VYUŽITÍ METOD FLUORESCENCE CHLOROFYLU PŘI STUDIU PATOGENEZE ROSTLIN Martina Špundová, Miloš Barták Katedra experimentální fyziky Laboratoř biofyziky PřF UP Olomouc OFAR, ÚEB, PřF MU OBSAH PŘEDNÁŠKY 1.fluorescence chlorofylu – využití při studiu stresů rostlin 2.rostlinné patogeny – rozdělení, základní pojmy 3.patogeneze a fotosyntéza 4.využití metod fluorescence chlorofylu při studiu patogeneze 5. základní stav molekula chlorofylu foton excitovaný stav FLUORESCENCE PŘENOS ENERGIE TEPLO CO SE DĚJE PO ABSORPCI FOTONU MOLEKULOU CHLOROFYLU? FLUORESCENCE CHLOROFYLU V LISTU FOTOSYNTÉZA TEPLO FLUORESCENCE antény (LHC) reakční centrum e- akceptor e- donor (H2O) STRESOVÉ FAKTORY ABIOTICKÉ - sucho - extrémní teploty - nadměrná ozářenost - toxické látky ve vzduchu a v půdě - nedostatek živin poust zima STRESOVÉ FAKTORY BIOTICKÉ - vzájemné ovlivňování rostlin (např. parazitismus) - patogenní organismy housenka - herbivoři jmeli SYSTÉMOVÁ REAKCE ROSTLINY LOKÁLNÍ POŠKOZENÍ REAKCE CELÉ ROSTLINY - spuštění ochranných reakcí - rezistence vůči patogenu signály fytohormony změny elektrického potenciálu reaktivní formy kyslíku ROSTLINNÉ PATOGENY –viry –baktérie –houby -protozoa -nematody ROSTLINNÉ PATOGENY –nekrotrofní – –- získávání organických látek z usmrcených buněk hostitele – – biotrofní - získávání organických látek z živých buněk hostitele fakultativní - schopnost přežívat po určitou dobu mimo hostitele obligátní - bez schopnosti přežít mimo hostitele ROSTLINNÉ PATOGENY –imunita = rostlina nedotknutelná daným patogenem (nehostitel) –infektibilita = rostlina infikovatelná patogenem (hostitel) – –náchylnost („susceptibility“) = náchylnost rostliny k infekci, neschopnost bránit se invazi patogena –rezistence = schopnost rostliny potlačit nebo oddálit invazi patogena – –tolerance (snášenlivost) = schopnost infikované rostliny snášet patogenní infekci (částečná nebo úplná absence příznaků a poškození) –citlivost („sensitivity“) = neschopnost infikované rostliny snášet činnost patogenního organismu (symptomy, poškození) ROZVOJ A MÍRA NEMOCI rozvoj a míra nemoci OBECNÉ MECHANISMY PŮSOBENÍ ROSTLINNÝCH PATOGENŮ •narušení metabolismu hostitelské buňky látkami produkovanými patogenem (toxiny, enzymy, růstové regulátory…) • •spotřeba živin a asimilátů • •ucpání vodivých pletiv (inhibice transportu vody a živin) •SOUVISLOST S FOTOSYNTÉZOU • •chlorózy •poškození listových pletiv, opad listů •přímý vliv na chloroplasty (toxiny) •pokles aktivity Rubisco •redukovaný růst a výnos • OBECNÉ MECHANISMY PŮSOBENÍ ROSTLINNÝCH PATOGENŮ •BIOTROFNÍ PATOGENY • •příjem živin z (živých) buněk hostitelské rostliny •vliv na fotosyntézu nepřímý •spuštění (urychlení) senescence •model: • OBECNÉ MECHANISMY PŮSOBENÍ ROSTLINNÝCH PATOGENŮ napadení patogenem inhibice exprese fotosynt. genů invertázová aktivita pat. nárůst respirace a exprese invertázy inhibice fotosyntézy akumulace hexóz aktivace obranné reakce živiny a signály pro rostlinu živiny a signály pro patogen Berger et al. 2007, J Exp Bot 58, 4019-4026 rychlá pomalá BIOTROFNÍ HOUBOVÉ PATOGENY • • •mycelium, haustoria, conidiofory • •epidermální buňky, buňky mezofylu • • • cyklus plisen salatova cyklus plisen salatova • •zpětnovazebná inhibice fotosyntézy: • •nárůst NPQ (nárůst DEPS) •inhibice lineárního elektronového transportu •pokles účinnosti fotochemie PSII INHIBICE FOTOSYNTÉZY PŘI PATOGENEZI = MOŽNOST VYUŽITÍ METOD FLUORESCENCE CHLOROFYLU FLUORESCENČNÍ INDUKCE CHLOROFYLU V LISTU tma světlo čas (min) tma Výrazná heterogenita v rámci rostliny – listu ! FLUORESCEČNÍ INDUKCE NPQ FPSII zdravý zdravý infikovaný infikovaný čas čas FLUORESCENČNÍ KAMERA Photon Systems Instruments, spol. s r.o., CZ MF1 Fluorescence QA- 750 LED’s are on for 10-200 ms Only few PSII RC’s are excited Yet, sufficient fluorescence emission is produced to capture an image Measuring flashes have little actinic effects © Photon Systems Instruments, spol. s r.o., CZ In its standard “closed” version, FluorCam