uchovaní genetických zdroju
12.
definice, metody, použití
Jaroslava Dubová
rvír
I    *JL
EVROPSKÁ UNIE
MINISTERSTVO ŠKOLSTVÍ, OPVidělÉváni MLÁDEŽE A TĚLOVÝCHOVY     pra koitkumncwchopiHnt
m
INVESTICE DO ROZVOJE VZDELÁVANÍ
Tato prezentace je spolufinancována Evropským sociálním fondem a státním rozpočtem České republiky
Uchovaní genetických zdroju
ztráta genetických zdroju je nenahraditelná
uchováváme:
• původní rostlinné druhy - výskyt v přirozených ekosystémech - jejich ohrožení je určeno podle míry ohrožení těchto ekosystému
vyšlechtěné kultivary - udržovací šlechtění je pracné a nákladné
Uchovaní genetických zdroju
uchovaní semen = nej běžnější a nejstarši metoda
uchování vegetativních orgánu - hlízy, kořeny,
cibule, řízky (rizika akumulace viru a jiných patogenu)
Uchovaní genetických zdroju:
A. semena
uchování semen klasicky = pri normální teplotě (max. 1 - 5 let)
semenné banky = uchovaní semen na delší dobu ( při - 20°C)
ortodoxní semena - přežívají snížení obsahu vody na 5-10%
rekalcitrantní semena - dehydratace nesmí klesnout pod limit 12 -30%^ ' ^> nelze skladovat pod 0°C, tropické druhy pod 10 C
(kávovník, kakaovník, kokosová palma, kaučukovník, z našich: dub, buk, jírovec, kaštanovník)
Semenná banka na Špicberkách
Uchovaní genetických zdroju: B.   vegetativní orgány
uchovávání vegetativních orgánu
(hlízy, kořeny, cibule, řízky)
rizika:
• choroby (houbové, virózy)
• škůdci
• nepříznivé podmínky (teplota, vlhkost...)
• pracné a nákladné (prostory, manipulace)
Genové banky in vitro
• uchování aktivně rostoucích kultur
• uchování kultur v minimálním růstu
• kryoprezervace
Uchovaní aktivně rostoucích kultur
- pracné - pasáže: dny, týdny, měsíc
- nákladné (energie, prostory)
- nebezpečí infekce
- nebezpečí somaklonální variability představují paralelu ke klasické polní bance
hledaly se podmínky pro prodloužení subkultivačního intervalu
Uchovaní kultur v minimálním růstu
• metody založené na kultivaci při snížené teplotě rostliny z mírného pásma:       20 - 25°C 4 - 10°C
rostliny z tropu:
25 - 30°C
15 - 20°C
• metody založené na modifikaci složení kultivačního média - snížení koncentrace solí (MS1/2 - MS1/4), přídavek osmotika - 37© manitol, 57© sacharóza, ABA
• metody založené na modifikaci plynného složení atmosféry v kultivačních nádobách
Uchovaní kultur v minimálním růstu
Výhody:
možnost vizuální kontroly
testování na patogeny - možnost mezinárodní výměny
menší nároky na prostor (2m2 x 1 ha) Problémy:
stres muže mít vliv na regenerační schopnost
muže být ovlivněna genetická stabilita - nutnost kontrol
(kritéria morfologická, cytologická, biochemická, molekulárně-biologická = DNA)
So lanům, Medicago, Fragaria, Prunus, Malus, Beta
Definice kryoprezervace
uchování materiálu při nízkých teplotách, nejčastěji v tekutém dusíku (-196°C) (P. Ďebergh)
• neletální skladování pletiv nebo tkání při ultra-nízkých teplotách (E. E. Benson)
uchovaní rostlinného materiálu po delší dobu za účelem
■ minimalizace růstu a vývoje in vitro
■ uchování životaschopnosti a genetické stability
■ zachování plného vývojového a funkčního potenciálu
■ šetření pracnosti a nákladu
Mechanismy kryo-poškození
tvorba ledu
■ extracelulární - začíná dříve
■ intracelulární (nukleace) - velké ledové krystaly poškozují struktury organel = snaha o zmenšení velikosti krystalu ledu
