Základní podmínky kultivace in vitro Požadavky na vybavení laboratoře Bi6120 Rostlinné explantáty 2. Základní podmínky kultivace in vitro • aseptická kultura nutnost sterilizace a desinfekce • vhodná výživa explantátu živná média • vhodné fyzikální podmínky – osvětlení – teplota – koncentrace plynů – vlhkost vzduchu Sterilizace a desinfekce A. Fyzikální • mechanická a elektrostatická vzduch očkovacích boxů (laminární, 2. třída) filtrace termolabilních látek - filtry: skleněné (frity G5, S4) membránové (Seitz, Millipore, Sartorius) 0,22mm • UV záření (kultivační místnosti, boxy) • teplota suché nebo vlhké teplo Očkovací boxy laminární proudění vzduchu přes filtry: • horizontální: FATRAN (JZD Pokrok Žilina) GELAIRE (AVČR Poříčí) • vertikální: UNIFLOW (z Kolína/n. R.) AURA (v A2) Vitro Centre International, Nizozemí horizontální proudění filtrovaného vzduchu bakterie na lidskbakterie na lidskéém jazykum jazyku HEPA-filtr = „High Efficiency Particulate Air“ Očkovací box 1. bezpečnostní třída (digestoř) box nezajišťuje podmínky pro sterilní práci Očkovací box 2. bezpečnostní třída AURA – je možné pracovat i s GMO Očkovací box 3. bezpečnostní třída užití pro práci s vysoce infekčními, toxickými nebo radioaktivními materiály apod. Velikost filtrem zadržených částic < 0,1m Mechanismy zadržení částic 1. efekt síta = velké částice 2. menší částice = inertní k proudění 3. nejmenší částice = Brownův pohyb = vlákna filtru Sterilizace teplem normální tlak zvýšený tlak suché teplo 120 - 170°C sklo nástroje - horkovzdušné sušárny - kahan - sterilizační přístroj vodou chlazený plášť vlhké teplo - zavařovací hrnec - Kochův sterilační přístroj - tlakový hrnec - autokláv voda, živná média, roztoky, filtrační papír 100kPa, 121°C Sterilizace při zvýšeném tlaku vztah mezi teplotou a tlakem 30020010070kPa 143134120115°C (autokláv Chirana, PS 20) Minimální doba pro sterilizace médií v autoklávu (katalog Sigma) objem média /ml/ doba /min/ teplota /°C/ 20 – 50 20 121 50 – 500 25 121 500 – 5 000 35 121 prázdné sklo filtr. papír 30 130 Změny v médiu při autoklávování (Pierik 1987) • snižování pH o 0,3 - 0,5 • rozklad termolabilních látek • štěpení sacharózy glukóza a fruktóza • při dlouhé době precipitace solí depolymerace agaru zeatin, GA, etylén kolchicin antibiotika rostlinné extrakty Sterilizace a desinfekce B. Chemická Oxidace - látky uvolňující: a) kyslík (H2O2, Persteril) b) element. halogeny (chlorové vápno, chlornany Chloramin B, SAVO, Ajatin, Decidin) Koagulace bílkovin ionty kovů - Hg, Sn, Ag Sublimát HgCl2, Famosept SPOFA Detergencia - snížení povrch. napětí, smáčení hydrofóbních povrchů a poškození membrán (70% EtOH, Citowet, Tween, Triton-X100, Jar) Povrchová desinfekce semen Uzavření semen do epruvety nebo gázy 1. roztok: 50 ml sterilní destil. vody 1 minuta 50 ml 96% EtOH 10 ml 30% peroxidu vodíku Oplach sterilní destil. vodou 2. roztok 20% SAVO (v/v) 15 - 20 minut 3x oplach sterilní destil. vodou vždy 3 - 5 minut Výsev na Petriho misky buničitá vata, skleněné perly + voda, médium Vzorky semen na výsev – praktikum 2004 MS2002cv. Tip-TopDaucus carota5 MS MS+MTX 2004dhfr Zm-p60.1 = gen pro -glukosidasu N.t. 1-3A1-7 homozygot 4 MS MS+MTX 2004dhfr Zm-p60.1 = gen pro -glukosidasu N.t. 1-3A1-7 heterozygot 3 MS MS+MTX 2004dhfr = gen pro rezistenci na MTX N.t. M I2 MS MS+MTX 2004netransformovaná kontrolaN.t. SR11 médiumrok sklizně popisoznačeníčíslo vzorku Nicotiana tabacum L. – výsev semen kontrola SR1 na MS médiu s MTX heterozygotní 1-3AI-7 na MS médiu s MTX heterozygotní 1-3AI-7 na MS médiu bez MTX Živná média přirozená třepačky rolery bioreaktory skleněné perly můstky: papír PE,PP tekutá Agar Gelrite Heweten ztužená média umělá Kultivace v tekutém médiu – permanentní imerze polypropylenová membrána (můstek) tekuté médium podle katalogu Sigma Magenta box Kultivace v tekutém médiu – permanentní imerze • RITA® • Bio-Mint Kultivace v tekutém médiu – dočasné imerze (TIC) • RITA® • Bio-Mint Fyzikální podmínky kultivace osvětlení intenzita, vlnová délka, fotoperioda tma teplota