Bacillus cereus Bacillus cereus je grampozitivní neopouzdřená pohyblivá sporotvorná tyčinka. Je to fakultativní anaerob s poměrně velkými vegetativními buňkami (1 x 3 až 5). Patří mezi saprofytické bakterie. Roste v teplotním rozmezí 8 – 55˚C, optimálně při 28 – 35˚C a není zaznamenána žádná tolerance pro vodní aktivitu (min. ~ 95) nebo pH. Rozpětí hodnot pH umožňující ještě růst je přibližně 4,9 – 9,3. Spory jsou centrální, elipsoidního tvaru a nezpůsobují zduření sporangia. Jako sporotvorný mikroorganismus je B. cereus široce rozšířený v okolním prostředí. Převážně se vyskytuje v půdě, ve vodě a na rostlinách. Z této „všudypřítomnosti“ plyne skutečnost, že je běžnou součástí střevní mikroflory člověka. Spory vykazují různou teplotní odolnost. D hodnoty se pohybují při 95˚C ve fosfátovém pufru od 1 do 36 minut (resistence se mění se serotypem). Jiné zdroje uvádějí D hodnotu při 100˚C 5 minut. B. cereus je kultivačně nenáročný. Roste na běžných médiích, na krevním agaru vyrůstá ve velkých, drsných koloniích s nepravidelnými okraji, obklopených zónou β-hemolýzy. B. cereus je producentem řady toxinů a enzymů. První skupinu tvoří fosfolipázy C, které štěpí fosfatidylcholin, fosfatidylinositol a sfingomyelin. Dále jsou to dva hemolysiny. Hemolysin I (Cereolysin) je oxygenlabilní a je letální pro myš. Hemolysin II je oxygenstabilní. Průjmový toxin vedle svojí enterotoxické aktivity zvyšuje permeabilitu cév, je nekrotizující a letální pro myš. Druhým toxinem je emetický toxin, který je vysoce termostabilní, odolný vůči pH a proteázám. Může způsobovat onemocnění z potravin. Onemocnění vzniká po požití kontaminovaných potravin enterotoxinogenním kmenem a z kontaminovaných kosmetických přípravků, či očních kapek. Vyskytuje se ve dvou klinických formách: 1. Průjmová forma nastává po inkubaci 8 – 24, spojuje se s konzumací masových pokrmů a omáček a je podobná otravě, kterou vyvolal Clostridium perfringens. 2. Emetická začíná 1 – 6 hodin po požití kontaminované potravy a je dávána do souvislosti s požitím rýžových pokrmů a těstovin. Podobnost s otravou, kterou způsobil Staphylococcus aureus. Tvorba toxinů byla zjištěna i u některých kmenů Bacillus subtilis. Bacillus anthraci je původcem onemocnění lidí a zvířat, jež je nazýváno snětí slezinnou. K otravám dochází při pomnožení B. cereus v potravině na koncentraci buněk 10^7 g^-1 potraviny (u dětí stačí koncentrace 10^5 g^-1). Povolený výskyt této bakterie je legislativně upraven § 19 písm. b) zákona č. 110/1997 Sb., o potravinách a tabákových výrobcích, vyhláškou o mikrobiologických požadavcích na potraviny, způsobu jejich kontroly a hodnocení č. 294/1997 Sb. Vyhláška udává tento povolený výskyt: Mikroorganismus Kategorie potravin Nejvyšší mezní hodnota Bacillus cereus potraviny neurčené k přímé spotřebě potraviny určené k přímé spotřebě potraviny určené pro kojeneckou a dětskou výživu 10^5/g 10^4/g 10^2/g Tato vyhláška také upravuje hodnoty tolerované při stanovování u některých vybraných potravin. Ojediněle může způsobovat onemocnění u hostitele s výrazně sníženou imunitou, tak může vyvolat meningitis, endokarditis, endophtalmitis, konjunktivitis nebo akutní gastroenteritis. Je též původcem oportunitních infekcí. PRŮJMOVÝ A EMETICKÝ TOXIN Jak průjmový, tak