vlivy poškození různými roztoky
Přístupy ke kryoprezervaci
tradiční = aplikace chemických kryoprotektiv a kontrolované, pomalé zmrazování
0,5 - 1°C/ min
(vyžaduje speciální přístroje)
novější = rychlé zmrazování vitrifikace
enkapsu I ace/de hydr atace
(relativně dostupnější)
Možnosti kryoprotekce rostlinného materiálu
penetrující - ovlivňují biochemické a strukturální
vlastnosti membrán a tak zvyšují toleranci k mrazu (ĎMSO, glycerol, prolin)
nepenetrující - mají vliv většinou jako osmoticky dehydratační (sacharóza, manitol, sorbitol)
Krátkodobé skladovaní dospělých řízku révy
Viti s vi ni fera
• odebírání řízku v zimě
• skladování při -3°C = řízky rašily až po 1,5 roce
• hodnocení tolerance kryoexpozice meristémů vybraných linií z axenických kultur
• vývoj metod pro dlouhodobé uchování genetických zdrojů révy
http://www.ars-grin.gov/ncgrp/pi_research_extra_projects.htm#grapepres
Pomalé kontrolované zmrazovaní
• aplikace chemických kryoprotektiv
* postupné kontrolované ochlazování pod bod mrazu (-30 až -60°C), pak vložení do tekutého dusíku
- pomalé ochlazování zvyšuje dehydrataci buněk, což snižuje bod mrznutí
- po zkoncentrování buněčných roztoku pomalým ochlazováním muže být zbývající voda
vitrif ikována rychlým zmrazením
• zpětné rozmrazování má být co nejrychlejší
Přístroj KryolO pro klasickou kryoprezervaci
Průběh zmrazování vzorku kalusu
T/°C/
-28
netěsnosti ventilu
při napouštění N2
t/min/
60
teplota uvnitř ampule
,.UL,.
teplota uvnitř chlazeného prostoru
70
T
ampule do N2
proces velmi rychlého zmrazení, při kterém je zabráněno tvorbě ledových krystalu, protože vodný roztok je příliš koncentrovaný - zabránění nukleace ledových krystalu
voda tuhne do tzv. sklovitého amorfního tvaru
negativně muže působit na životaschopnost materiálu vysoká koncentrace kryoprotektiv, která je nutná pro navození vitrif ikace
vitrif ikace = nestabilní stav - muže vést k tvorbě krystalů při zahřívání
Postup: „Enkapsulace / dehydratace"
kultura prýtu
otužení materiálu - zvýšená osmotická hodnota média, snížená
teplota kultivace
izolace meristému enkapsulace: přenos do 3% alginátu nasátí alginátu s meristémem do špičky pipety nakapání alginátu do 0,1 M roztoku CaC\2 polymerace alginátu 30 min.
dehydratace: osmotická (0,75M sacharóza) 1-5 dní osušení ve sterilním vzduchu f low-boxu 1-4 hod přenos vysušených kuliček do kryozkumavky rychlé zmražení - vhození do N2
Alginátové perly s vyrůstajícími prýty brambor -1        (Solanum tuberosum) z enkapsulovaných 1 meristémů		
		
Příklady
využití kryoprezervace meristému
Německá sbírka mikroorganismu a buněčných kultur (ĎSMZ, Braunschweig, Německo) - meristémy 519 starých kultivaru brambor - metoda mrazení perel
International Potato Centre (CIP, Lima, Peru) - 345 kultivaru brambor - vitrifikace
K.U. Leuven, Belgie - 306 kultivaru banánu (1/4 ze světového počtu kultivaru) - vitrif ikace
kasava, česnek, máta a australské ohrožené druhy
Používaní metody kryoprezervace v Kew
Príklady odkazu
http: //scieng. abertay. ac. uk/plant/genebanking. htm http: //www. ars. usda. gov/Main/docs. htm?doc id=8100 http: //www. ars -grin. gov/ncgrp/volk_lab. htm
http: //www. kcw. org/kshccts/pdf s/K3 l_cryopreservation. pdf
historie semenné banky na Sval bardu:
http://www.regjeringen.no/en/dep/lmd/campain/svalba rd-global-seed-vault/history.html?id=489075