Transformace rostlin úvod metody Biotechnologie - přístup k přírodě biotechnologie - metoda využívající organismy ve prospěch člověka a současně pozměňuje jejich vlastnosti tak, aby byly co nejlépe využitelné. q kvašení - snahy konzervovat rychle se kazící potraviny a krmiva • kvašení mléka - sýry, kefír, kumys, jogurty • víno, pivo - bible, Egypt • boza - kvašené proso (Balkán, Orient) • saké - japonský nápoj z kvašené rýže • pombe - africký nápoj z kvašeného tropického ovoce • kvašené zelí • siláže q výroba enzymů - praní, příprava ovocných šťáv, výroba škrobu… q farmaceutický průmysl – sekundární metabolity rostlin q bioremediace - biologické čištění vody, ropné produkty v půdě, toxické kovy... Definice podle protokolu o biodiverzitě  LMO = living modified organism organismus se změněnou genetickou informací, kterou je schopen předávat do další generace (polyploidizace, konjugace, transdukce)  GMO = genetically modified organism získaný zavedením cizorodé DNA (metody rekombinantní DNA) genové nebo genetické inženýrství „Klasické“ a „moderní“ biotechnologie klasické šlechtění LMO přirozené mutace a jejich křížení indukované mutace ozařování UV nebo ionizující záření chemomutageneze vysoké výtěžky antibiotik, produkce enzymů, sladovnický ječmen Nevýhoda = metody jsou „slepé“ = vyvolává se poškození a následně se čeká, zda náhodou nevznikne výhodná změna. Navíc nevíme, kolik genů se změnilo a jak. Příklady odrůd rostlin odvozených mutačním šlechtěním plodina jméno kultivaru metoda použitá k mutaci rýže Calrose 76 paprsky gama pšenice Above azid sodný Lewis neutrony oves Alamo-X X-paprsky grapefruit Rio Red neutrony Star Ruby neutrony Cynodon dactylon Tifeagle paprsky gama Tifgreen II paprsky gama Tift 94 paprsky gama Tifway II paprsky gama salát Ice Cube ethyl methansulfonát Mini-Green ethyl methansulfonát fazol Seafarer X-rays Seaway X-rays šeřík Prairie Petite neutrony Stenotaphrum secundatum TXSA 8202 paprsky gama TXSA 8212 paprsky gama „Klasické“ a „moderní“ biotechnologie  moderní biotechnologie - umožňují cílený postup - vnášení pouze žádaného genu beze změny ostatních genů GMO  je možný přesun vlastností mezi organismy, které se jinak nemohou ani potkat  mohou ale existovat i nechtěné následky požadavek regulace a správného zacházení s GMO Cíle moderních biotechnologií  zvýšení výnosů plodin, produkce dobytka i ryb  zvýšení nutriční hodnoty, snížení ztrát produkce  zlepšení chuti, kvality a trvanlivosti potravin  omezení používání pesticidů a chemických látek (hnojiva, postřiky)  získat organismy přežívající za stresových podmínek  získat obnovitelné a ekologické zdroje pro výrobu  produkovat léčiva + vakcíny ekonomicky a bezpečně  vyvinout nové způsoby čištění vod a půd  připravit enzymy nových vlastností - snížení energetické náročnosti výroby a ekologických rizik Charakteristika genů gen kódující sekvence (+ repetitivní DNA) regulační část kódující úseky = exony nekódující úseky = introny promotor zaváděcí sekvence terminační sekvence Promotor sekvence DNA - schopnost vázat RNA-polymerázu = zahajovat přepis genu TATA box počátek transkripce enhancery /rozpoznávací elementy sekvence promotoru se netranskribuje, ale rozhoduje o tom kdy, kde a s jakou intenzitou se bude gen transkribovat Ondřej 1992 Zaváděcí sekvence počáteční úsek mRNA, na níž se uchycují ribozómy a postupují „naprázdno“ až k prvnímu iniciačnímu kodonu rozhoduje o stupni afinity ribozómů, tedy o intenzitě translace Počátek translace první triplet