i emetický toxin jsou enterotoxiny. Toxin průjmového onemocnění je tepelně nestabilní protein s molekulovou hmotností 38000 – 46000. Je citlivý na proteolytické enzymy jako jsou trypsin a pepsin a je produkován během pozdní exponencionální fáze růstu. Zbývá objasnit, zda v případě otrav je toxin produkován v potravině nebo trávicí soustavě. Molekulová hmotnost emetického toxinu je menší než 10000. Je tepelně odolný (stabilní při 126˚C po 90 minut) a je odolný k proteolytickým enzymům a nízkému pH. Produkce toxinu probíhá v potravině od pozdní exponenciální do stacionární fáze růstu a může být spojena se sporulací. Jednotlivé vlastnosti obou toxinů shrnuje následující tabulka. Vlastnost Průjmový toxin Emetický toxin Molekulová hmotnost 38000 - 46000 (protein) < 10000 (peptid) Isoelektrický bod 4,9 - 5,6 - Stabilita teplotní tepelně stabilní 45˚C, 30 min. stabilní126˚C, 90 min. nestabilní 56˚C, 5 min. pH nejstabilnější při pH 4 - 11 stabilní při pH 2 - 11 proteasy citlivý na pronasu, trypsin a pepsin citlivý na trypsin a pepsin Produkce V potravině předvytvořen (?) předvytvořen Optimální teplota 32 - 37˚C 25 - 30˚C Růstová fáze pozdní exponencionální pozdní exponencionální-stacionární (spojení se sporulací ?) Biologická aktivita myši letální ? opice průjem do 1 - 3 hod. zvracení do 1 - 5 hod. VÝSKYT-SPOJENÍ S POTRAVINAMI Schopnost tvořit spory resistentní k činitelům jako jsou sušení a teplo vede k tomu, že onemocnění způsobující bacili jsou široce rozšíření v potravinách. Ve většině případů však jsou pouze malou částí mikroflory a nejsou přítomni v počtu dostatečném k vyvolání onemocnění. Vysoký výskyt B.cereus je znám v pasterovaném a jinak tepelně ošetřeném mléce (typické je 35 – 48% pozitivních vzorků) ve srovnání s mlékem neošetřeným (~ 9% pozitivních). V tomto případě tepelné zpracování spíše napomůže sporotvorným mikroorganismům. Ve většině případů byly detekované počty nízké (< 10^3 ml^-1 ), ale jestliže je pasterizované mléko nebo smetana skladována při nedostatečně nízké teplotě, B. cereus může růst a způsobovat kažení známé jako „sladké srážení“ nebo „hořknutí smetany“. Přesto jsou mléko a mléčné výrobky zřídka spojovány s onemocněním způsobeným B. cereus, ačkoli sušené mléko mělo za následek propuknutí nákazy, když se použilo na výrobu některých potravin, jako např. některých druhů cukrovinek. Rezistence spor k vysoušení jim dovoluje přežít na suchých potravinách jako jsou obiloviny a mouka. Propuknutí otrav v Norsku (popsáno v úvodu) měla za následek kukuřičná mouka, která byla použita k zahuštění vanilkové omáčky. Normální zahřátí během přípravy neinaktivovalo spory a následné dlouhodobé skladování omáčky při vysoké aktivitě vody a pokojové teplotě přispělo ke klíčení spor a nárůstu mikroorganismu. Nejčastější příčinou otrav emetickým toxinem jsou potraviny obsahující škrob, jako je rýže a těstoviny. V Anglii je onemocnění nazýváno „syndrom čínské restaurace“. Velké množství rýže uvařené na několik dní dopředu je ideálním prostředím k pomnožení B. cereus. Spory, běžněji ty tepelně odolnějšího serotypu 1, přežívají předvaření. Pak následuje jejich klíčení, růst a produkce emetického toxinu v potravině během skladování. Tomu se dá předejít snížením teploty rýže pod 8˚C, ale