Rostlinné explantáty (kultury in vitro) 1. Jaroslava Dubová Ústav experimentální biologie Oddělení fyziologie a anatomie rostlin Přírodovědecká fakulta, Masarykova univerzita Cyclamen Malus Lilium Příklady kultur z katalogu firmy Duchefa Definice termínů Explantát (Bauer 1939) je každý fragment živého pletiva, celý orgán nebo soubor orgánů, který je vytržen z korelačních vztahů celku a je pěstován v umělých podmínkách. Definice termínů ex plantare = pěstovat mimo in vitro = ve skle, v umělých podmínkách aseptická kultura = bez infekce (bakterie, kvasinky, plísně) axenická kultura = kultura jednoho organismu tkáňová kultura = historický pojem, přeneseno z oblasti fyziologie živočichů houbová infekce v kultuře z katalogu firmy Duchefa kultura infikovaná kvasinkami a bakteriemi kultury infikované houbami Příklady infikovaných kultur Úrovně organizace explantátu rostlina (klíční rostlina, embryo) orgán (kořen, list, řapík, pupen) pletivo (dřeňový parenchym, endosperm, kambium - „tkáňové kultury“) buňka (mikrospory, pyl. zrna, buněčné suspenze) izolovaný protoplast kalusová kultura suspenze buněk vojtěšky rostlinné protoplasty mezofylu tabáku mikropropagace jabloně prašníková kultura tabáku Příklady různých typů kultur zkumavky, Petriho misky, Erlenmayerovy baňky, zavařovací lahve, Magenta boxy Kultivační nádoby pro kultury in vitro (sklo i plasty) média ztužená Suspenzní kultury média tekutá laboratorní třepačka laboratorní bioreaktor Systém Rita® dočasně zaplavované kultury technická modifikace pro pěstování explantátů v tekutém médiu www.vitropic.fr Rostlinné explantáty zpočátku obor rostlinné fyziologie odlišující se svou vlastní metodologií v současnosti jsou metodickou základnou rostlinných biotechnologií později četné aplikace v genetice a šlechtitelství mají využití i v molekulární biologii – jsou součástí metod množení rostlin, transformace, selekce … Využití explantátů A. Získání teoretických poznatků buněčné dělení totipotence rostlinné buňky diferenciace rostlinné buňky a pletiva metabolismus regulační mechanismy transformace a mutageneze Využití explantátů B. Praktické aplikace rychlé množení ve velkých kvantech urychlování šlechtitelských cyklů získávání vzdálených hybridů („embryo rescue“, opylení in vitro) získávání haploidů a dihaploidů ozdravování od virů umělá semena genové banky, kryoprezervace Department of Plant Production Horticulture University Horticulture, Univ. Gent Coupure links 653 653 9000 Gent Belgium Prof. Dr. Pierre Debergh Dr. Johan Van Huylenbroeck Dr. Stefaan Werbrouck http://users.ugent.be/~pdebergh/ind/content.htm Department of Botany University of Natal Pietermaritzburg Scottsville Pietermaritzburg 3209 Republic of South Africa Prof. Dr. Johannes Van Staden Dr. Jeff Finnie Dr. Anna Jäger cd-ROM bylo vytvořeno jako pomůcka pro studenty kurzů kultur rostlinných buněk a pletiv i biotechnologie. Podle autorů to není kompletní kurz, ale poskytuje hypertextové stránky s množstvím obrázků a krátkých textů.  