strukturou nesoucí skupiny mediátorů přenášející elektrony, tzv. redox relays ■ poly-4-vinylpyridin (oligomer kolem 50 kDa) se částečně využije pro tvorbu komplexu s osmiem (mediator), a částečně se do něj kvarternizací zavedou aminoskupiny ■ směs modifikovaného oligomeru, enzymu a bifunkčního činidla PEGDE (polyethylenglykoldiglycidylether) se nanese na elektrodu Ze síťová ní enzymu na povrchu S 0=CH—(CH2)3-CH=0 retikulum ■ nejčastěji se používá glutaraldehyd; směs s roztokem bílkoviny v závislosti na koncentraci složek vytváří spontánně retikulum buď přímo na povrchu sensoru, nebo na vhodném podkladovém materiálu (polyamidová síťka, dialyzační membrána) ■ reakcí mezi aldehydovou skupinou činidla s aminoskupinou bílkoviny (postranní lyzinové zbytky) vzniká propojením Schiffova báze - může se zredukovat na stabilnější aminovou vazbu Imobilizace pomocí elektropolymerace ■ využívá elektrochemickou oxidaci k přípravě reaktivních monomerů, které pak spontánně vytváří polymerní film na povrchu elektrody ■ filmy se dají vytvořit i na členitém povrchu nebo na povrchu mikroelektrod (cílená modifikace) ■ pokud jsou v průběhu elektropolymerace v roztoku přítomné biomolekuly, dochází k jejich zachycení uvnitř vznikající membrány; méně se může uplatnit také kladný náboj polymeru ■ vlastnosti membrány je možné ovlivnit přídavkem dalších látek do elektropolymerační směsi ■ tloušťku membrány určuje velikost prošlého náboje, tak se dá snadno reprodukuvatelně ovlivnit množství imobilizované biomolekuly ■ některé elektropolymerní vrstvy mohou být navíc vodivé, což usnadňuje přenos elektronů mezi elektrodou a biomolekulami - tyto polymery jsou obvykle barevné ■ klasický příklad, provádí se oxidací 50 až 200 m M pyrrolu amperometrickou oxidací při potenciálu kolem 0.8 V, jako elektrolyt se přidává KCI, pracuje se v anaerobním prostředí ■ tloušťka filmu je úměrná množství prošlého náboje (5 mC/cm2 odpovídá 13 nm), lze dosáhnout až 100 nm tlustých vrstev ■ vzniklý PPy film je vodivý, vodivost dosahuje asi 500 S/cm - pro srovnání jsou vodivosti mědi 106, křemíku 104 a skla 10-11 S/cm). ■ obdobně probíhá elektropolymerace methylpyrrolu Polypyrrol (PPY) Polyfenylenoxid (PPO) velmi tenké a mechanicky stabilní filmy PPO na povrchu elektrod vznikají elektropolymerací fenolu nevodivé, takže elektropolymerace se samovolně zastaví, jakmile je povrch elektrody elektricky izolován průběžně se dá pozoroval pokles oxidačního proudí při vzniku filmu: cas potenciál Elektropolymerace fenolu amperometricky a cyklickou voltametrií méně stabilní jsou polyanilinové (PANI) filmy vzniklé z anilinu: Kontrolní membrány ■ elektropolymerní vrstvy jsou také vhodné pro ovlivňování transportu látek jako kontrolní membrány - polyfenvlendiaminové (PPD) filmy z 1,2 diaminobenzenu ■ nevodivé o tloušťce kolem 10 nm; snadno přes ně prochází peroxid vodíku, přitom jiné rušivé látky jsou odstíněny ■ protože zachycení bílkovin uvnitř polymeru je poměrně volné, dochází časem k uvolnění do roztoku a tím k poklesu aktivity ■ jiné postupy proto používají elektropolymerní film jen jako výchozí chemickou modifikaci povrchu elektrody, a film se pak dále upravuje chemickými reakcemi. Modifikace elektropolymerů polypyrrol se dá nitrovat v p poloze a elektrochemickou redukcí nitroskupiny se získá aminoskupina vhodná pro další kovalentní vazbu biomolekul: H ~\ l v I V H CuN03 acetanhydrid Derivatizace PPy jinou možností je reakce PPy s nitrobenzoylchloridem, nitroskupinu je pak možné redukovat také chemicky zinkem v kys. octové r --Os N vi p-nitrobenzoyl chlorid -► - HCI NO, J Elektropolymerace bílkovin elektropolymerovat se dají také vhodné deriváty biomolekul ve směsi např. s pyrrolem k postranním skupinám enzymů je možné připojit pyrrolová jádra, takže po skončení elektropolymerace je enzym nedílnou součástí řetězce polymeru: 1. karbodiimid O N— (CH^COOH-► N—(CH2)2-CX NH^E) 2. enzym E ■ podobně je možné využít i derivát s koncovou aminoskupinou Aktivace inertních povrchů ■ pracovní povrch sensorů tvoří malá skupina poměrně inertních materiálů: sklo, křemík, různé modifikace uhlíku (grafit, skelný uhlík, kompozitní směsi) a ušlechtilé kovy (zejména zlato a platina) ■ některé biomolekuly se na tyto materiály adsorbují s různou pevností, avšak spolehlivá a dlouhodobě stabilní imobilizace vyžaduje kovalentní vazbu mezi biomolekulou a povrchem ■ prvním krokem imobilizace jsou aktivační postupy, které na málo reaktivní povrch sensoru zavádějí reaktivní skupiny schopné pak kovalentní vazby s biomolekulami Spontánní vznik monovrstev ■ monovrstvy (SAM, „self-assembled monolayer") - molekulární soubor vzniklý samovolnou organizací molekul aktivního surfaktantu na nosném substrátu, který se ponoří do