konstantní kolísavá (den x noc) klimatizace koncentrace plynů: CO2, etylén těsnost uzavírání kultivačních nádob vlhkost vzduchu Složení živných médií • anorganické sloučeniny makroelementy: N, P, K, Ca, Mg, S mikroelementy: Fe, B, Cu, Mn, Ni, Co, I, • organické sloučeniny vitamíny: B1, B6, kys. nikotinová, kys. listová, biotin aminokyseliny: směsi (kaseinhydrolyzát, kvasničný hydrolyzát) čisté (glycin) inositol polyaminy: putrescin, spermin, spermidin... aktivní uhlí přírodní látky: kokosové mléko, rostl. šťávy… Složení živných médií - pokračování • zdroj organického uhlíku = sacharidy mono- a disacharidy (sacharóza) • růstové regulátory – auxiny – cytokininy – gibereliny – kys. abscisová • ztužování médií - agar, Gelrite, Phytagel, Makroelementy N, P, K, Ca, Mg, S • důležité jak kationty, tak anionty • živná média obsahují řádově mM koncentrace Gamborg et Phillips (1995): anorganický dusík a draslík alespoň 30mM amonné soli 2-20 mM sulfáty, fosfáty, vápník a hořčík 1-3 mM Dusík Hlavní složkou všech médií je anorganický dusík, používá se ve dvou formách: • nitráty • amonné ionty KNO3, NH4NO3, Ca(NO3)2.4H2O Dusičnany (nitráty) • transportovány xylémem do jiných částí rostliny, kde probíhá jejich asimilace • nemohou být použity k syntéze organických molekul přímo, ale musí být postupně redukovány (ve dvou krocích) - napřed na dusitany a pak až na amonné ionty • mohou být skladovány ve vakuolách buněk a plní důležitou funkci osmoregulace a rovnováhy mezi kationty a anionty Asimilace dusíku 1. krok – konverze nitrátu na nitrit nitrátreduktáza (v cytoplazmě) katalyzuje přenos e- z NADPH FAD cytochrom Fe(II / III) Mo (V/VI) NO3 -/ NO2 - 2. krok – redukce nitritu na čpavek nitritreduktáza (v plastidech) katalyzuje redukci NO2 - NH3 elektrony pro tuto redukci se získávají ve fotosystému I přenašečem je feredoxin Amonné ionty • volný čpavek nebo amonné ionty jsou pro rostliny toxické i v nízkých koncentracích (inhibice tvorby ATP) • jsou rychle převáděny na nízkomolekulární organické sloučeniny (glutamin, glutamát, asparagin, arginin, alantoin…) • skladování v kořenech rostlin a zásobních orgánech Fosfor • je přijímán jako dihydrogenfosforečnan • může být přítomen v rostlinách jako anorganický fosfát (Pi) - po vstupu do cytoplazmy je rychle esterifikován na ATP • je nezbytný pro stavbu DNA, RNA, fosfolipidů biomembrán a pro energetický metabolismus • energie uvolněná glykolýzou nebo získaná fotosyntézou nebo oxidativní fosforylací se ukládá do ATP a může být později uvolňována hydrolýzou ATP na ADP a Pi Draslík • má velkou pohyblivost - jak na buněčné úrovni, tak na dlouhé vzdálenosti ve floému a xylému. Je iontem s nejvyšší koncentrací v buňce (100 - 200 mM v cytopl.) • význam pro osmoregulaci • funguje jako protiváha při udržování optimálního pH Vápník • většinou vázán na buněčné stěny (Ca pektáty) a buněčné membrány • transport Ca 2+ floémem i z buňky do buňky je velmi omezený • Ca 2+ velmi ovlivňuje stabilitu buněčné membrány interakcí s fosfáty, karboxylovými skupinami fosfolipidů a proteinů • Ca vazebný protein kalmodulin – role v regulaci intracelulární koncentrace Ca 2+ Hořčík • velmi mobilní, schopný tvořit komplexy • esenciální pro četné enzymatické reakce • fotosyntéza, regulace pH a rovnováhu iontů • syntéza proteinů (tvoří můstek mezi podjednotkami ribozómů – při nedostatku Mg se podjednotky rozpadnou a proteosyntéza je zastavena) • energetický metabolismus Mikroelementy • bór • chlór, jód • železo • kobalt • měď • mangan • molybden • zinek používají se mikromolární koncentrace mají význam především jako kofaktory Organické sloučeniny - „vitamíny“ • B1 thiamin • B6 pyridoxin • kyselina nikotinová (biotin, kyselina listová, D, pantotenát vápenatý…) • myo-inositol - stavební jednotka inositolfosfatidů role při tvorbě a metabolismu membrán Organické sloučeniny – org. uhlík • metabolizovatelné cukry: – sacharosa – glukosa – fruktosa • nemetabolizovatelné cukry – manitol – sorbitol Organické sloučeniny - aminokyseliny • směsi – kvasničný hydrolyzát („yeast