Analýza a separace nukleových kyselin Literatura PCR Mullis figure 13-11 part 1 figure 13-11 part 2 PCR Mullis figure 13-11 part 3 Real time PCR Real time PCR proteinů Graphical abstract: The real-time PCR for sensitive protein detection by target-induced intermolecular hybridization Genetická daktyloskopie http://science.kennesaw.edu/~rrascati/images/PCRProcess.jpg Použití restrikčních enzymů - RFLP Restriction Fragment Length Polymorphism Short tandem repeats Short tandem repeats http://science.kennesaw.edu/~rrascati/images/powerplex.gif Short tandem repeats http://science.kennesaw.edu/~rrascati/images/genescan.jpg Testy paternity uZjednodušené testy u uSTR na Y chromosomu – mužských potomků srovnání s otcem u uMitochondriální DNA – dědí se po matce – matroklinní dedičnost Mitochondriální Eva DNA chipy DNA chipy DNA chipy F07-39.jpg 0005D57BMacintosh HD B74677AA: DNA chipy DNA chipy - barva skvrn • • • • • • • • • • DNA chipy - vybavení DNA chipy software F07-40.jpg 0005D57BMacintosh HD B74677AA: Proteinové chipy C:\My Documents\upstream.jpg Proteinové chipy – typy interakcí • • • • • • • • • • Protilátka Antigen Ligand •Detekce: SELDI MS, fluorescence, SPR, electrochemická, radioaktivity, •Lecture 1.1 •25 Anti-GST Probe Fig2ab Blotting uSouthern – DNA u uNothern – RNA u uWestern - bílkoviny Izolace nukleových kyselin Cíl izolace uOdstranění proteinů u uDNA vs RNA u uizolace specifického typu NK u Typy NK ugenomická (chromosomalní) u uorganelová (mitochondrie, chloroplasty) u uplasmidy (extra-chromosomalní) u uvirová (ds nebo ss) u ukomplementární (mRNA) u Nejpoužívanější metody una základě rozdílné rozpustnosti – extrakce, srážení u una základě vlastností - chromatografie – polarita- adsorpční, náboj-ionexová u usedimentace - gradientová ultracentrifugace Postup u1. Rozbití buněk a membrán pro uvolnění NK u u2. Inaktivace DNA- nebo RNA-degradujících enzymů (DNasy, RNasy). u u3. Separace NK od dalších komponent uvolněných z buňky. •Extrakce/Precipitace •Chromatografie •Ultracentrifugace u Extrakce/Precipitace •Organic extraction Brown p.28 •Izolace genomické DNA •Typická procedura •1.Sklizení buněk •2.Lyse buněk –0.5% SDS + proteinase K (55o několik hodin) •3.Fenolová extrakce –Jemné třepání několik hodin •4.Ethanolová precipitace •5.Působení RNAsy a proteinasy K •6.Opakování kroku 3 a 4. • • • •Hrubý lyzát obsahující NK a další součásti buňky • • •Smíchání vzorku s organickou fází ve stejném poměru. •e.g. phenol, chloroform, or phenol:chloroform • • • •Centrifugace •Vodná fáze obsahuje NK, organická fáze bílkoviny a lipidy. Nerozpustné složky přítomné v interfázi. •Opakovaná extrakce pro zvýšení čistoty •Použití vodné fáze • • •Extrakce/Precipitace •Krok 3: Organická extrakce •Organická fáze •Vodná fáze •Interfáze •Přidání EtOH a soli • • • • • • • • •Supernatant •Pelet •70% EtOH • • •Rozpuštění (H2O, TE, etc.) • •Krok 4: Precipitace NK •Extrakce/Precipitace •Před •Po •Centrifugace •Promytí •Centrifugace • 2-2,5 objem EtOH • -20o C • Vysoká I • pH 5-5.5 • Chromatografie Adsorpční chromatografie Adsorpční chromatografie • •Eluce zvýšením pH nebo vysokou I • Ionexová chromatografie •Vazba při nízkém pH nízké I Gradientová centrifugace • Diferenciální versus gradientová centrifugace •Separation of Nucleic Acids by CeCl Gradient Centrifugation cesium_chloride • •Plasmid DNA Brown p.44 •Izolace RNA - speciální přístupy •nutno použít inhibitory RNAsy • •extrakce guanidium chloridem • •fenolová extrakce při pH < 4 (pH 8 pro DNA) • •působení RNase-free Dnase • •selektivní precipitace rRNA, mRNA s LiCl • •oligo-dT afinitní chromatografie - mRNA Kontrola čistoty a kvantifikace NK •genomická •DNA • •DNA •(degradovaná) •Kontrola degradace: DNA •Kontrola degradace: RNA •25S •18S