jejich roztoku ve vhodném rozpouštědle - tři části molekuly - povrchově aktivní skupina (pevně se váže na povrch, head), alkylový spojovací můstek, koncová funkční skupina (na povrchu monovrstvy, tail) ■ 1940, Zisman - Pt v roztoku amfifilních molekul se stává hydrofobní - monovrstva ■ 1983, Nuzzo a Allara - thioly na zlatě ■ další SAM: - alkylsilany na hydroxylovaných površích (např. Si02) - mastné kyseliny na povrchu kovů - alkylfosfoniové soli na zirkonu Spontánní vznik monovrstev Au-S monovrstvy - vznik velmi pevné vazby mezi zlatem a sírou Au + S—(CH2)2-NH2 S—(CH2)2-NH2 •— S—(CH2)2-NH2 ~* —S—(CH2)2-NH2 Au Adsorpce thiosloučenin na zlato Organizovaná vrstva zmenšení hustoty skupiny zředěním inertním thiolem nejběžnějším příkladem je velmi pevná adsorpce thiosloučenin na povrchu zlata vhodnou volbou dalších funkčních skupin thiolu nebo disulfidu lze získat reaktivní skupiny využitelné pro další imobilizační kroky Thiosloučeniny ■ používají se thioly obsahující v molekule další vhodnou funkční skupinu ■ aminoskupina - nejběžnější, monovrstvy na bázi krátkých řetězců - dobře prostupné, vhodné pro elektrochemické aplikace cysteamin cystamin thiofenol -nh, ■ hydroxyskupina - slouží spíše pro inaktivaci povrchu, vnesení hydrofilního charakteru a zabránění nespecifickým vazbám biomolekul butanol 12-merkaptododekanol, 16-merkapto-hexadekanol merkapto-ethanol / propanol / HS .oh ,oh hs+^oh karboxyskupina - vhodná pro aktivaci pomocí EDC/NHS MUA, merkaptoundekanová k. merkapto-octová / propionová /... hs cooh ,cooh hs hs-f-c4-cooh Speciální thiosloučeniny ■ bis(N-hydroxysukcinimidester) kyseliny 3,3'-dithiopropionové (DSP) - váže na zlato, vnáší reaktivní NHS skupiny pro vazbu biomolekul PEO (polyethylneoxid, nebo jinak EG, ethylenglykol) jako koncová hydrofilní skupina CH2CH2-CO-0' I S I S I CH2CH2-CO-0. DSP ■ případně nesoucí na konci ještě biotin - smíšené SAM, kontrolovaná hustota biotinových zbytků ■ 11-merkaptoundecylfosforylcholin - biokompatibilní povrchy ,n+(ch3; SAM s vždy vzniká monomolekulární vrstva, která může být tak hustá, že povrch je prakticky elektricky izolován naopak adsorpce krátkých thioderivátů často zlepšuje elektrochemické odezvy bílkovin a jiných látek (usnadněná výměna elektronů s cyt c) hustotu a kompaktnost vrstvy lze určit elektrochemicky - na základě signálu vhodné elektroaktivní látky (ferrikyanid) nebo Sledovat pokles vodivosti j odezva ferrokyanidu povrchu V průběhu vzniku SAM lineami voltamogram *J w ^ ) 0 Organization X(CH2)„SH + Au" -> X(CHj)n5-Au' +V2H. (nA) O- £(mV) Povrch zlata v zásadě může být jakýkoliv (zlato je inertní vůči oxidaci) pro dobrou kvalitu SAM je nejlepší povrch Au(111) - připravitelný termálním naparováním ve vysokém vakuu - tloušťka 100 až 200 nm optimální nosičem křemík nebo sklo (slída, křemen,...) adhezi zlepší mezivrstvička (1-5 nm) Ti nebo Cr, poté povrch lépe snáší kapaliny i agresivnější chemikálie (neodchlípne se) zvýšení hrubosti povrchu (např. pro SERS) - elektrochemické leptání - nanesení vrstvy nanočástic zlata čištění povrchu zlata - aqua regia zředěná, HCI:HN03:H20 3:1:6 - piranha, H2S04:H202 poměr - elektrochemické cyklování 0.17 až 1.87 V - UV ozáření, následně oplach ethanolem - čerstvý povrch se rychle na vzduchu kontaminuje (stává se hydrofobnějším) Depozice thiolů obecně doporučovaný postup: 1 m M roztok thiolu v ethanolu po dobu 16 až 24 hod, následně oplach ethanolem - kratší časy (1-2 hod) - monovrstva nemusí být úplně kompaktní ani dokonale organizovaná (crystalinity) - objemné thiosloučeniny - může pomoci zahřátí (60 °C) - změny podmínek (optimalizace) mají často na výslednou monovrstvu zanedbatelný vliv alternativní rozpouštědla - voda, hexan, toluen, THF, dichlormethan, acetonitril, DMF - rozpouštědla s dlouhými uhlíkatými řetězci - defekty v monovrstvě (kontaminace rozpouštědlem) depozice par thiolu (v proudu dusíku, nebo ve vysokém vakuu) chemický proces: - vývoj vodíku se nevylučuje - v přítomnosti kyslíku může přecházet na vodu Au + R-SH- Au-S-R + 1/2 H2 2Au + RS-SR 2 Au-S-R Postupná organizace na povrchu ■ nejprve velmi pohyblivé, náhodně rozmístěné molekuly ■ nad kritickou mezí začnou vznikat ostrůvky z několika molekul ■ až dojde k pokrytí celého povrchu ■ a začnou vznikat husté domény, fungující jako nukleační místa ■ nakonec je celý povrch pokryt organizovanou strukturou - mohou v ní být ale malé defekty - pinholes, průměr kolem 0.25 nm povrch zlata se může částečně rozpouštět, zejména v konc. roztocích thiosloučenin Smíšené monovrstvy ■ současná adsorpce dvou různých thiosloučenin - vznikne smíšená vrstva tvořená oběma komponentami roztoku ■ obecně složení monovrstvy neodpovídá složení nanášecího roztoku ■ více se váží delší thioly