Práce s bakteriofágem
Cíl: Stanovit titr fágového lyzátu metodou dvouvrstvého agaru


Bakteriofágy
•Podskupina virů infikující bakterie → menší než bakterie
•Velice početná skupina
•Užívání i k léčbě – vyhubí bakterie
•Rozdíly v rozmezí hostitele
•Virulentní X temperované fágy – jiný životní cyklus
•
•
phage1

bakteriofag-_schema 66 300px-Bakteriof%C3%A1g



Životní cyklus fága
bacteriophage_life_cycle


sfmb2e_eTopic_1003_1
Virulentní fág – lytický ŽC
1.Adsorpce virionu na povrch citlivé buňky
2.Penetrace nukleové kyseliny do buňky
3.Replikace fágové DNA, syntéza bílkovin fága a kompletace nových virionů
4.Uvolnění virionů do prostředí – lyze buňky
5.Infekce další buňky
6.
•tekuté médium – projasnění, tzv. fágový lyzát (zbytky buněk, virové částice, nenapadené buňky,
vylité obsahy buněk)
•nárůst na misce – plaky
•Plaka = potomstvo 1 fágové částice

Tvorba plak
základem je mít buňky ve větším množství než fágové částice,
aby se fágy mohli pomnožit

Příprava fágového lyzátu
•2 ml narostlého 24h inokula S.aureus SA 812 očkujeme do 100 ml čerstvého MPB v provzdušňovací
lahvi a za intenzivního provzdušňování pokračujeme v kultivaci další 4h při stejné teplotě (30°C)
•
•Po 4h asepticky přidáme 10 ml sterilního 0,22% CaCl2 a 5 ml zásobního lyzátu fága 812 a
pokračujeme v kultivaci
•
•Po 60 min přemístíme provzdušňovací láhev do temna a pokojové teploty
•
•Za 12 - 24h se médium vyčeří, ale zůstane určitý počet necitlivých buněk, proto se lyzát
sterilizuje přídavkem chloroformu (5 - 10 kapek na 10 ml lyzátu) 1 - 2 hod
•
•Lyzát se přenese do baňky a uchovává se při 4°C (v této formě se významně nemění počet aktivních
fágových částic po dobu 1 - 2 měsíců)

Příprava hostitelských buněk
•ze zásobní kultury S.aureus SA 812 naočkujeme 20 ml sterilního MPB (ve 100 ml baňce) a kultivujeme
24 hodin při teplotě 30°C

Stanovení počtu virionů
•Lyzát fága 812 zředíme ve sterilním Tris HCl pufru
• (0,1 ml lyzátu / předchozího ředění do 0,9 ml pufru, na každé ředění používáme čistou pipetu,
dobře mícháme)
•
•Připravíme si sterilní zkumavky, které budou obsahovat 3 ml 0,7% MPA, rozvařeného a
vytemperovaného na 45°C
•
•K hostitelským buňkám se sterilně přidají 2 ml 0,22% CaCl2 (do 20 ml), poté se pipetuje 0,3 ml
inokula do každé zkumavky
•
•Na misky s 2% MPA se pipetuje 0,1 ml příslušných ředění fága
•
•Miska se ihned zalije obsahem jedné zkumavky, krouživým pohybem se agar promíchá s napipetovanou
kapkou a ve vodorovné poloze nechá utuhnout
•
•kultivace při 30°C 12 - 24 hodin

Hodnocení
•počítáme počet plak na miskách s nejvhodnějším ředěním
• (20 – 200; méně než 10 plak nehodnotíme)
•
• Výsledek je v PFU/ml
•
•Příklad výpočtu:
•Na 3 Petriho miskách naočkovaných 0,1 ml vzorku ředěného 10-5 se vytvořil následující počet plak:
122, 132, 139.
• Aritmetický průměr z těchto hodnot je 131.
•
•Titr lyzátu je:
• 131 * 105 = 1,31 * 107 v 0,1 ml tedy 1,31 . 108 v 1 ml neředěného vzorku
•
• Toto číslo ve skutečnosti vyjadřuje počet fágových částic schopných vytvářet plaky, nikoliv
absolutní počet virionů, výsledek se proto uvádí v tzv. PFU = plaques forming units.
• Titr našeho fágového lyzátu je tedy 1,31 . 108 PFU/ml.