generates measuring flashes from 750 orange light-emitting diodes. The flashes last typically no longer than several tens of microseconds, so that actinic effects are minimal and, yet, sufficient fluorescence is excited. The CCD camera is gated in synchrony with the measuring flashes so that the background signals are not interfering with the measurement. MF+A QA- QA- QA- QA- QA- QA- During the actinic light exposure, the continuous excitation keeps some of the PSII RC’s closed LEDs are on for seconds to minutes Actinic light is causing fluorescence induction © Photon Systems Instruments, spol. s r.o., CZ The actinic light of FluorCam elicits photochemical reactions of a moderate rate so that the Kautsky effect can be measured. During the measurement, the fluorescence increases from the low F[0]level to the peak F[P] and declines to a steady-state level afterwards. The initial fluorescence increase reflects the transient saturation of the photosynthetic electron transport chain caused by the bright actinic light exposure. At the peak fluorescence emission a large fraction of the Photosystem II reaction centers is unable to perform photochemical charge separation as they are in a closed state with the Q[A] acceptor reduced. MF1 Before the pulse During the pulse, PSII RC’s are closed by a transient reduction of the plastoquinone pool. The shutter of the halogen lamp is open typically for 1s Mf+A+SF QA- QA- QA- QA- QA- QA- QA- QA- QA- QA- QA- QA- QA- QA- QA- QA- PQ-reducing super pulse © Photon Systems Instruments, spol. s r.o., CZ The fluorescence can be brought to its maximal level F[M] also by a saturating pulse of light that transiently closes all PSII reaction centers. Fluorescence before the pulse F0 Open PSII reaction centers The closure of all PS RC’s is reflected by a transient from F0 to FM. Fluorescence at the end of the pulse FM QA- QA- QA- QA- QA- QA- QA- QA- Fluorescence in PQ-reducing super pulse © Photon Systems Instruments, spol. s r.o., CZ Before the saturating pulse, the reaction centers are open, their photochemical yield is maximal and, therefore, the fluorescence yield id low (F[0]). The saturating pulse closes all the PSII centers bringing the photochemical yield to its minimum and fluorescence emission to its maximum (F[M]). Phytotoxin response visualized by fluorescence horcice_LN 2 Sinapis alba 60 h, 2000 mg/l destruxin Brassica oleracea 60 h, 0-500 mg/l destruxin 0.05 mg/l 0 mg/l 0.5mg/l 50mg/l 500mg/l F0/FM F0/FM Brassica blackspot is one of the most damaging fungal diseases of Brassica crops. The fungus is producing phytotoxic cyclodepsipeptides called destruxins. Destruxins cause chlorotic and necrotic foliar lesions on diverse Brassica species and other cruciferous host plants. The left panel shows the F[0]/F[M] fluorescence image of Sinapis alba leaf exposed for 60 hours to 10ml drop of 1% DMSO without destruxins (control) and with 2000 mg/l of destruxins. The right panel shows F[0]/F[M] of a leaf of Brassica oleracea incubated also for 60hours with various concentrations of destruxins in 1% DMSO. Green mold infection of lemons (Penicillium digitatum) Color photographs Time after infection 0 h 48 h 66 h 84 h F0 FV Under controlled conditions, a healthy lemon was infected by a needle bringing green mold into a tiny puncture. The first visible symptoms of the infection occurred 66 to 84 hours after the infection whereas the first increase of F[0] fluorescence and decrease of F[V] fluorescence was detected 48 hours after the infection. VLIV PATOGENNÍ HOUBY patogen2 infikovaný list pšenice patogen3 INDUKCE FOTOSYNTETICKÉHO ELEKTRONOVÉHO TRANSPORTU kontrolní list pšenice Dr. J. Scholes, Department of Animal and Plant Sciences, University of Sheffield •okurka (Cucumis sativus L.) –děložní listy – – •„powdery mildews“ –Erysiphe cichoracearum –Sphaerotheca fuliginea – – – MODELOVÝ SYSTÉM I: okurka + powdery mildew MODELOVÝ SYSTÉM II: salát (Lactuca