ATG, rozhoduje o účinnosti translace Exony a introny počátek a konec intronu GT-AC Polyadenylační a terminační signál AATAAA Ondřej 1992 Obecné schéma transformace  příprava rekombinantní DNA (konstrukt)  vnesení DNA do rostlinné buňky (přímo nebo pomocí vektorů)  test exprese vnesených genů  demonstrace stabilní integrace DNA do rostlinného genomu Metody transformace (vnášení DNA) přímé nepřímé - pomocí vektorů lipozómy uzavírající DNA elektroporace mikroinjekce DNA do jádra bombardování mikroprojektily vakuová infiltrace s použitím nanovláken Agrobacterium (plazmidy) rostlinné viry modifikovaný bakteriofág λ plazmidy intermediární binární Transformace zprostředkovaná liposomy protoplast liposom + DNA 1. 2. fúze membrán protoplastu a liposomu Elektroporace vyžaduje použití protoplastů po aplikaci el.pulsu se vytvoří dočasné póry v membránách, které umožní průniku DNA BioRad Laboratories různé typy pulsů Mikroinjekce DNA do jádra použito u protoplastů rostlin, ale častější u živočichů Biolistické metody BioRad Laboratories Biolistické metody krystal W s DNA regenerace rezistentních rostlin T0 Agrobacterium tumefaciens, A. rhizogenes Půdní bakterie: Pseudomonas, Corynebacterium Agrobacterium, Rhizobium Agrobacterium tumefaciens Agrobacterium rhizogenes nádory kořínky Ti plasmid Ri plasmid T-DNA T-DNA Ti plasmidu (WT) 1. geny pro biosyntézu auxinů (iaaM, iaaH) a cytokininů (ipt) = dediferenciace buněk a vznik nádorů („crown gall“) 2. geny pro syntézu nádorově specifických látek, tzv. opinů (bazické aminokyseliny - oktopin, nopalin, manopin) = zdroj dusíku, uhlíku a energie pro bakterie odzbrojené vektory Agrobacterium tumefaciens „Crown gall“ vytvořený po infekci Agrobacterium tumefaciens Agrobacterium rhizogenes indukce tvorby kořenů na segmentu kořene mrkve Mechanismus přenosu T-DNA intermediární vektor Vir AVir A Vir G* Vir G fenolické látky vir B B B B B B B B B B B B E E E E E E VirD1 VirD2 VirD2 E E E E E E E E VirD2 VirD2Vir E protein Vir B protein T-komplex Ti plasmid E E E E E E E E VirD2 Jádro T-DNA Agrobacterium tumefaciensAgrobacterium tumefaciens upravený binární vektor LhGR vir LhGR T-DNA KmR vir RifR KmR pBin+ GntR DNA agrobakteria část plazmidu kódující virulenci upravený plasmid s vloženým genem Šámalová 2005 Postup transformace - disková metoda 1. příprava kultury agrobakteria - křížový roztěr na LB médium s antibiotiky + agar 2. příprava listových segmentů - předkultivace na MSH - s auxinem a cytokininem + agar (2 - 3 dny v kultiv. místnosti) 3. příprava suspenze agrobaktéria pro kokultivaci (LB médium) 4. kokultivace listových segmentů v suspenzi - 1 min. 5. osušení segmentů a přenos na povrch MSS média svrchní stranou dolů 6. pravidelná pasáž na médium MSSa ( s antibiotiky) regenerace kalusů a rostlinek 7. indukce zakořeňování regenerovaných prýtů MSRa Agrobacterium - média pro kultivaci LK médium (Langley et Kado) sacharóza 10 g kaseinhydrolyzát 8 g kvasničný extrakt 4 g KH2PO4 2 g MgSO4 0,3 g destil. H2O do 1000 ml agar 13 g LB BROTH High Salt (DUCHEFA) 25 g do 1000 ml destil. H2O složení: trypton 10 g (kaseinhydrolyzát) kvasničný extrakt 5 g NaCl 10 g agar 15 g Transformace Arabidopsis vakuovou infiltrací Sarah J. Liljegren a Martin F. Yanofsky Dept of Biology, Center for Molecular Genetics, University of California at San Diego, La Jolla, CA 92093-0116, USA Selekční a signální markery 1. rezistence vůči antibiotikům kanamycin hygromycin gentamycin 4. GFP („green fluorescent protein“ gen z medůzy