a méně polární thioly ■ méně se váží thioly s polární nebo dokonce s nabitou koncovou skupinou ■ méně se váží thioly s objemnými koncovými skupinami ■ silný vliv na složení má povaha rozpouštědla - nejméně rozpustný thiol se váže přednostně ■ při vyšší teplotě nemusí vznikat smíšené monovrstvy, ale oddělené oblasti tvořené např. krátkými a dlouhými thioly ■ lze použít i asymetrické disulfidy R-S-S-R' ■ v existující monovrstvě lze nahradit již adsorbované thioly novými z roztoku (displacement), probíhá zejména v oblastech rozhraní lllll(j7lt'flit Au Stabilita thio-SAM ■ obecně je stabilita monovrstev velmi vysoká za normálních laboratorních podmínek - snáší až 1 M roztoky kyselin a zásad ■ při uchovávání na vzduchu lze za cca 20 dnů pozorovat změny úhlu alk. řetězců - postupná oxidace atomů síry na povrchu zlata - vznik sulfidů RS až sulfonátů RSOs- - vzdušnou oxidaci výrazně urychluje UV záření ■ nestabilní v přítomnosti: - silná oxidační činidla (piranha, halogeny, ozon, peroxid vodíku) - činidla atakující zlato (jodidy, kyanidy, aqua regia) - organická rozpouštědla - zahřívání nad 70 až 80 °C, při 300 °C kompletní desorbce - elektrochemická reduktivní desorbce pod -1.5 V (reverzní děj k adsorpci) - elektrochemická oxidace (0.5 až 1.5 V) v alkalickém (0.1 M KOH) nebo neutrálním prostředí Vlastnosti thio-SAM ■ tloušťka a stupeň pokrytí - elipsometrie • polarizace světla odráženého od modifikovaného povrchu závisí na tloušťce a indexu lomu nanesené vrstvy - povrchová plasmonová resonance (SPR) • p-polarizovaný koherentní paprsek se odráží hranolem umístěným pod sklíčkem s napařenou tenkou vrstvičkou kovu • při jistém resonančním úhlu se část světla absorbuje díky excitaci volných elektronů ve vrstvičce kovu (plasmony) • jev závisí na tloušťce a indexu lomu nanesené modifikující vrstvy • funguje v suchém stavu i v kapalině - studium vzniku filmů in situ - piezoelektrické křemenné mikrovážky (QCM) • resonační frekvence vibrujícího krystalu závisí na jeho hmotnosti, včetně pevně adherovaných modifikujících filmů • funguje v suchém stavu i v kapalině - studium vzniku filmů in situ poJuiat IR source dtíleclor "/-— / iiiLinol jyer surfaci; Vlastnosti thio-SAM struktura a chemické složení - FTIR spektroskopie • IR paprsek se odráží pod malým (grazing) úhlem od povrchu monovrstvy • je možné vypočítat orientaci funkčních skupin v monovrstvě - SERS (surface enhanced Raman spectroscopy) • je potřeba hrubý povrch pro zvýšení intenzity • citlivé na funkční skupiny blízko povrchu kovu (0.35 až 0.7 nm) • funguje v suchém stavu i v kapalině (normální Ramanovo spektrum je zanedbatelné) • informace o chemickém složení povrchu - X-ray fotoelektronová spektroskopie (XPS, ESCA) • měří se energie elektronů vyražených z obalu atomů po ozáření rentgenovým paprskem ve vakuu • specifické pro atomy - elementární analýza monovrstvy, schopnost rozlišit i oxidační stavy (amino x nitro) X ray Kmih monolayer surface Vlastnosti thio-SAM ■ struktura a chemické složení... - SIMS (secondary ion MS) • vzorek se bombarduje primárními ionty, obvykle Ar+ nebo Xe+ • detekují se vyražené sekundární ionty - difrakční techniky • GIXD (grazing incidence X-ray diffraction) malý úhel dopadu, analýza reflektivity a rozptylu, informace o mol. struktuře, tloušťce a indexu lomu - elektrochemické techniky • cyklická voltametrie - odezvy redoxní proby - blokování elektronového transportu při vzniku kompaktní monovrstvy • impedanční techniky - snižování vodivosti deteeior primary ions w a O © secondary inns s^© monolayer surface Vlastnosti thio-SAM ■ povrchové vlastnosti - kontaktní úhel - smáčitelnost - kapka umístěná na zkoumaném povrchu, velikost úhlu závicí na hydrofobnosti povrchu - hydrofobní__hydrofilní TABLE ]. Advancing contact angles of water on films prepared by adsorption of HSfCH^X on gold50 X rľ Contact angle, (deg) v závislosti na aplikovaném potenciálu elektrody vykazuje její povrch hydrofilní nebo hydrofobní charakter Precursor MHA Precursor Monolayer Hydrolysis Hyclrophilic Monolayer + e" © Hydrophobic Monolayer Hydrophobic Alkyl Chain Hydrophilic Carboxylate 0 group Sulfur Gold Electrode Dynamické povrchy - biosensing SAM oligonukleotidové proby specificky rozpozná virální NA polymerasa dosyntetizuje druhé vlákno, přitom ho označí redoxní molekulou ferrocenu tím je umožně přenos elektronů z donorového enzymu GOD (I. Willner) (d viral nucleic acfd Au electrode Polymerase dCTP, dATP, dGTP +Ferrocene-ďUTP (1) -5-HS- (CH2VCCCCCACGUGTAAAACGACGGCCAGT-3' OHOH HtjTN-CH^H-CHj-NI (2) Dynamické povrchy - nanowiring ■ komunikace enzymů s elektrodou prostřednictvím chemického „nanodrátku" - „wired enzymes", rychlost přenosu elektronů řádově vyšší než reakce s kyslíkem Au -- 1 \^ l"S-=-s-^^~^a-4a>"""" w ■ ^\ /Glucose f- . 