Lekce 5 ENV012 ChBHazMat Detekce Principy biologické detekce Ing. Pavel Častulík, CSc castulik@recetox.muni.cz Jaro 2012 Příprava tohoto předmětu je spolufinancována Evropským sociálním fondem a státním rozpočtem České republiky 1ENV012, Jaro 2012 Principy biologické detekce Příprava tohoto předmětu je spolufinancována Evropským sociálním fondem a státním rozpočtem České republiky 2ENV012, Jaro 2012 OSNOVA •Infekční agens •Bakteriologická detekce 3Příprava tohoto předmětu je spolufinancována Evropským sociálním fondem a státním rozpočtem České republikyENV012, Jaro 2012 4 EBOLA STAFYLOCUS ENTEROTOXIN B RICIN MOR NEŠTOVICE ANTRAX VIRYVIRY BAKTERIEBAKTERIE TOXINYTOXINY ENV012, Jaro 2012 5 NeštoviceNeštovice--viryviry  Vstup infekce: Inhalační  Inkubační doba: 10-12 dní  Nákaza přenosná  Úmrtnost: 30% (inhalační nákaza)  Symptomy: Horečky/zimnice Vrhnutí Bolesti hlavy/Bolesti zad Puchýře za 2-3 dny ENV012, Jaro 2012 6 EbolaEbola--viryviry  Vstup infekce: Přímý kontakt  Inkubační doba: 3-21 dní  Nákaza přenosná  Úmrtnost: 90%  Symptomy: Horečky/zimnice Vrhnutí Krvavé skvrny na kůži Krvácení ENV012, Jaro 2012 7 MorMor--bakteriebakterie  Vstup infekce: Kousnutí blech  Inkubační doba: 2-3 dny  Nákaza přenosná  Úmrtnost: 90%-100% (inhalační nákaza)  Symptomy: Bolesti hlava Dýchací potíže Vysoké horečky/zimnice Chrlení krve ENV012, Jaro 2012 8 BacillusBacillus AnthracisAnthracis dobře znám jako teroristický prostředekdobře znám jako teroristický prostředek ENV012, Jaro 2012 9 AnthraxAnthrax--spory/bakteriespory/bakterie  Vstup infekce: Dýcháním nebo poškozenou pokožkou  Inkubační doba: 1-7 dní  Nákaza nepřenosná  Úmrtnost: 80%-90% (inhalační nákaza)  Symptomy: Rýma Horečka/pocit chladu Zduření lymfatických uzlin ENV012, Jaro 2012 10 Anatomie spory antraxuAnatomie spory antraxu Core Spore coat Exosporium Basal layer Nap B. anthracis spore Cortex ENV012, Jaro 2012 11 Detekce bakteriologických látekDetekce bakteriologických látek  Lidé jsou vnímavý a citlivý na bakteriologické expozice a v převážných případech jedinými subjektivními biodetektory vůbec.  Prvotní klinické nálezy mohou být nespecifické nebo atypické ve srovnání s přírodními onemocněními. Tudíž zdravotníci-hygienici- infekční služba nemusí v počátcích být schopni odlišit přírodní onemocnění od bakteriologického útoku.  Objektivní instrumentální detekce bakteriologických je ztížena stále omezenými technologickými možnostmi ve vztahu k potřebné rychlosti detekce a specifičnosti. ENV012, Jaro 2012 12 Detekce bakteriologických látekDetekce bakteriologických látek IndikátoryIndikátory  Existují odlišnosti mezi přírodním průběhem epidemií a bakteriologickým útokem:  Epidemická křivka kulminuje během hodin (použití toxinů) nebo několika dnů (mikroorganizmů) a počet obětí narůstá trvaleji  Může být souběžný výskyt onemocnění v různých místech  Geograficky atypické onemocnění  Vysoký výskyt zasažení respiračního systému (expozice aerosoly-antrax)  Oběti se vyskytují po směru převažujícího větru  Menší poměr zasažených osob pracujících ve vnitřních prostorech vybavených ventilací oproti osobám z vnějšího prostředí (nebo zcela naopak, pokud bioútok byl směřován do budov).  