Aequorea victoria) cytostatikům (antimetabolika) herbicidům methotrexát 3. luc luciferáza (z mořského planktonu Photinus pyralis, katalyzuje ATP dependentní oxidativní dekarboxylaci substrátu = luciferin za produkce světelné emise 562 nm) 2. iudA glukuronidáza – GUS (z E. coli ) glyfosát Transgeny pro toleranci k herbicidům l výhody – možnost použít až postemergentně l jsou biodegradovatelné l mechanismus účinku q do rostliny je vnesen gen kódující enzym necitlivý k herbicidu q transgen přímo herbicid rozkládá l nevýhody q vznik herbicid rezistentních plevelů l do média pro selekci transgenních organismů se přidává methotrexát sterilně (0,5 g/l) až po vysterilizování média l transgenní rostliny mají vložený gen pro dihydrofolát reduktázu (DHFR) z myší, která není citlivá na methotrexát Využití methotrexátu pro selekci transgenních organismů kontrola bez myší DHFR na MS médiu s MTX heterozygotní transgenní tabák na MS médiu heterozygotní transgenní tabák na MS médiu s MTX apex karafiátu substrát = 5-Br-4-Cl-3-indolyl-β-Dglukuronid (X-gluc) Indigogenní metoda detekce glukuronidázy Arabidopsis Princip indigogenní metody: detekce aktivity glukosidázy Transformované rostlinky kasavy z embryogenní kultury, signální gen = luciferáza rostlinky vizualizace luciferázy- postříkáno luciferinem a měřeno luminometrem Osamu Shimomura – objevitel GFP http://www.conncoll.edu/ccacad/zimmer/GFP-ww/shimomura.html 2008 Nobelova cena za chemii (Osamu Shimomura, Marty Chalfie a Roger Tsien) Modifikace GFP Roger Tsien První povolená transgenní plodina Rajče Flavr-Savr schváleno v USA v roce 1994 obrácená orientace genu pro enzym polygalakturonasu, která normálně degraduje pektin v buněčných stěnách a vede k měknutí plodů od jeho pěstování se již upustilo 2010 - v Indii se vrací k tématu - využili RNA interference, aby potlačili u zrajícího ovoce tvorbu alfa-mannosidázy a beta-D-N acetylhexosaminidázy, které mají „na svědomí“ dozrávání: možné použití také u banánů, papáji, manga a dalšího ovoce ke snížení posklizňových ztrát. Herbicid tolerantní plodiny l transgenní plodiny tolerující nespecifické herbicidy (HTP) l jejich použití je z hlediska ochrany rostlin složitější umožňují získat prakticky čistou monokulturu = kritika z hlediska biologické rozmanitosti l rizikem je vznik plevelů tolerujících herbicid podobně jako transgenní plodina - mohou vznikat jak přirozenými mutacemi, tak přímým přenosem transgenu podmiňujícího necitlivost (v případě křížitelnosti a vzniku plodného potomstva) – u nás je rizikem řepka. l zprávy z USA a Argentiny o plevelech necitlivých na glyfosát, což se klade za vinu pěstování RR sóji (Roundup Ready) vyvolávající potřebu opakované aplikace glyfosátu Bt-plodiny l kukuřice MON 810 - se pěstuje od roku 2005 je odolná vůči zavíječi kukuřičnému zavíječ kukuřičný - Ostrinia nubilalis je jedním z nejvýznamnějších škůdců kukuřice, který snižuje výnosy a kvalitu zrna u poškozených obilek se navíc zvyšuje obsah afaltoxinů zároveň také zvyšuje lámavost stébel, což znamená sklizňové ztráty produkují δ-toxin z Bacillus thuringiensis Danaus plexippus, danao stěhovavý „Monarch“ imago a housenka http://www.kidzone.ws/animals/monarch_butterfly.htm Amflora – GM brambor l Ludwigshafen, Německo - 2. březen 2010 – Evropská komise povolila Amfloru, geneticky modifikovanou bramboru BASF s optimalizovaným obsahem škrobu, pro komerční použití v Evropě l Žádost o schválení Amflory byla ve Švédsku podána v roce 1996. l Odrůda této brambory