extract“) – hydrolyzát kaseinu • čisté aminokyseliny L-formy L-glycin Organické sloučeniny - polyaminy • putrescin • spermidin • spermin 1. podpora tvorby adventivních kořenů 2. podpora tvorby prýtů 3. podpora somatické embryogeneze Ztužování médií • Agar – polysacharid extrahovaný z různých druhů mořských řas (často obsahuje velké množství solí) • Karagenan – polysacharidy z ruduch, po ochlazení tvoří dvojitý helix v přítomnosti kationtů (Kappa typ tvoří gel v přítomnosti K+, Iota typ geluje v přítomnosti Ca 2+ ) • Alginát sodný – kyselé polysacharidy extrahovné z hnědých řas. Tvoří zastudena gely rozpustné vodou, geluje v přítomnosti Ca 2+ Náhrady agaru • Phytagel ® (Sigma), Gelrite® (Merck) – přírodní anionický polysacharid produkovaný bakteriální fermentací = polymer tetrasacharidu (glukosa glukuronová kyselina – glukosa - rhamnosa) • poskytuje pevný průhledný gel (vhodný pro detekci mikrobiální kontaminace) v přítomnosti Mg 2+ , Ca 2+ • používá se v poloviční koncentraci ve srovnání s agarem [D-Glc(β1→4)D-GlcA(β1→4)D-Glc(β1→4)L-Rha(α1→3)]n The Plant Tissue Culture Protocols are part of Sigma's growing offer in Plant Biotechnology. We have added helpful information in each protocol including: • Media Preparation • Media Formulation • Sterilization Techniques • Storage Sigma – Aldrich Tissue Culture Protocols http://www.sigmaaldrich.com/life-science/molecular-biology/plant- biotechnology/tissue-culture-protocols.html Sigma – Aldrich média • Chu basal salt mixture (N6) • DKW/Juglans basal salt mixture • Gamborg's B-5 basal salt mixture (B5) • Gamborg's B-5 basal salt mixture with minimal organics • Hoagland's No. 2 basal salt mixture • McCown's woody plant basal salt mixture (WPM) • Murashige and Skoog basal salt mixture (MS) • Quoirin and Lepoivre basal salt mixture • Schenk and Hildebrandt basal salt mixture (SH) • White's basal salt mixture http://www.sigmaaldrich.com/life-science/molecular-biology/plant- biotechnology/tissue-culture-protocols/classic-plant-media.html Antibiotics Murashige and Skoog Media Variations Classic Plant Media Orchid Culture Media Explant Sterilization Plant Pathology Media Gelling Agents Phycology and Aquatic Plant Media Growth Regulators Silver Thiosulfate Solution Iron Chelate Solution Sunbag Vessels Media Preparation Vitamin Mixtures Media Sterilization Sigma – Aldrich Tissue Culture Protocols http://www.sigmaaldrich.com/life-science/molecular-biology/plant- biotechnology/tissue-culture-protocols.html Příprava živného média (1 l) 1. 5,5 g agaru vsypeme do 300 ml destilované vody v SIMAX láhvi a rozvaříme v autoklávu. 2. Do Erlenmeyerovy baňky odměříme 500 ml destilované vody. 3. Přidáme koncentráty makroelementů (100 ml), mikroelementů (10ml) a chelát železa (5 ml). 4. Přidáme vitamíny (1 ml zamražené směsi). 5. Navážíme 100 mg inositolu. 6. Navážíme 20 g sacharózy. Příprava živného média (1 l) 7. Podle potřeby doplníme další látky jako aktivní uhlí, růstové regulátory a pod. 8. Slijeme rozvařený agar s roztokem v EM baňce a doplníme v odměrném válci na 1000 ml. 9. Pomocí Phan papírků změříme pH a upravíme na 5,7 pomocí 0,1 M KOH nebo 0,1 M HCl. 10. Médium dobře promícháme přeléváním z válce do EM baňky a rozlijeme asi po 40 ml do kultivačních nádob. nebo Příprava živného média (1 l) 1. 5,5 g agaru vsypeme do 300 ml destilované vody v SIMAX láhvi a rozvaříme v autoklávu. 2. Do Erlenmeyerovy baňky odměříme 500 ml destilované vody. 3. Přidáme koncentráty makroelementů (100 ml), mikroelementů (10ml) a chelát železa (5 ml). 4. Přidáme vitamíny (1 ml zamražené směsi). 5. Navážíme 100 mg inositolu. 6. Navážíme 20 g sacharosy. navážíme 4,4 g směsi MS média s vitamíny podle Gamborga Příprava živného média (1 l) 11. Kultivační nádoby s médiem uzavřeme vhodným uzávěrem 12. Následující den sterilizujeme při 121°C v autoklávu po dobu 20 minut 13. Krátkodobě média uchováváme při laboratorní teplotě, při skladování po delší dobu používáme lednici při kultivaci v Petriho miskách rozléváme sterilně v očkovacím boxu médium až po sterilizaci