Zajímavá adresa: Historický přehled - počátky Gottlieb Haberlandt * 1854 Altenburg považovaný za otce kultur rostlinných explantátů Kultivoval explantáty: parenchym listů dřeň stonku svěrací buňky průduchů  neznalost výživy a fytohormonů  nesterilní kultura  vysoce diferencované buňky v kultuře krátkodobé přežívání kultur přesto Haberlandt věřil v budoucnost kultur in vitro a formuloval 1902 teorii o totipotenci rostlinné buňky (Kulturversuche mit isolierten Pflanzenzellen) 1922 Knudson - výsevy orchidejí in vitro 1925 Laibach – izolovaná embrya lnu (Linum) Totipotence rostlinné buňky totipotence diferencovaných rostlinných buněk předpovězena v roce 1902 Gottliebem Haberlandtem (1854 – 1945) a v roce 1958 experimentálně potvrzena Reinertem a Stewardem somatickou embryogenezí u mrkve foto Haberlandtovy sochy na jeho pomníku v rodišti v Altenburgu americký rostlinný fyziolog P.R.White První pravé „tkáňové kultury“ První pravé „tkáňové kultury“ 1935 P.R.White - izolované kořeny rajčat produkce fytohormonů  cukry  vitamíny - B1, B6, kyselina nikotinová  glycin  meristem kořenové špičky 1939 Gautheret - kalus mrkve, Nobecourt - kalus tabáku, White - nádory tabáku Kalusové kultury Meristémové kultury 1944 - Ernest Ball - regenerace rostliny z izolovaného meristému (Lupinus) 1949 - Limmaset a Cornuet - rozdílné koncentrace virových částic v rostlinných orgánech, meristémy téměř viruprosté 1952 - Morrel a Martin - ozdravování virózních jiřin (Dahlia) meriklonové množení Suspenzní kultury 1958 - Steward, Reinert - tekuté médium, třepané kultury buněk a buněčných shluků somatická embryogeneze Po 100 letech pokusné potvrzení platnosti buněčné teorie Schleidena a Schwannaa i Haberladtovy teorie o totipotenci somatických buněk. kalusy i regenerace rostlin České začátky používání metodik rostlinných explantátů Rudolf Řetovský, Eva Petrů – AV ČR Praha Zdeněk Opatrný – AV ČR, VÚRV-Ruzyně (Výzkumný ústav rostlinné výroby), UK Praha Boris Vyskot – BFÚ AV ČR Brno František J. Novák – AV ČR Olomouc, AA Seibersdorf Jiří Vagera - AV ČR Olomouc Zdeněk Sladký – MU Brno České začátky používání metodik rostlinných explantátů 1963 Pensylvania State University 1 E. Petrů 2 H. E. Street 3 Karstens 4 I. K. Vasil 5 J. Reinert ČSAV 1956 Prof. Zdeněk Opatrný, DrSc. Jeden z prvních „rostlinných biotechnologů“ v ČR. Zastupoval ČR v evropském programu COST/ESF - výbor pro potraviny a zemědělství. Vědecky pracuje, publikuje a přednáší pro odborníky i laiky. Spolupracuje s tiskem, rozhlasem i TV. Jeden ze zakladatelů organizace Biotrin. 25 let v AV ČR 10 let VÚRV-Ruzyně nyní PřF UK Praha http://opatrny.bigbloger.lidovky.cz/ Prof. Zdeněk Sladký, DrSc. s diplomanty katedry fyziologie rostlin, 1973 2004 Foto: J. Dubová III. Dny rostlinné fyziologie VŠZ Praha-Suchdol 1983 J. Vagera UEB Olomouc Z. Sladký MU Brno O. Erdelská SAV Bratislava K. Erdelský UKom Bratislava V. Kozinka SAV Bratislava T. Murashige Z. Sladký Olomouc 1984 Foto: M. Griga F. K. Skoog objevitel kinetinu F. K. Skoog Brno 1985 Regulation of Plant Integrity Galston L. Čulafič Slovenské začátky rostlinných explantátů Karol Erdelský – UKom Bratislava Anna Preťová – SAV Nitra Eva Čellárová – UJPŠ Košice Foto: J. Dubová Aurélie Kamenická – Arboretum Mlyňany Opylení a oplození in vitro 1960 - indická škola: Kanta, Maheshwari, Rangaswami různé metody aplikace pylu na explantát 1965 - polská škola: Zenkteler 1965 - české pokusy: Tupý, Balatková (ČSAV Praha), Sladký (MU Brno) P. Maheshwari představitel indické školy experimentální embryologie 1964 prašníkové kultury a odvození haploidních