1 ^-——^^i. Gluconic acid ™; V Ä --H - -H --H --H —h f S^CHj;—^ ^—CH2—3" Dynamické povrchy - nanowiring ■ komunikace enzymů s elektrodou prostřednictvím uhlíkové „nanotrubky" ' SWCNT, single-wall carbon nanotube ' komunikační kanál mezi elektrodou a enzymem ' kalibrace pro glukosu při různé délce nanotrubičky - a 25, b 50, c 100, d 150 nm 0 20 40 60 80 100 120 140 160 [Glucose] / mM -*■ Cílená lokální imobilizace primitivní postupy - „pin printing" - hrot . se namočiv roztoku činidla a mikrokapka se přenese do žádané pozice na čipu velikost spotů je 100-300 um, až 10 tisíc prob na čipu horší reprodukovatelnost, pomalost nízká cena, laboratorní příprava Ink-jet printing reagent i piezoelektrický element skleněná membrána -► • ústí mikrokapka (100 pl) mikropumpa (struktura vyleptána v k řemíku) Ink-jet tisková hlava • alternativní metoda přípravy DNA čipů - „tisk" reagencií na podklad - obdoba inkoustových tiskáren • základem je struktura rezervoáru vytvořená v křemíku (micromachining), překrytá velmi tenkou skleněnou membránou, na kterou přiléhá piezoelektrický element (aktuátor) • rezervoár se naplní reagentem, poté nad ústí pumpy posune žádaná pozice čipu, a na piezoelektrický aktuátor se přivede puls napětí • piezoelement se mechanicky deformuje, zatlačí na membránu, čímž dojde k vystříknutí mikrokapky reagentu • rychlost „tisku" je 1 až 6 kHz Ink-jet printing ■ rozptýlení kapky na povrchu brání předcházející modifikace čipu • hydrofilní místa pro imobilizaci prób navzájem oddělené hydrofobními úseky (surface tension wells) • nanášené kapky reagentů se nerozpíjí, povrchové napětí je drží uvnitř dané pozice * > pohyb pole p řes pumpy ink-jet pumpy C A G T zásobníky aktivovaných bází Syntéza souboru DNA prób reakční kroky probíhají naráz na všech pozicích čipu promývání a pomocné reakce se provádí pro celý čip společně pro 100000 pozic trvá prodloužení o jednu bázi asi 5 minut syntéza souboru o délce 25 bází zabere 2 hodiny. Subtraktivní techniky ■ vytváření struktur či obrazců pomocí odstranění přebytečných částí ■ leptání ■ FIB (focused ion beam) milling ■ laserové opracování - machining, pulzy různého trvání ■ ultrazvukové vrtání - 25 u,m amplituda při frekvenci 20-100 kHz - bezstresové opracování křehkých materiálů ■ tradiční technologie - NC frézky, vrtačky, ... 59 Strukturace povrchu ■ surface patterning ■ cílem je imobilizovat danou biomolekulu pouze v určitém geometricky definovaném místě povrchu ■ využití pro konstrukci různých typů souborů (arrays) detekčních elementů nebo multikanálových biosensorů ■ technika tisku - plastové "razítko" se namočí v modifikačním roztoku a motiv se přenese na povrch PDMS _Cu3_ Photoresist pattern (1-2 Jim thickness) PDMS is peeled away from [lie master PDMS is exposed to a solution containing HS(CH2)|5CH3 Alkanethiol Slumping onto gold transfers thiol P1JMS —Au(200 nm) + Ti (5 nm) lueniovePDMK I j— Hydrophobie SAMSlca 2 nm) Wash with a solution of HS(CH;,)lsCOOH Strukturace povrchu ■ surface patterning Charakterizace strukturovaného povrchu SNIM, IR spektrum, topografie (AFM) 1711 cm-1, absorpce ureidoskupiny 1 2 3 4 5 6 7 8 9 x(um) x(um) SNIM, scanning near field IR microscopy Litografie ■ tenkovrstvá technologie nejen pro výrobu elektronických součástek, ale i mikroanalytických planárních systémů ■ základním materiálem je křemík („Silicon wafer") ■ techniky přenosu kopie výchozího motivu („master pattern") na povrch pevného materiálu Litografie křemíkový substrát termální oxidace (vznik Si02) nanesení fotorezistní vrstvy osvit přes masku -definování tvaru vyvolání nanesení vrstvy (kov, izolace, biovrstva, membrána, ...) ' schéma pracovního postupu Litografie odleptání Si02 Fotolitografická maska ■ ukázka masky pro celý wafer (vlevo) ■ vpravo pak výsek pro 20x20 elementů DNA biočipy (DNA microarrays) ■ plátek křemíku (wafer, 5x5 inch, tj. 12.5x12.5 cm) ■ z něho 49 až 400 jednotlivých sensorů (chips, 1.28x1.28 cm) ■ na každém čipu až 1.4 milionu pozic (features, 11x11 um) ■ v každé pozici několik milionů kopií stejné oligonukleotidové próby s danou známou sekvencí Modifikace povrchu kombinace chemické reakce a UV ozařování fotolitografie, fotosenzitivní imobilizační procedura Light {depraiecMfli i i i i i i i i i i mi □ OOOO ►OOOOO ► OHOHOOO <><>*><><, Water GATCG i i i i i ■ TTOOO I I I I i TTCCOi 2S-rr»riCA TAT AGCTG SUU Repeat SSSSS GeneCriip* II I „ I I I I I TTOHOHO^ TTOOO Výroba DNA čipu b L b É i - * I I _!_!_ silanizovaný povrch sensoru, každý atom Si je zárodkem próby navázání spojovací části „linkeru", ten zakončený fotocitlivou blokovací skupinou ^ navázání prvního nukleotidu (A) ■ — H — ■ - H — * - • ozáření přes masku - odstranění blokujících skupin (deprotekce) i .V. ..... . t _ f — f - t i í (lt P.