Zvýšený počet nemocných zvířat, často různých druhů  Velké množství smrtelných případů obětí s omezenými příznaky souvisejících s velkou expozicí v blízkosti útoku  Svědci útoku a nalezení důkazů o použití prostředků a zařízení k provedení záměrného útoku ENV012, Jaro 2012 13 DiagnózaDiagnóza--odběr vzorkůodběr vzorků  Diagnóza skutečné bakteriologické expozice oběti je časově náročná a vyžadující převážně laboratorní vybavení  Pro stanovení diagnózy je velmi důležité provedení odběrů environmentálních a biologických vzorků a jejich rychlé vyhodnocení jak na místě tak zejména v laboratorních podmínkách ENV012, Jaro 2012 14 Odběry biologických vzorkůOdběry biologických vzorků ENV012, Jaro 2012 15 Balení a transport vzorkůBalení a transport vzorků ENV012, Jaro 2012 16 BioBio--IdentifikaceIdentifikace--metodymetody  Izolace infekčních kultur (1 až 2 dny)  Detekce toxinů GC-MS nebo zvířecí inokulací  Antibody detekce (specifický immunoglobulin M se může objevit během 3 dnů)  Detekce antigenů enzymatickou nebo jinou citlivou zkouškou  Detekce genomu s použitím DNA vzorků  Detekce metabolických produktů infekční nebo toxické látky v klinických vzorcích ENV012, Jaro 2012 17 BioBio--detektor na tenké vrstvědetektor na tenké vrstvě ENV012, Jaro 2012 18 BioBio--detektor na tenké vrstvědetektor na tenké vrstvě ENV012, Jaro 2012 19 Automatický bio-detektor ENV012, Jaro 2012 20 Detekce bioDetekce bio--látek na magnetickýchlátek na magnetických nosičíchnosičích I. Navázaní spor na magnetické mikročástice s markerem II. Spory na magnetickém nosiči jsou magneticky separovány/shromážděny III. Nenavázané markery jsou odstraněny výplachem IV. Shromážděné označené spory na magnetických mikročásticích jsou vybuzeny Světlem a jejich emitované záření je detekováno ENV012, Jaro 2012 21 QTL Biosensor Assay TechnologyQTL Biosensor Assay Technology I. Spory jsou smíchány s reagenty obsahující magnetické kulové mikročástice a fluoroscenční markery ENV012, Jaro 2012 22 QTL Biosensor Assay TechnologyQTL Biosensor Assay Technology II. Indikační materiály se naváží na spory v průběhu míchání a inkubační doby ENV012, Jaro 2012 23 QTL Biosensor Assay TechnologyQTL Biosensor Assay Technology III. Roztok je zmagnetizován a všechen navázaný i nenavázaný magnetický materiál je zachycen na magnetickém povrchu ENV012, Jaro 2012 24 QTL Biosensor Assay TechnologyQTL Biosensor Assay Technology IV. Nenavázané markery zůstávají v roztoku a jsou odstraněny vypláchnutím ENV012, Jaro 2012 25 QTL Biosensor Assay TechnologyQTL Biosensor Assay Technology V. Kuličky jsou vybuzeny světelným zdrojem •Navázané markery vysílají světelné záření •Emitované světlo je zesíleno a dále zpracováno ENV012, Jaro 2012 26 Konečný výsledek detekceKonečný výsledek detekce •Zachycená a označená spora Značkovaná spora Magnetická mikrokulička ENV012, Jaro 2012 27 <0.5 ng detekováno během 5 minut Detekce toxinuDetekce toxinu SEBSEB 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 RFU(mV) 0ng 0.25ng 0.5ng 5ng SEB (ng) SEB Detection Results QTL Limit of Detection < 0.5 ng ENV012, Jaro 2012 28 < 10,000 spor detekováno během 5 minut DetekceDetekce BacillusBacillus AnthracisAnthracis LODLOD 0 100 200 300 400 500 600 0k Ba 5k Ba 10k Ba 50k Ba 100k Ba Sample Bacillus anthracis (Sterne) Results QTL Detection Limit = ~5,000 spores RFU ENV012, Jaro 2012 29 Detekce toxinu ricinuDetekce toxinu ricinu < 1 ng detekováno během 5 minut 0.00 100.00 200.00 300.00 400.00 500.00 600.00 RFU(mV) 0ng/mL 10 ng/mL 50 ng/mL 100 ng/mL 200 ng/mL Sample Ricin Assay Sensitivity (QTL Limit of Detection < 1ng) ENV012, Jaro 2012 30 … QTL BIOSENSORQTL BIOSENSOR ENV012, Jaro 2012 DOTAZY Příprava tohoto předmětu je spolufinancována Evropským sociálním fondem a státním rozpočtem České republiky31ENV012, Jaro 2012 ZÁVĚRY Příprava tohoto předmětu je spolufinancována Evropským sociálním fondem a státním rozpočtem České republiky32ENV012, Jaro 2012 ZÁVĚRY 33ENV012, Jaro 2012