úroveň chlazení uvnitř uvařeného množství rýže, dokonce i když je přemístěna do chladírny, může být příliš malá pro zastavení růstu a produkce toxinu. Opětné zahřátí rýže před podáním neinaktivuje emetický toxin a nepřispěje k bezpečnosti. Průjmový syndrom může mít za následek větší škála potravin, včetně masových výrobků (např. játrová paštika), polévek, zeleniny, pudingů a omáček. Sušené byliny a koření, které se používají při přípravě pokrmů, mohou být významným zdrojem B. cereus, což bývá relativně častým důvodem vysokého výskytu tohoto onemocnění v Maďarsku. V letech 1960 – 1968 to zde byla třetí nejběžnější příčina onemocnění z potravin, která postihla 15,2% lidí. Čerstvější údaje naznačují, že se jeho význam poněkud snižuje, ale zda je to změnami v kulinárních úpravách, zlepšením hygieny, poklesem kontaminace koření nebo nedostatečností statických údajů, není známo. ISOLACE A STANOVENÍ Při identifikaci nejsou nutné nahromaďovací techniky, protože napadená potravina obsahuje B. cereus ve větším množství (>10^5 g^-1). To stejné platí pro vzorky fekálií nebo zvratků a používá se tedy neselektivní medium jako například krevní agar (v některých případech se přidává polymyxin, které má funkci selektivního činidla k potlačení gramnegativity). B. cereus může být detekován po 24 hodinách inkubace při 37˚C díky jeho charakteristické morfologii kolonií. Typická je jejich velikost (průměr 3 – 7 mm), jsou ploché nebo nepatrně zvýšené, šedozelené charakteristicky zrnité nebo půdně-skleněné. V okolí kolonií se vytváří zóna α nebo β hemolýzy. Chceme-li potvrdit, že jsme na krevním agaru skutečně izolovali B. cereus, nebo je naším cílem izolovat malá množství tohoto mikroorganismu v potravinách, musíme použít více selektivně-diagnostický agar. Tyto půdy využívají tří základních vlastností B. cereus: resistence k antibiotiku polymyxin, neschopnost zkvašovat mannitol, produkce lecithinasy (fosfolipasy). Jedním z nejvíce používaných je médium PEMBA (polymyxin / pyruvát / vaječný žloutek / mannitol / bromthymolová modř agar). Polymyxin, který je zde obsažen, potlačí růst jiných bakterií. Pokud by se stala problémem přítomnost kvasinek nebo plísní, může agar obsahovat také actidion. Na médiu PEMBA vytváří B. cereus typické vroubkované kolonie, které zadrží tyrkysovou modř pH indikátoru (bromthymolová modř) z důvodu neschopnosti zkvašovat mannitol. Kolonie jsou obklopeny zónou žloutkovaječného srážení, které způsobila lecithinasová aktivita. Přítomnost pyruvátu v médiu zlepší reakci srážení vaječného žloutku a nízká úroveň peptonu zvýší sporulaci. Mezi další běžně používaná média patří MYA (mannitol / vaječný žloutek agar) a MYP (mannitol / vaječný žloutek / polymyxin agar). Časově méně náročným postupem sloužícím k potvrzení přítomnosti B. cereus je metoda mikroskopická, která využívá barvení spor a intracelulárních lipidů. Spory se zbarví zeleně, globule lipidů černě a zbytek buňky (cytoplazma) červeně. Biochemické potvrzení je založeno na schopnosti produkovat kyselinu z glukózy, ale ne již z mannitolu, xylosy a arabinózy. Průjmový toxin může být detekován komerčně dostupným latexovým aglutinačním kitem. Přesto detekce toxinu a stanovování serotypu není obvyklou součástí rutinního potravinářského dozoru.