sativa) a Bremia lactucae - Bremia lactucae (downy mildew) symptomy: - chlorózy ohraničené žilnatinou - 7 - 14 dní po inokulaci – sporulace na adaxiální straně listů salatplisen Asparagus22 -the fungus Bremia lactucae causes lettuce downy mildew. Downy mildew is a serious disease of lettuce that occurs worldwide. - the fungus is the biotrophic pathogen, i.e., it is capable of infecting and colonizing only living host tissue. - Leaf symptoms of downy mildew first show as angular, pale yellow patches which are delineated by leaf veins. The underside of the leaf opposite the yellow patch will show white masses of spores from 7 to 14 days after infection. As the spore mass grows larger, it takes on a white, downy appearance; hence the name downy mildew. - As the disease spreads, the upper side of the leaves may also show the downy white fungus growth. - Downy mildew can reduce yields and quality of the crop. Infected wrapper leaves must be removed at harvest. - Downy mildew damaged leaf tissue can be an entry site for secondary rot producing organisms. These rot organisms may compound crop losses in the field, and can also cause losses later when the lettuce is in transit. Bremia lactucae cyklus plisen salatova cyklus plisen salatova - intercelulární mycelium - haustoria v mezofylových buňkách živiny - conidium (or spore) germinates and enters the lettuce leaf through the epidermal cells or through stomata - fungal mycelium grows in intercelular spaces, and haustoria penetrate to mesophyll cells and utilize nutrients from these cells. Downy mildew is spread by the formation and dissemination of tiny spores called conidia or sporangia. The sporangia are on small tree-like structures which emerge through stomata in the leaf surface. - clusters of these tree-like structures represent the white cottony-like growth that can be observed without magnification on the abaxial leaf surface of mildew lesions. - Spores of B.l. may infect, colonize, and produce a second generation of spores in as few as 5 to 7 days. -sporulation and infection by downy mildew are favored by relatively cool temperatures and high relative humidity. Fig.:B.l. sporangiophore with sporangia (200x magnificated) Lactuca sativa + Bremia lactucae aktivita PSII (13 dní po inokulaci) FIG2 Lactuca sativa + Bremia lactucae aktivita PSII; NPQ FIG5 Lactuca sativa + Bremia lactucae aktivita PSII NPQ FIG1_500dpi Lactuca sativa + Bremia lactucae aktivita invertázy Lactuca sativa + Bremia lactucae •inhibice funkce PSII a el. transportu Ü inhibice Calvinova cyklu Ü akumulace hexos Ü nárůst aktivity invertázy • •vliv světelných podmínek • Lycopersicon spp. + Oidium neolycopersici Lycopersicon esculentum cv. Amateur (náchylný) - - - - - 9 dní po inokulaci MODELOVÝ SYSTÉM III: Lycopersicon chmielewskii (středně rezistentní; HR) Oidium neolycopersici (powdery mildew) - mycelium na povrchu listů - haustoria v epidermálních buňkách Lycopersicon spp. + Oidium neolycopersici L. esculentum: účinnost PSII; NPQ Fig 2 Lycopersicon spp. + Oidium neolycopersici L. esculentum: účinnost PSII; NPQ Fig3new Lycopersicon spp. + Oidium neolycopersici L. chmielewskii: účinnost PSII; NPQ Fig 5 Lycopersicon spp. + Oidium neolycopersici L. chmielewskii: účinnost PSII; NPQ Fig6new Lycopersicon spp. + Oidium neolycopersici L. chmielewskii: NPQ Fig6new změny ve fluorescenci (fotosyntéze) – souvislost s hypersenzitivní reakcí? Lycopersicon spp. + Oidium neolycopersici - infekce způsobila u obou genotypů pouze nevýraznou inhibici fotosyntézy - - teplotní ošetření neovlivnilo rezistenci L. chmielewskii - - teplotní ošetření zvýšilo citlivost L. esculentum k infekci Ü akumulace hexos (?) Ü nárůst aktivity invertázy (?) - VYUŽITÍ METOD FLUORESCENCE CHLOROFYLU PŘI STUDIU PATOGENEZE ROSTLIN •změny fluorescenčních parametrů odrážející změny ve fotosyntéze indukované infekcí • •nedestruktivní měření • •možnost detekce heterogenity změn fotosyntézy v infikovaném pletivu • •