rostlin (Datura) Prof.Maciej Zenkteler Katedra obecné botaniky Univerzita A. Mickiewicza Poznaň, Polsko Foto: J. Dubová experimentální embryologie, opylování in vitro Smolenice 2001 – s prof. M. Zenktelerem z exkurze na X. embryologické konferenci Nitra 2001 M. Griga Prašníkové kultury manipulace se stupněm ploidie: 1. regenerace haploidních rostlin z mikrospor nebo pylových zrn: prašníkové nebo mikrosporové kultury 2. zdvojení haploidního genomu regenerantů = dihaploidizace získání homozygotního materiálu v kratší době Rostlinné protoplasty 1970 - Takebe a Nagata - regenerace rostlinek tabáku z izolovaných protoplastů Rostlinné protoplasty P.S. Carlson Y.Y. Gleba, R. G. Butěnko D. Dudits I. Potrykus E.C. Coocking fůze protoplastů - somatická hybridizace = cybridy Transformace rostlinného genomu 1974 - důkaz integrace Ti plasmidu do rostlinného genomu 1984 - přímý přenos DNA do rostlinného protoplastu (mikro-injekce) 1986 - přímý přenos DNA do rostlinných buněk Geneticky modifikované organismy = GMO Marc van Montagu „Biotrend“ BIOTRIN je česká nezisková organizace vytvořená vědeckými pracovníky pro šíření informací o moderních biotechnologiích http://www.biotrin.cz/ informace nejen o českých biotechnologiích http://www.gate2biotech.cz/ Zajímavé webové adresy http://users.ugent.be/~pdebergh/ind/content.htm Přehledné a názorné výukové stránky http://www.liv.ac.uk/~sd21/tisscult/case_study_3.htm ukázka didaktiky rostlinných explantátů http://www.home.turbonet.com/kitchenculture/begin.htm http://www.une.edu.au/agss/hort/horticultural-science.php jednoduché postupy Doporučená literatura DROBNÍK, J. et ŠTĚPÁNKOVÁ, H. /eds./ (1997): Harmonizace pravidel práce v biologii a chemii. I. Bezpečnost biotechnologií. Series in Natural History, 6, PERES, Praha. (Skriptum UK). ONDŘEJ, M. (1985): Cytogenetika a molekulární genetika rostlin. - Academia, Praha. ONDŘEJ, M. (1992): Genové inženýrství kulturních rostlin.- Academia, Praha. Doporučená literatura GAMBORG, O. L. et PHILLIPS, G. C. (1995): Plant cell, tissue and organ culture. Fundamental methods, Springer Berlin. Heidelberg. PIERIK, R.L.M. (1987): In vitro culture of higher plants. - Martinus Nijhoff Publishers, Dordrecht, Boston, Lancaster. REINERT, J. et BAJAJ, Y.P.S./eds./ (1977 ): Applied and fundamental aspects of plant cell, tissue and organ culture.- Springer Verlag, Berlin, Heidelberg, New York. Doporučená literatura - skripta KOVÁČ, J. (1992): Explantátové kultury rostlin. Ústí n. Labem (Skriptum UJEP). VOTRUBA, M. et al. (1987): Explantátové techniky (pro biotechnology a šlechtitele).- Praha (Skriptum VŠZ Praha). ŠEBÁNEK, J. et SLADKÝ, Z. (1988): Biotechnologie rostlinných explantátů.- Brno (Skriptum VŠZ). (nyní MZLU) časopisy Plant Cell, Tissue and Organ Culture Springer Netherlands Editor-in-Chief: Schuyler S. Korban Plant Cell Reports Springer Berlin / Heidelberg Editors-in-Chief: G. Hahne; M.E. Horn Plant Growth Regulation Springer Berlin / Heidelberg Editor-in-Chief: Johannes van Staden Adresa stránek kurzu (v úpravě) Bi6120 Rostlinné explantáty http://www.sci.muni.cz/explantaty/ Od rostlinné kultury „in vitro“ k biotechnologiím J. Dubová, A. Smíšková http://svp.muni.cz/mapa-webu.php Školní vzdělávací programy MU 3. Střední školy, 3.3. Člověk a příroda, 3.3.3. Biologie