É P;e ,| N t* t, T p f( i « Výroba (3) 4 _l_!_!_:_ I I ■ maska č. 4 I I -_ _ ■ další (T), ale výskyt chyby! ■ iii zabránění dalšího růstu chybné sekvence - ukončovací báze („capping agent") po každém kroku i i i i i i i i ttlf 1 + 1« T fl^li MrM-r ■ :■>■:'■■ I - - , , , ■ i > i i i i i i i i i i i pi*.-.*-j-^TíTíiľ-[-p^žj-J-TíHÍ-p Hotovo! ■ konečný stav po odstranění „capping agents" a protekt. skupin, následuje zabalení ..packaging" do ..cartridge" ■ pro 25-mer potřeba obvykle méně než 100 masek (teor. maximum) ■ problém: přesahy mezi jednotlivými zónami (odrazy, rozptyl, vnitřní ozáření, c c c c c HJ it X í c c c c c c c c L L L L 9 - 5 - S - Sfc _ Wafer ukázka části oblasti próby po hybridizaci (AFM, šířka obrázku je 2 um) Výsledek použití Nanostrukturace povrchů pomocí SPM ■ skenovací raménko s hrotem slouží k vytváření obrazců na modifikovaném povrchu ■ techniky: ■ STM litografie - aplikuje se proudový puls ■ AFM litografie - škrábání, scratching - "ťukání", dynamic plowing ■ AFM oxidační litografie ■ AFM konstrukční litografie AFM scratching ■ AFM zařízení jako nástroj pro modifikace povrchů ■ vyškrábání motivu v polymerní vrstvě pomocí ostrého hrotu - PTCDA, 3,4,9,10-perylentetrakarboxydianhydrid Lokální anodická oxidace ■ na povrch AFM hrotu se aplikuje potenciál ■ v místě přiblížení hrotu k povrchu dojde k elektrochemickému vytvoření struktury oxidace povrchu titanu nejčastěji Fantazii se meze nekladou ... ■ "nanoobrázky",... ^| Fl Ir I LMeu | Fdlt | Tonil | Opar** Ion | ňD J | HňlH.HP_ Albert Szent-Gyórgyi Srovnání technik pro cílenou imobilizaci Techniky vhodné pro rozlišení pod 100 nm Přímá kovalentní vazba biomolekul Řízený proces v kapalině Různé typy povrchů a modifikačních činidel Nízká cena Vhodné pro rozlišení až 10 nm Chemomechanical Patterning/Nanograftin 9 ano ano ano ano ano Dip Pen Nanolithography spíše ne ne ano ano difúzní limitace Microcontact Printing spíše ne ne ano ano asi ne AFM Mechanical Scribing and Nanoindending ne ne ne ano ano c-AFM Oxidation ne ne ano ano ano UHV STM Patterning ne ne ne ne ano E-beam Lithography ne ne ano ne asi ne UV Photolithography ne ne ano ne asi ne Kam to směřuje... ■ představivost a fantazie, definování cíle výběr vhodných detekčních elementů - z čeho budeme stavět (aminokyseliny, nukleotidy, ...) vytvoření knihovny na základě kombinatorických postupů - všechny možné variace z daných stavebních kamenů paralelní testování vlastností molekul z knihovny - nalezení vhodných detekčních zpracování a výroba analytického systému - optimalizace výrobního procesu vysoce paralelní analytický proces - citlivé elementy ve formě 2D pole, oskenování (opticky, elektricky, magneticky, ...), začlenění dat do databáze matematické prohledání a prezentace, rozhodnutí - zpřístupnění výsledku uživateli v pochopitelné formě Příprava imunokonjugátů ■ imunogeny - nosné bílkoviny modifikované nízkomolekulárním antigenem (= hapten, sám o sobě nevyvolá imunitní odpověď") ■ značené protilátky a antigény - tracery pro imunostanovení Imunogeny imunogenicita - schopnost molekuly stimulovat imunologickou odpověď a následně tvorbu specifických protilátek imunogen - cizorodost pro organismus, nevlastní původ, aby nebyl imunitním systémem ignorován - dostatečná velikost - aspoň 6 kDa, jinak se pouze naváže na receptorové mlgM na membráně B lymfocytu, ale není pohlcen endocytosou - chemická komplexnost - např. velké homopolymery z aminokyselin a jednoduché polysacharidy jsou zřídka imunogenní biomakromolekuly jako imunogeny - sacharidy - jen pokud jsou dostatečně komplexní, nebo jako součást glykoproteinů - proteiny - dostatečně imunogenní; peptidy - příliš malé, je třeba je navázat na nosnou bílkovinu - lipidy, nukleové kyseliny - neimunogenní, musí být navázány na nosnou bílkovinu malé molekuly - hapteny - fungují jako antigény (epitop, váží je protilátky) - nefungují jako imunogeny, musí být konjugovány s nosičem Nosné bílkoviny volba dle imunogenicity, velikosti a dostupnosti funkčních skupin pro navázání haptenu KLH, keyhole limpet hemocyanin - z přílepky (měkýš) Megathura crenullata, kuproprotein vážící kyslík - mcKLH - z uměle pěstovaného organismu (mariculture) - lepší homogenita preparátu, lepší rozpustnost, v roztoku opalescentně namodralý - velikost 450 kDa až 8 MDa, je agregátem, stupeň agregace závisí na pH, nad pH 8,9 disociován na podjednotky - může být hůře rozpustný, roztoky často se zákalem, NaCI zlepšuje rozpustnost - má k dispozici hodně lyzinových zbytků - fylogenetický vzdálený savcům OVA, ovalbumin - z vaječného bílku, 45 kDa, dobře rozpustný, i v DMSO - využíván hojně i při screeningu protilátek