tak může být nyní používána pro výrobu průmyslového škrobu. l Evropská agentura pro bezpečnost potravin (EFSA) při několika příležitostech v průběhu schvalovacího procesu opakovaně zdůraznila bezpečnost Amflory pro lidi, zvířata a životní prostředí. Zlatá rýže nese geny pro tvorbu β-karotenu lykopenu (provitamin A) pod kontrolou endosperm-specifického promotoru pěstování zlaté rýže má ohromný význam pro zlepšení výživy, především u obyvatel Asie Ingo Potrykus psy (phytoene synthase) z narcisu Narcissus pseudonarcissus crtI z půdní bakterie Erwinia uredovora bakteriální gen funguje jako katalyzátor dokončení biosyntézy lykopenu http://en.wikipedia.org/wiki/Golden_rice Doporučené adresy BIOTRIN je nezisková organizace vytvořená vědeckými pracovníky pro šíření informací o moderních biotechnologiích. http://www.biotrin.cz/ vydávají internetový bulletin SVĚT BIOTECHNOLOGIÍ, Bílá kniha Gate2Biotech – vše o českých biotechnologiích na jednom místě: http://www.gate2biotech.cz/ prezentace o transformaci http://www.life.umd.edu/classroom/BSCI411/Liu/lecture11.pdf postřehy z pěstování transgenních plodin: http://www.gate2biotech.cz/postrehy-z-prvnich-sedmnacti-let- pestovani-transgennich-plodin/ hebicid glyfosát a rezistence: http://en.wikipedia.org/wiki/Glyphosate Postřehy z prvních sedmnácti let pěstování transgenních plodin Dr. Jaroslav Salava, VÚRV, v.v.i. Praha - Ruzyně v roce 2012 byl zaznamenán 100 násobný nárůst ploch pěstování GM plodin: q 1996 (v roce, kdy byly uvedeny na trh) 1,7 miliónu ha q 2012 170 miliónů ha přijímání transgenních plodin je známkou toho, že jsou pro farmáře užitečné nevýhodou je vznik rezistentních plevelů i škůdců http://www.gate2biotech.cz/postrehy-z-prvnich-sedmnacti- let-pestovani-transgennich-plodin/ Klasifikace antibiotik podle účinnosti  inhibitory syntézy bakteriální buněčné stěny  antibiotika ovlivňující permeabilitu membrán  bakteriostatické inhibitory syntézy proteinů  baktericidní inhibitory syntézy proteinů využívají se jako selekční markery 1. Inhibitory syntézy bakteriální buněčné stěny β-laktamová antibiotika peptidoglykan = vysoce zesíťovaná molekula, která zabraňuje plazmoptýze plazmatické membrány bakterie v hypotonickém prostředí inhibice syntézy bakteriální buněčné stěny způsobí její rozštěpení odkrytí plazmatické membrány vede k plazmoptýze bakteriálních buněk β-laktamáza štěpí strukturu antibiotika = vede k inaktivaci Stadia tvorby bakteriální buněčné stěny I. biosyntéza základních stavebních jednotek - uvnitř buňky Cykloserin inhibuje jejich dokončení II. přenos stavebních jednotek vně membrány a jejich kovalentní vazba na již existující buněčnou stěnu inhibuje Vancomycin a Bacitracin III. zesíťování peptidoglykanových polymerů do pevného skeletu inhibují peniciliny a cephalosporiny Peniciliny Amoxycilin Amoxycilin-klavunalát K Ampicilin Carbenicilin Penicilin G Penicilin V Ticarcilin-klavunalát K Cephalosporiny Cefalexin Cefotaxim Kyselina klavunolová = specifický inhibitor β-laktamázy 2. Antibiotika ovlivňující permeabilitu membrány antibakteriální antifungální Gramicidin Polymixin B Amphotericin Nystatin 3. Bakteriostatické inhibitory proteosyntézy reversibilní inhibice: Chloramfenikol Doxycyklin Erythromycin Tetracyklin Oxyteracyklin 4. Baktericidní inhibitory proteosyntézy aminoglykosidy: Gentamycin Hygromycin B Kanamycin Neomycin Streptomycin inhibitory metabolismu NK: Rifampicin kyselina nalidixová antimetabolity: Methotrexat Nitrofurantoin analogy NK: 5-florouracil