BSA, bovine sérum albumin - albumin tvoří asi polovinu proteinů plasmy, stabilní a dobře rozpustný - 67 kDa, pl 5.1, jediný polypeptid obsahující 59 lyzinových zbytků, z nichž 30 až 35 je využitelných pro imunokonjugační postupy - pro konjgace je nejlepší frakce V, vysoce přečištěná - využíván nejen jako nosič v imunogenu, ale i při screeningu protilátek a při blokování pracovních povrchů - cBSA, cationized BSA - povrchové karboxyly derivatizovány ethylendiaminem pomocí EDC, zvýšení pl na 11 HOOC A ,COOH NH2(CH2 0 2NH-\ A 0 /— NH(CH2)2NH2 H2N-( BSA )-NH2 NH2(CH2)2NH2 H2N—( >^ BSA —NH2 HOOC V NH2 \x>OH EDC NH2(CH2 2NH-|j/ 0 NH2 \—NH(CH2)2NH2 0 - lepší imunogen než nativní BSA (stačí ho méně), netřeba kompletní Freudovo adjuvans - vyšší afinita k záporně nabité membráně antigen-prezentujících buněk - pro konjugace lze využívat EDC bez nebezpečí postranních reakcí Konjugace haptenu protilátky jsou produkovány proti navázanému haptenu, ale i proti epitopům nosiče - význam selekční procedury pro nalezení těch správných optimalizace imunogenu - zkusit různé nosné proteiny a různé hustoty navázaného haptenu obvykle se využívá povrchová aminoskupina nosné bílkoviny, ke které se pomocí heterobifunkčního crosslinkeru připojí hapten - inkubace nosiče s crosslinkerem (nadbytek) - odstranění přebytku crosslinkeru - inkubace s molekulou haptenu - jednoznačný průběh reakce pozor při volbě reagující skupiny haptenu mimo oblast epitopu v oblasti epitopu Imunizace ■ imunogen se aplikuje experimentálnímu zvířeti (myš, morče, králík, koza, kůň,...) injekčné v přítomnosti tzv. adjuvans - přípravek stimulující imunitní odpověď - FCA, Freudovo kompletní adjuvans - emulze vody v oleji plus mrtvé buňky Mycobacteria • emulze zadržuje imunogen v místě aplikace po delší dobu • buňky Mykobacteria přitahují do daného místa makrofágy a další imunitní buňky - FIA, Freudovo inkompletní adjuvans - jako FCA, bez Mykobacteria - ve vodě rozpustné polysacharidy - méně účinné než FCA, méně zatěžující pro organismus - Alum - hydroxidy hlinitý a horečnatý Screening protilátek • konjugát haptenu s nosičem vyvolá tvorbu různých druhů protilátek, specifických proti různým částem imunogenu proti nosiči ■■■a.^. ^ (nežádoucí) proti epitopu haptenu -(požadované) proti spojovacímu úseku (bridge-specific, nežádoucí) - nalezení vhodné protilátky zajistí screening pomocí haptenu imobilizovaného na jiný nosič a jiným způsobem, než v případě imunogenu (opakuje se pouze epitop) protilátky - koncentrace vs. titr - různé pojmy - celková koncentrace molekul protilátky (molární, mg/ml, ...) bez zahrnutí funkčních parametrů (i poškozené či částečně denaturované neaktivní), - titr = zředění dané protilátky vhodné pro daný typ imunostanovení Určení koncentrace protilátky ■ při 280 nm má roztok čistého IgG 1 mg/ml absorbanci 1,35 ■ stanovení IgG v komplexních roztocích (sérum, ascitická tekutina, extrakt z tkáňové kultury,...) - použije se latexové precipitační stanovení - latexové částice potažené protilátkou proti měřenému IgG (např. anti myší, ...) - monodisperzní částice volně v roztoku vykazují vysokou absorbanci při 340 nebo 405 nm - v přítomnosti cílové protilátky dochází k agregaci částic a k poklesu absorbance - rychlost - 5 min - vysoká citlivost - rozsah 10 - 300 ng/ml Absorbance \ Particle Size OO _> CQ OO * vo Fragmentace protilátek ■ pro mnoho účelů nepotřebujeme celou molekulu protilátky, ale stačí nám pouze menší část nesoucí vazné místo - menší molekula - méně nespecifických interakcí - snazší konjugační reakce, menší enzymové konjugáty - fragmenty vznikají štěpením proteinasami, nejlépe imobilizovanými na vhodný nosič ■ fragmenty z molekuly imonoglobulinu G IgG F(ab), Fab' Fab Fv 'rlgG* Fc Ffah'lz Heavy 2 Fab (110JXW daltons) j Chain (50.000 daitonsea.) ^BHfcT1^ ImmobilizedFicin Immobilized Ficin 1 mM cysteine 10 mM cysteine ^ Immobilized Pepsin Immobilized Papain IgG UU (150.000 daltons) UU Fc Fragments Fc (50,000 daltons) Fragmentace IgM IgM ... příliš velká molekula náchylná k nespecifickým vazbám, špatná penetrace v histochemických aplikacích - potřeba vytvořit menší vazné molekuly _ poněkud odlišné výsledky ^\ a f(alr)2 Zlepšení specifity biointerakce blokování pracovního povrchu - cílem vysytit nespecifická vazebná místa (nosiče, sensoru, mikrodestičky, ...) vhodnou inertní látkou - dosáhnout nižšího pozadí signálu - na interakci se účastní řada faktorů, úspěšné blokování je tedy výsledkem empirických pokusů blokovací roztoky - buď v PBS (phosphate buffered saline) nebo v TBS (tris buffered saline; ALP jako značka nemá ráda fosfát) - inertní proteiny: 1% kasein, 1 až 3% albumin (BSA) - komplexní směsi: sušené beztučné mléko (může obsahovat biotin), rybí sérum (steelhead salmon sérum, fylogenetický vzdálené savčím bílkovinám) - detergenty - Tween 20 nebo Tween 80 - adsorbují se na hydrofobní povrchy a tím je učiní hydrofilní promývání afinitních komplexů - roztoky obsahující nízké koncentrace (kolem 0,05%) detergentů - přeruší pouze nespecifické interakce proteinů - Tween 20 a 80, Triton X-100, Nonidet P-40, Brij-35, CHAPS, CHAPSO Charakterizace biokonjugátů a imobilizovaných nosičů ■ separace z reakční směsi ■ určení stupně substituce ■ další charakteristiky ■ uchovávání Izolace biokonjugátů separace od nezreagovaných složek konjugační směsi odstranění nízkomolekulárních komponent - nejjednodušší je dialýza v celulosovém střívku - přes noc, v chladu, vyměnit několikrát dialyzační roztok - rychlejší s centrifugačními či jinými mikrodialyzátory, konjugát málo stabilní, vhodné pro malé objemy - rychlá separace na vhodné odsolovací koloně 0.1 ml 5 M NaCI proti 1 I vody Zakoncentrování biokonjugátu zahuštění - tlakové ultrafiltrační systémy - dialyzační trubice a vně činidla odnímající vodu (PEG, Sephadex) - centrifugační evaporátory - šetrné podmínky - lyofilizace - použít zředěný nebo těkavý pufr - vakuová pomůcka na obrázku... konjugáty tvořené dvěma biomakromolekulami - chromatografické přečištění - vhodná afinitní separační technika - isolace protilátkových konjugátů od zbylého enzymu (vadí!) • imobilizovaný antigén • protein A/G/L Stupeň substituce vzniká barevný či fluoreskující produkt - spektrální vlastnosti diferenciální metoda, stanovení: - zbylého nenavázaného Ugandu - zbylých neobsazených skupin biomakromolekuly (jen pro "malé" Ugandy) stanovení navázaných molekul Ugandu vhodnou specifickou reakcí změření změny molekulové hmotnosti konjugátů oproti výchozí biomakromolekule - gelová permeační chromatografie - elektroforesa v PAG v nedenaturujícím uspořádání - hmotnostní spektroskopie hydrolýza a charakterizace vzniklých produktů - proteolytické štěpení, mapování štěpů - úplná hydrolýza, stanovení aa či detekce uvolněného Ugandu detekce barevného postranního produktu konjugační reakce - žlutý p-nitrofenol při použití p-nitrofenylkarboxylesteru jako aktivované matrice - pyridin-2-thion (e343 = 8080 M1 cm1) při vazbě -SH na pyridyl-2-thioaktivované nosiče Absorbance při výrobě biokonjugátu dojde ke změně spektrální vlastnosti produktu (navázání barviva nebo fluoroforu na nosnou bílkovinu) kvalitu konjugátu lze posoudit na základě změněných spektrálních vlastností některé konjugační reakce poskytují barevné produkty díky vzniklému můstku - diazotační postupy 300 350 400 450 500 550 A. (nm) UV-VIS spektra albuminu a konjugátu albuminu s haptenem, připravený diazotační metodou. Měřeno v 50 mM fosfátu pH 7.0, koncentrace bílkovin 1,5 mg/ml. Stanovení aminoskupin volná aminoskupina s kyselinou 2,4,6- trinitrobenzensulfonovou (TNBS) dává barevný oranžový produkt - měřitelný při 335 nm (v 200 mM HCI s 2% SDS) změřená absorbance R-NH. M se porovná s kalibrací pro SO,H . HN I I vhodný standard, např. aa 02N JTNBS N02 N02 pro vysoce citlivou fluorescenční detekci volných aminoskupin lze použít o-ftaldialdehyd (OPA) v přítomnosti 2-merkaptoethanolu - produktem je f luoreskující sloučenina (360 / 455 nm) - použije se opět kalibrace na standard Sulfhydrylové skupiny ■ Ellmanovo činidlo, 5,5'-dithiobis(2-nitrobenzoová kyselina) - reaguje s volnými SH skupinami za vzniku disulfidu - uvolní se kyselina thionitrobenzoová - intenzívně žlutá barva - £d1, = 13600 M1 cm1 Biotinové zbytky ■ stanovení úrovně biotinylace má význam při hodnocení průběhu konjugace a při kontrole reprodukovatelnosti procesu • využívá se 2-(4'-hydroxyazobenzen)-benzoová kyselina (HABA) - po navázání na avidin vykazuje silnou absorbanci při 500 nm - £ = 3,55-104 M1 cm1 (HABA4:avidin) ■ pokud se v prostředí nachází volný nebo vázaný biotin, vytěsní molekulu HABA z vazebného místa a proporcionálně se sníží absorbance ■ principem je rozdíl afinit obou molekul k avidinu, Ka je - 1,3-1015 M1 pro avidin - 6-106 M1 pro HABA ■ může být zajímavé porovnat získané hodnoty pro celý nativní biotinylovaný protein a pro stejný konjugát předem hydrolyzovaný např. pronasou na menší fragmenty - lze tak posoudit množství celkového a snadno dostupného biotinu v molekule konjugátu Biotin vážící místa Velmi užitečné může být stanovení vazebných míst pro biotin na imobilizovaných molekulách avidinu nebo streptavidinu derivát biotinu s p-nitrofenolem je bezbarvé činidlo, které se naváže na imobilizovaný avidin po opláchnutí nosiče se v alkalickém prostředí zhydrolyzuje esterová vazba a uvolněný nitrofenol je v tomto prostředí intenzívně žlutý jeho množství odpovídá biotin-vážícím místům, £410 = 18300 M1 cm1 MALDI 66425 matrix assisted laser A/W = 598 Da, tj. ' desorption ionization 600 (albumin)1(riapten)3 f\ v přítomnosti pomocné a.i. molekuly lze ionizovat i 400 proteinové konjugáty 67023 / \ i I \ - do asi 100 kDa - z MS spektra se určí mol. 200 albumin-hapten /Q*i V albumin J? \ hmotnost konjugátu - porovnáním s mol.hmotností výchozí bílkoviny se dá určit g i . i . i . i . i stupeň substituce 64 65 66 67 68 69 IWz (kDa) naštěpení konjugátu a výchozího proteinu sekvenčně specifickou endoproteasou (trypsin, štěpí na karboxy konci Arg a Lys) - úprava štěpů - redukce a alkylace - MALDI analýza štěpných produktů - "vymizení" určitého peptidu u konjugátu svědčí o modifikaci v jeho aminokyselinách - místo srovnávacího proteinu lze použít "teoretické" štěpení známé sekvence z proteinové databáze Enzymy jako bioligandy ■ mohou být barevné - peroxidasa - červená - flavinové oxidasy - žluté ■ v imunokonjugátech spolu s protilátkou či antigenem = tracer - vždy změřit enzymovou aktivitu konjugátu (kolik procent z původně přítomné aktivity se zachovalo = vhodnost způsobu konjugace) - stanovit také koncentraci bílkoviny (specifická enzymová aktivita) - v literatuře velmi často údaje typu X-krát zředěný tracer, aniž by se uvedla výchozí koncentrace... Chromatografické nosiče ■ běžné nosiče - schopné vázat volné aminoskupiny ligandů či biomolekul; určení výchozí vazebná kapacity: - derivatizace nosiče diaminem (ethylendiamin, 1,3-diaminopropan) - stanoví se množství získaných aminoskupin pomocí ninhydrinové reakce - slouží obecně pro kvantifikaci aminoskupin, zejména v případě aminokyselin - vzniká růžovofialové zbarvení, e570 = 8750 M1 cm1 Stanovení imobilizovaných bílkovin u bílkovin je výhodné použít jejich redukční vlastnosti v alkalickém prostředí vůči iontům Cu2+ - vzniklá jednomocná měď Cu+ se pak stanoví jako barevný komplex pomocí kyseliny bicinchoninové (BCA), Cu+(BCA)2 - reakce není příliš specifická a reagují také jiné redukující látky (aminy, hydrazidy, redukující cukry aj.) - zbarvení se měří při 560 nm HOOC COOH /-( /) -n ,n- Cu* — n' ~n— \—/ _// \—/ HOOC COOH kvalitativní průkaz přítomnosti bílkovin na modifikovaném nosiči lze také provést použitím Coomassie Blue 250 (Bradfordové činidlo), kdy vzniká adsorpční modrý komplex (595 nm) s imobilizovanými proteiny Imobilizace na povrch sensorů pro stanovení množství navázaného Ugandu omezeně použitelné i metody zmíněné pro pro biokonjugáty nebo chromatografické nosiče - komplikací je velmi omezená vazebná kapacita poskytující pouze malá množství stanovitelných barevných produktů imobilizace biomolekul na povrch přímých afinitních sensorů se ale velmi často provádí „online": - sleduje se změna specifického signálu v reálném čase - signál odpovídá množství biomolekul vázaných na povrch, je tak přímo výsledek imobilizace „vidět" a je ihned známo, jaké množství bioligandu se imobilizovalo - výhodou je jednoduchá možnost připravit citlivé povrchy s požadovanou hustotou bioligandu tímto způsobem fungují optické sensory na bázi rezonance povrchovým plazmonů (SPR) nebo piezoelektrické sensory (křemenné chemické mikrovážky, QCM) u QCM lze navázaný bioligand pohodlně přímo „zvážit" stanovením rozdílu rezonanční frekvence sensorů v suchém stavu před a po imobilizačním kroku rozdíl je přímo úměrný změně hmotnosti po navázání biomolekul Imobilizace v reálném čase ■ signál sensoru je úměrný množství navázaných biomolekul - záznam imobilizace tedy poskytne přesné informace o navázaném množství ukázka imobilizace protilátky na sensor lAsys (optický systém rezonančního zrcadla) - aktivace glutaraldehydem - vazba protilátky - vysycení zbylých vazeb, míst inertní bílkovinou - rozdíl signálu se bere v přítomnosti pufru, tím se vyloučí skoky signálu dané různým složením imobilizačních roztoků Sensor se silanizovaným povrchem (volné -NH2) glutaraldehyd I (aktivace) navázané množství Ab (bioligand) t (min) Zobrazení označeného Ugandu ■ imobilizovaný Ugand se označí pomocí např. fluorescenčně značené protilátky, obraz povrchu se získá pomocí fluorescečního mikroskopu nebo skeneru (nižší rozlišení) ■ ukázka zviditelnění imobilizovaného proteinu pomocí specifické protilátky značené fluoresceinem, sken intenzity a pseudoobarvení ■ porézní kontrolní porézní porézní kontrolní (elchem. oxidace) (ox. parami HF) povrchy Si Zobrazení modifikovaného povrchu mikroskopie na bázi meziatomoyých sil (AFM) poskytuje 3D „plastický" pohled na povrch - přítomnost imobilizovaných biomolekul lze hodnotit na základě profilometrické analýzy AFM obrazů tapping mod, image xy 500x500 nm histogram pro Z, z osa 0 až 5 nm La AFM measured height AA AFM measured height A AFM measured height ANon-specific I Specific antibody A antibody To je konec této přednášky...